精胺氧化酶-DOX结合物通过诱导羰基应激重塑肿瘤微环境，从而增强膀胱癌的化疗效果

《Materials Today Advances》：Spermine Oxidase-DOX Conjugates Reshape Tumor Microenvironment via Carbonyl Stress to Potentiate Bladder Cancer Chemotherapy

　　徐英英|赵成阳|傅帅|吴耀海|邵英昭|李东晨|王英文|张玲昌|张爱静|孟玉香|赵中伟|李家琪|赵张|耿慧敏|于能旺

山东大学齐鲁医院泌尿科，齐鲁医学院，山东大学生物医学工程学院，济南，250012，中国

**摘要**
肿瘤的抗氧化防御机制限制了标准治疗方法的有效性，导致治疗效果不佳和全身耐受性增加。传统的氧化还原干扰策略旨在产生活性氧（ROS），但这些策略受到单一代际方法的限制，并且活性氧会被迅速清除。本文报道了一种创新策略，利用精胺氧化酶（SMOX）催化内源性且具有高度细胞毒性的丙烯醛的生成，从而创建一种破坏性的羰基应激微环境，以增强抗肿瘤药物的效果。例如，将SMOX与多柔比星（DOX）结合并共同封装在介孔二氧化硅纳米颗粒中，形成了一个集成的递送平台（PMD）。体外和体内的实验结果表明，PMD通过局部诱导羰基应激和氧化损伤，使膀胱和皮下肿瘤细胞对DOX敏感，从而减少了化疗药物的剂量。其潜在机制包括通过GAPDH结合上调P53来增强ACR介导的线粒体功能障碍和脂质过氧化，以及通过抑制糖酵解酶和Ras来抑制Warburg效应。重要的是，这种治疗效应无论是通过局部灌洗还是全身给药都能实现，这突显了该平台在膀胱癌和其他恶性肿瘤中的转化潜力。

**1. 引言**
与正常组织不同，肿瘤微环境（TME）由于高度异质性和动态性而具有显著的“氧化还原失衡”[1]。升高的活性氧（ROS）水平在肿瘤细胞中充当关键信号分子，支持多种恶性肿瘤特征，如增殖、应激下的存活和适应缺氧状态，同时促进侵袭、转移以及基因组不稳定性的维持[2]、[3]、[4]。为了对抗由此产生的氧化应激和防止细胞损伤，肿瘤 paradoxically 加强了其抗氧化防御系统。这种适应包括上调非酶系统（如谷胱甘肽（GSH）和NADPH）以及酶系统（如Nrf2和超氧化物歧化酶（SOD）[5]、[6]。这种增强的氧化还原平衡不仅与癌症的发生和发展有关，同时也对临床治疗构成了障碍[7]。许多一线干预措施，包括化疗、放疗和免疫疗法，都依赖于破坏这种微妙的氧化还原平衡来诱导细胞死亡[8]、[9]、[10]、[11]。然而，TME强大的抗氧化屏障常常中和这些治疗伤害，导致治疗效果有限和全身耐受性增加[12]、[13]。因此，靶向这种细胞内氧化还原平衡成为提高治疗敏感性的关键策略。

大量的研究致力于重塑TME的氧化还原环境以克服治疗抵抗性，策略包括利用纳米递送系统增加肿瘤内药物积累[14]，以及通过过氧化氢（H2O2）前体药物[15]、GSH耗竭[16]或促氧化剂[16]、[17]、[18]、[19]直接干扰肿瘤的氧化还原平衡。尽管这些方法具有前景，但它们的临床应用仍受到复杂合成和功能模块化有限的限制[20]、[21]。此外，由于ROS本身半衰期短且空间扩散受限，加上有效的内源性清除作用，依赖单一ROS生成方式的干预措施往往效果有限[12]、[22]。越来越多的证据表明，多胺（PA）代谢在癌症中经常失调，肿瘤细胞的增殖和存活高度依赖于升高的PA水平[23]、[24]、[25]。幸运的是，PA可以被血浆胺氧化酶催化生成大量的H2O2和高度反应性的丙烯醛（ACR），这是一种常见的活性羰基物种（RCS）。ACR通过亲电加成反应诱导羰基应激，导致DNA损伤并抑制谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和DNA修复蛋白，这正是氧化损伤疗法的缺陷[26]、[27]。在我们之前的研究中，我们还发现PA诱导的ACR积累比ROS更具细胞毒性，并通过这一途径加剧氧化损伤[28]、[29]。因此，ACR更有助于在肿瘤微环境中创造稳定的氧化应激环境，但利用羰基应激来维持化疗效果的研究却很少。

在此，为了解决氧化损伤疗法的局限性，我们旨在建立一个富含羰基应激的肿瘤微环境。首先，我们证明ACR的细胞毒性远强于甲醛（Met）。鉴于ACR的高反应性使其无法直接给药，我们利用内源性的精胺氧化酶（SMOX）催化从精胺生成ACR，从而为抗肿瘤药物创造一个易受攻击的氧化还原环境。我们将SMOX与多柔比星（DOX）结合，并将其共同封装在介孔二氧化硅纳米颗粒中，形成集成递送平台（PMD），用于体内治疗皮下或原位膀胱癌（BC）。PMD显著增加了羰基的积累，并通过多种方式破坏细胞内的氧化还原平衡（图1）。值得注意的是，该药物递送系统利用肿瘤自身的精胺来诱导ACR羰基应激，从而增强氧化损伤并减少化疗药物的剂量。PMD递送系统在局部和全身治疗中均表现出优异的抗肿瘤效果，通过耗尽GSH并引起脂质过氧化（LPO）。此外，其ACR成分与GAPDH结合，诱导核转位，进而促进细胞凋亡并抑制糖酵解相关酶。这种综合机制在多种肿瘤细胞类型中显示出广泛的效力。

**2. 结果与讨论**
**2.1. ACR和甲醛对BC细胞的致死效应**
醛类容易与大分子（尤其是蛋白质和核酸）形成加合物，导致细胞凋亡[30]、[31]。作为细胞中最常见的活性醛类，ACR和甲醛被用来评估羰基应激的特异性。MTT实验显示，ACR对SW780和T24细胞具有强烈的细胞毒性，ACR的IC50仅为甲醛的十分之一（图S1A、B、E）。由于醛类在体内容易被GSH清除[32]，我们进一步研究了它们对细胞内GSH水平的影响。流式细胞术分析显示，50 μM的ACR显著耗尽了BC细胞内的GSH，而相同浓度的甲醛仅消耗很少（图1A、B）。GSH/GPX4轴是维持氧化还原平衡的关键细胞抗氧化防御系统[33]。我们观察到ACR比甲醛更显著地减少了GPX4蛋白的表达（图1C、E）。由于GPX4是铁死亡的关键调节因子[34]，我们进一步检测了铁蛋白-1（Fer-1）的表达，发现ACR处理后其表达下调（图1D、F）。这些结果表明，ACR通过耗尽GSH并抑制相关蛋白来诱导铁死亡。铁死亡是已知的线粒体功能障碍的促成因素[35]，我们进一步比较了ACR和甲醛对线粒体的影响，发现ACR在24小时内改变了线粒体形态（图1G、H）。此外，ACR在上调促凋亡蛋白BAX的同时下调了抗凋亡蛋白Bcl-2（图1I-L）。流式细胞术分析显示，ACR增加了G1期细胞的比例（图1M）。这些结果表明，ACR通过多种协同机制诱导细胞死亡，包括GSH耗尽、铁死亡促进、线粒体破坏和凋亡诱导，其效果优于甲醛（图1N），支持其在BC治疗中的应用前景。

**2.2. ACR和多柔比星联合应用于BC治疗**
多柔比星是常用的BC治疗药物，具有多种机制，包括DNA损伤、活性氧生成、凋亡甚至铁死亡[37]、[38]。为了验证ACR诱导的羰基应激是否能增强多柔比星的治疗效果，我们进行了ACR和多柔比星的联合治疗实验（称为AD）。多柔比星对SW780细胞和T24细胞的IC50值分别为2.00 ± 0.18 μM和2.47 ± 0.16 μM。当多柔比星与20 μM的ACR联合应用于BC细胞时，多柔比星的IC50值降低了10倍（图S1C–E）。多柔比星和ACR在SW780细胞和T24细胞上的联合效应指数分别为0.58和0.60，表明两者具有协同作用。接下来，我们研究了ACR和多柔比星对氧化损伤的联合效应。Bodipy染色显示，ACR和多柔比星均略微诱导了活性氧的生成，但联合应用显著增加了活性氧的含量（图2A、B）。流式细胞术中的DCFH荧光强度分析也证实了这一结果（图2C、D）。

**2.3. PMD递送系统的制备和表征**
为了实现SMOX和多柔比药的共同递送，如图3A所示，通过醛酸（称为SD）和Schiff碱键将SMOX和多柔比星连接起来。紫外-可见光吸收光谱显示，SMOX-DOX结合物在摩尔比为1:1、1:5、1:10时，在约280纳米（SMOX的特征峰）和约480纳米（DOX的特征峰）处表现出显著的吸收增强（图3B），证实了结合反应的成功。随后，SMOX-DOX结合物被包载到介孔硅纳米颗粒（MSN）中，形成了PMD。尽管PMD1:10的半数有效浓度（IC50）为1.74 ± 0.32 μg/mL，低于PMD1:5的1.99 ± 0.13 μg/mL和PMD1:1的3.41 ± 0.33 μg/mL，但在细胞毒性方面没有统计学上的显著优势，因此选择了PMD1:5进行后续实验（图S2A和B）。SMOX被封装到MSN中（称为SM）。SM和PMD的平均粒径分别为约105.45纳米和约110.65纳米，它们的ζ电位分别为–10.65 mV和–15.65 mV（图3C-E，图S2C）。透射电子显微镜（TEM）图像显示PMD具有约110.08纳米的球形囊泡结构（图3F）。下载：下载高分辨率图像（1MB）下载：下载全尺寸图像

图3. PMD输送系统的制备。(A) PMD制备的示意图。(B) SD的全波紫外扫描。(C) 每个纳米粒子的ζ电位（n =3）。(D) 每个纳米粒子的大小分布（n =3）。(E) 纳米粒子的动态光散射（DLS）分析（n =3）。(F) PMD的TEM（比例尺：100纳米）。(G) 在pH 5.5的PBS、PBS和培养基中SMOX的释放速率。(H) 不同时间孵育后PMD与溶酶体的共定位激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）图像。(I, J) 使用流式细胞术分析MB 49细胞中纳米粒子的细胞摄取情况。(K) 显示BC细胞MB49对DOX和PMD的细胞摄取的LSCM图像（比例尺：20 μm）。(L) 通过流式细胞术显示不同膀胱细胞系的荧光强度相对值。数据以平均值±标准差表示。*p < 0.05；**p < 0.01；****p < 0.0001；ns，单因素ANOVA测试无显著性。

由于形成了Schiff碱键，PMD表现出对SMOX和DOX的pH响应性释放（图3G，图S3）。与亚细胞定位一致，PMD在MB49细胞中孵育30分钟后与溶酶体共定位，而在2小时后大部分已经从溶酶体中释放出来（图3H）。流式细胞术显示，细胞的药物摄取量在短时间内显著增加，大约是单独使用DOX时的两倍（图3I，J）。进一步的CLSM可视化表明，大部分PMD在30分钟内被细胞内化（图3K）。此外，流式细胞术显示，在孵育10分钟后，BC细胞T24和SW 780细胞中的药物摄取量分别比人类输尿管上皮细胞系SV-HUC-1中的高出3倍和4倍（图3L，图S4）。这些结果表明PMD的成功构建和有效内化，从而有可能诱导肿瘤微环境（TME）中的过氧化应激（ACR）积累并破坏其氧化还原平衡。

2.4. PMD诱导的羰基应激机制

成功构建PMD后，验证了PMD诱导的多种机制。PMD有效地抑制了细胞活力，使其下降到单独使用DOX（约5 μM）时的大约十分之一（图4A）。此外，PMD对SV-HUC-1细胞（一种SV40永生化的人类尿路上皮细胞系）的细胞毒性相对较弱。在PMD浓度为4 μg/mL时，几乎所有MB49细胞都发生了细胞死亡，而大约20%的SV-HUC-1细胞仍然存活。值得注意的是，PMD对SV-HUC-1细胞的IC50值是MB49细胞的1.5倍（图S5）。Calcein-AM/PI染色显示，PMD组中红色荧光死亡细胞的数量比DOX组增加了大约100倍（图4B，C）。PMD处理显著减少了MB49细胞的菌落形成（图S6），以及通过Transwell测定评估的细胞迁移（图S7）和划痕伤口愈合测定（图S8）。PMD输注后，显著增加了ACR的积累（图S9）。进一步评估了PMD对肿瘤细胞氧化还原TME的影响。流式细胞术分析显示，PMD处理后GSH水平显著下降（图S10A）。定量分析表明，PMD处理组的GSH含量大约是对照组的8倍（图S10B）。相应地，ThiolTracker Violet染色显示荧光强度显著降低，表明PMD处理后GSH耗尽（图S10C）。有趣的是，对照SV-HUC-1细胞中的GSH荧光信号明显低于MB49细胞，PMD处理进一步降低了SV-HUC-1细胞中的GSH信号（图S10D）。定量分析显示，PMD处理后的SV-HUC-1细胞中的GSH水平比对照组低5倍，比膀胱癌细胞系低大约8倍（图S10E）。这些结果表明，GSH表达高的癌细胞系对PMD更敏感。正如预期的那样，DOX组中的ROS水平增加了大约两倍，而PMD组中的ROS水平增加了10倍（图4D，E）。一致地，H2O2（图S11A）和MDA（图S11B）的水平在PMD组中也显著升高。由于ACR减少了Fer-1和GPX4的表达，使用Fe2+探针观察到PMD组中Fe2+的显著积累（图4F）。Ferrostatin-1（Fer）和deféroxamine mesylate（DFOM）是经典的铁死亡（ferroptosis）抑制剂，分别通过抑制细胞内铁离子和脂质过氧化（LPO）来发挥作用[39]，[40]。Fer和DFOM分别使细胞活力恢复了60%和40%（图S12），从而证实ACR和DOX共同引起的氧化损伤通过两种平行途径诱导了铁死亡。

图4. PMD对细胞活力的影响。(A) 不同处理下MB49细胞的MTT测定。(B) 通过Calcein-AM/PI染色评估细胞活力（比例尺：20 μm）。(C) 来自B的活/死细胞定量分析。(D) 用DCFH-DA染色的MB49细胞的CLSM图像，用于检测ROS（比例尺：50 μm）。(E) 来自D的DCFH的摩尔荧光强度（MFI）。(F) 用Fe2+探针对MB49细胞进行的CLSM图像（比例尺：50 μm）。(G) P53、Bcl-2和BAX表达的Western blot分析。(H) 用JC-1染色的MB49细胞的线粒体膜电位（比例尺：50 μm）。(I) 用DCFH-DA染色的MB49细胞的ROS的流式细胞术分析。(J) Ras表达的Western blot分析。(K) 示意图说明羰基应激增强的氧化应激。数据以平均值±标准差表示。星号表示与对照组相比有显著差异（**p < 0.01；****p < 0.0001）；井号表示DOX和PMD组之间的显著差异（####p < 0.0001）；ns，单因素ANOVA测试无显著性。

ACR的结合使GAPDH失活，然后GAPDH与E3泛素连接酶Siah相互作用并进入细胞核。在细胞核中，这种复合物促进P300/CBP的表达，进而激活P53的表达[41]，[42]，[43]。PMD处理后，ACR（红色）和GAPDH（绿色）在SW780细胞的细胞质中显示出强烈的共定位，表明ACR与GAPDH结合（图S13A）。接下来，我们研究了P53蛋白在PMD治疗中的关键作用。尽管PMD显著增加了P53的表达，但用P53抑制剂pifithrin-α氢溴酸盐（PH）处理部分逆转了这种效果，导致细胞增殖增加了大约60%（图4G，图S13B）。此外，P53蛋白诱导下游凋亡蛋白的表达，包括BAX/Bcl-2[44]，[45]。Western blot显示PH抑制了促凋亡的BAX，同时增强了抗凋亡的Bcl-2（图4G）。基于BAX/Bcl-2在调节线粒体膜完整性中的作用[46]，[47]，我们推测PMD诱导了线粒体损伤。这通过TMRE和JC-1染色得到证实，这些染色特异性显示PMD破坏了线粒体膜电位，而PH恢复了这种破坏（图4H，图S14）。值得注意的是，PH未能逆转PMD诱导的ROS积累（图4I），表明升高的ROS水平主要归因于代谢产物ACR的直接作用。

GAPDH也是一种关键的糖酵解酶，催化ATP和丙酮酸的产生[48]，[49]。研究发现PMD下调了GAPDH和其他糖酵解酶（如PGK、PFK和PK）的表达（图S15A和B）。为了进一步验证糖酵解相关酶表达的降低是否由PMD诱导的ACR引起，我们用肼苯哒嗪处理SW 780细胞。结果显示，5 μM肼苯哒嗪几乎完全消除了ACR信号（图S15C）。此外，PMD和肼苯哒嗪的联合处理显著恢复了GAPDH、PFK和PK的表达水平（图S15D），表明PMD诱导的ACR抑制了糖酵解相关酶的表达，从而影响了糖酵解。同时，PMD显著抑制了Ras的表达（图4J），Ras是Warburg效应的驱动因素之一，表明PA代谢也可能通过这种致癌信号通路影响糖酵解活性。总之，PMD策略促进了内源性ACR的生成，引发了羰基应激，从而通过增强氧化应激和抑制糖酵解重塑了肿瘤的氧化还原TME（图4K）。这种重塑使肿瘤细胞变得敏感，允许使用降低的化疗剂量有效杀伤肿瘤细胞。

2.5. PMD在皮下膀胱癌模型中的抗肿瘤活性

携带肿瘤的小鼠被分为四组，并在四周内每周通过静脉注射接受不同的治疗（图5A）。为了追踪生物分布，将FITC标记的PMD注入携带肿瘤的小鼠体内，并在不同时间点对器官和膀胱组织进行体外成像。分析显示PMD在肿瘤中选择性地积累，注射后24小时约有50%的荧光信号保留在肿瘤中（图5B-D）。为了证明PMD输送系统能够有效到达并进入体内的膀胱肿瘤细胞，我们测量了静脉注射后肿瘤内SMOX蛋白水平的增加（图5E）。溶血测试显示PMD没有可检测到的溶血活性，表明其具有优异的血液相容性（图S16）。在整个治疗期间，对照组小鼠的体重在第24天后开始下降，而其他所有组的体重保持稳定（图5F）。治疗后，PMD组的肿瘤生长显著受到抑制，最终肿瘤体积仅为单独使用DOX时的五分之一（图5G，图S17）。安乐死后，PMD组的平均肿瘤重量约为SM组和DOX组的一半和五分之一（图5H，I）。与此一致，切除肿瘤的H&E染色显示SM组和PMD组都有广泛的坏死区域（图S15A）。ACR染色显示PMD组和SM组的水平显著高于DOX组（图5J）。PMD处理诱导了广泛的肿瘤坏死，但没有系统毒性迹象（图S18A），血液检查和内脏器官的组织学检查未发现明显异常或损伤（图S18B）。这些结果表明，输送系统不仅通过EPR在复杂的系统循环中保持其肿瘤靶向能力，而且具有超越当前模型的应用潜力，可能扩展到其他疾病。

图5. PMD在皮下携带肿瘤小鼠中的抗肿瘤活性和生物安全性评估。(A) 皮下膀胱癌模型和静脉治疗方案的示意图。(B) 在指定时间点肿瘤中PMD积累的体内荧光成像（比例尺：1厘米）。(C) 来自B的肿瘤和主要器官的荧光强度量化。(D) 来自C的肿瘤特异性荧光强度量化。(E) 肿瘤切片中SMOX的IHC染色（比例尺：500 μm）。(F) 不同处理组小鼠的体重变化（n=5）。(G) 28天内监测的肿瘤生长曲线（n=5）。(H) 对应于I中所示样本的肿瘤重量。(I) 每组切除肿瘤的代表性照片。(J) 肿瘤组织中ACR的IF染色（比例尺：200 μm）。数据以平均值±标准差表示。****p < 0.0001；ns，单因素ANOVA测试无显著性。

为了进行长期和系统的毒性研究，我们使用MB49细胞建立了皮下肿瘤模型，将小鼠分为对照组、DOX（4 mg/kg）和PMD（20 mg/kg）组，每周给药两次。首先，通过尾部静脉注射PBS、DOX和PMD，并在2小时、4小时和6小时收集血液样本，通过荧光扫描确定血清中的DOX残留浓度。结果显示，在所有时间点，DOX组的血清DOX水平都显著高于PMD组，大约有20%的DOX在6小时后仍然存在（图S19A）。进一步的治疗监测显示，对照组和DOX组的小鼠分别在27天和30天开始死亡，而DOX组在21天时出现体重下降，而PMD组没有观察到显著变化（图S19B–E）。治疗后，PMD组的肿瘤重量仅为DOX组的八分之一（图S19F和G）。24天和33天的血清分析显示，DOX组的TNF-α和IL-6水平分别比PMD组高1.5倍和3倍（图S19H和I）。这些发现表明，PMD显著减少了DOX的积累，从而大大减轻了全身毒性，并具有良好的生物安全性。此外，治疗结束时，通过冷冻切片器对每组的肿瘤组织进行切片并用4-羟基壬烯醛（4-HNE）染色。结果显示，尽管使用了高剂量的DOX，DOX组的绿色荧光信号仍然明显弱于PMD组（图S19J），表明PMD通过LPO机制在体内发挥抗肿瘤作用。

2.6. PMD在原位膀胱癌小鼠模型中的抗肿瘤活性
利用膀胱的腔结构，可以进行局部膀胱内灌注治疗，而其他肿瘤的标准全身给药途径是静脉注射。因此，建立了原位膀胱癌小鼠模型。然后，携带肿瘤的小鼠被随机分配到四个治疗组，通过膀胱内灌注进行治疗（图6A和S20）。首先，为了评估PMD的渗透性，使用Cy5.5标记的PMD对正常小鼠和携带肿瘤的小鼠进行膀胱内灌注。结果显示PMD优先积聚在肿瘤组织中，肿瘤区域的荧光强度大约是正常膀胱组织的10倍（图6B-D）。膀胱内灌注后36小时，仍有10%的初始荧光信号在肿瘤中可检测到（图6E，F）。PMD组的肿瘤生长受到显著抑制，相应的生物发光信号分别降至SM组和DOX组治疗结束时的10%和20%（图6G，H，图S21）。四组的体重没有显著差异（图6I）。PMD组的生存率显著高于单独使用DOX组，生存率提高了10倍。然而，这种优异的效果是在仅使用0.4 mg/kg的DOX剂量下实现的，这仅仅是常用剂量约4 mg/kg的十分之一（图6J）。这些结果表明，将SMOX和DOX共同传递给肿瘤细胞比单独使用任一药物都要有效得多，显示出明显的协同治疗效果。

2.7. PMD在体内诱导的氧化还原失衡
为了研究PMD体内抗肿瘤效力的多种机制，从四个治疗组中收集肿瘤进行分子检测、免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）。SM组和PMD组的肿瘤中的GSH含量显著降低，分别为0.92 ± 0.45 mg/kg和0.12 ± 0.03 mg/kg（图7A），表明SMOX触发的活性氧（ACR）有效地耗尽了抗氧化剂库，从而加剧了氧化损伤。作为LPO和氧化应激的关键标志物，MDA的水平在SM组和PMD组中分别升高了约5倍和8倍（图7B）。为了评估糖酵解活性，我们通过RT-qPCR分析了肿瘤裂解物中关键糖酵解酶（GAPDH、PFK、PGK和PK）的mRNA表达。结果显示，这四种酶的转录水平在PMD组中显著下调（图7C）。这直接导致PMD组的乳酸产量大幅减少，仅为1 ± 0.03 mM（图7D）。在PMD组和SM组中都检测到强烈的SMOX信号（图7E），证实了NP的成功递送并表明其在肿瘤细胞内的功能活性。SMOX和DOX协同作用下调GPX4的表达（图7F）。此外，Perls’普鲁士蓝染色显示PMD处理的肿瘤中自由铁的积累显著增加（图7G）。综上所述，这些结果表明PMD不仅触发LPO，还促进体内铁死亡（ferroptosis）。免疫组化（IHC）显示PMD组和SM组中P53的过度表达（图7H），这与ACR诱导的P53上调一致，可能促进了细胞凋亡。

接下来，为了评估PMD的安全性，将肿瘤固定在4%的戊二醛中，进行石蜡包埋并切片进行组织学染色。H&E染色显示PMD处理组有广泛的坏死区域，而单独使用DOX或SM处理的肿瘤仅显示局部或轻微的坏死区域（图7I）。与此一致，TUNEL测定显示PMD组的凋亡细胞数量明显多于单一药物治疗组（图7J）。Ki-67在对照组中表达较高，但在PMD组中显著下调（图7K），表明有效抑制了肿瘤细胞的增殖，这与更好的临床预后相关。治疗后进行安乐死，收集主要器官并进行H&E染色。结果显示肺部、肝脏、脾脏、肾脏或心脏没有显著的病理异常（图S22）。

总体而言，这些结果表明PMD通过多种机制发挥强大的抗肿瘤活性，包括增强LPO、抑制糖酵解和诱导细胞凋亡。由于其有效的肿瘤靶向能力和良好的生物相容性，PMD还降低了全身副作用的风险。

3. 结论
总之，SMOX诱导的内源性ACR通过放大氧化损伤来驱动LPO、细胞凋亡和铁死亡，从而成为治疗的核心机制。它直接与GAPDH结合，进一步诱导凋亡信号，同时通过抑制糖酵解酶抑制Warburg效应，从而破坏肿瘤代谢。ACR诱导的羰基应激扰乱了肿瘤的氧化还原状态，使得使用较低剂量的化疗药物也能发挥强大的抗肿瘤活性。鉴于其在皮下模型中的显著治疗效果，PMD递送系统可能为其他类型的肿瘤提供有希望的治疗方案，特别是那些具有高PA代谢活性的组织中的癌症（例如肠道癌、前列腺癌和心血管癌）。总之，我们的发现表明，利用肿瘤细胞的代谢特性进行自我破坏为膀胱癌治疗提供了有希望的治疗前景。

4. 实验部分
动物：4~6周大的C57小鼠，体重18.0至20.0克，在舒适的环境中饲养，提供标准食物并允许自由饮水。所有动物实验均得到了山东大学齐鲁医院动物护理和实验委员会的批准（批准号DWLL-2024-150）。
SMOX-DOX conjugates的合成：使用戊二醛作为连接剂将SMOX与DOX偶联[50]。简要来说，将SMOX（5 mg）和DOX（5 mg/mL）以1:1、1:5和1:10的摩尔比混合在1 mL的PBS中。以1:1的摩尔比向DOX中添加戊二醛。反应混合物在4°C下孵育12小时并轻轻搅拌，然后加入0.1 M的甘氨酸（pH 5.0）将反应淬灭至最终浓度50 mM。使用Amicon Ultra 0.5 mL离心过滤器（10 kDa MWCO，Millipore）从未反应的成分中纯化 conjugates，并用PBS冲洗三次。使用BCA蛋白测定试剂盒 quantified SMOX的结合产率。结合的DOX浓度在480 nm处通过光谱法测量，并根据自由DOX的标准曲线（0–10 μg/mL）进行计算。

2.7. PMD在原位膀胱癌模型中的抗肿瘤活性
小鼠被麻醉后，使用胰岛素注射器将表达萤光素的MB49细胞接种到膀胱壁中。肿瘤接种后，当荧光强度达到20,000 ± 5,000时，小鼠被随机分配到四个治疗组（n=5），每周进行一次膀胱内灌注：对照组、DOX（0.4 mg/kg）、SM（20 mg/kg，含12 mg/kg SMOX）和PMD（20 mg/kg，含0.4 mg/kg DOX和12 mg/kg SMOX）。在整个21天的治疗期间监测肿瘤生长和体重。对于生物发光成像，小鼠被腹腔注射D-萤光素，麻醉后使用IVIS Spectrum系统进行成像。图像由Living Image软件分析。实验结束时，小鼠被安乐死。收集肿瘤和主要器官进行后续的组织学和分子分析。

2.7. PMD在皮下肿瘤模型中的抗肿瘤活性
根据先前的报告[51]构建了皮下膀胱癌小鼠模型。简要来说，收集MB49细胞并以每只小鼠1×10^6个细胞的密度皮下接种到小鼠体内。当肿瘤生长到1mm^3时，当肿瘤体积达到约100 mm^3时，小鼠被随机分配到四个组（n=5），每周通过静脉注射进行治疗：PBS（对照组）、DOX（0.4 mg/kg）、SM（20 mg/kg，含12 mg/kg SMOX）或PMD（20 mg/kg，含0.4 mg/kg DOX和12 mg/kg SMOX）。在整个21天的治疗期间定期监测肿瘤体积（计算为长度×宽度^2×0.5）和体重。实验结束时，小鼠被安乐死。切除肿瘤并称重并拍照。收集关键器官（如心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏）进行后续的组织病理学分析。