迈向临床应用：蒙脱石增强型乳酸菌生物膜通过调节肠道微生物群-胆汁酸轴来缓解结肠炎

《Materials Today Advances》：Toward clinical translation: montmorillonite-enhanced Lactobacillus biofilm alleviates colitis by modulating the gut microbiota–bile acid axis

　　中原王|冯柱|贾杰|冯康康|Waresi Abudourexiti|宋莉|阮艳哲|陈明飞|余泽谦|赵雷|郭珍|丁超|龚建峰
南京大学医学院附属金陵医院普通外科

**摘要**
口服益生菌对溃疡性结肠炎（UC）具有治疗潜力，但其较低的生物利用度极大地限制了临床疗效。本文设计了一种蒙脱石-嗜酸乳杆菌生物膜（MLB）递送策略，以增强益生菌的稳定性、肠道黏附性和治疗效果。通过诱导临床上常见的嗜酸乳杆菌在蒙脱石（一种广泛用于临床的止泻剂）上形成生物膜来制备MLB。体外实验表明，蒙脱石显著促进了生物膜的形成，从而提高了细菌在胃肠道环境中的存活率并增强了黏膜黏附性。体内实验显示，与游离细菌或非生物膜混合物相比，MLB在缓解DSS诱导的结肠炎方面具有更显著的效果。机制上，MLB通过提高胆盐水解酶活性重塑了肠道微生物群落并恢复了微生物的胆汁酸代谢，这导致次级胆汁酸的产生增加，进而促进了抗炎巨噬细胞的极化并加速了炎症的消退。这些发现共同表明，MLB通过调控微生物群-胆汁酸-免疫轴来增强口服益生菌的效果，为UC的治疗提供了一种安全且实用的方法。

**引言**
溃疡性结肠炎（UC）是炎症性肠病（IBD）的主要类型，其特征是结肠和直肠黏膜及黏膜下层的反复炎症。[1],[2] 尽管经过数十年的研究，其发病机制仍未完全明了，被认为涉及免疫失调、肠道微生物群改变、遗传易感性和环境因素之间的复杂相互作用。[3],[4] 目前的治疗方法（包括氨基水杨酸盐、皮质类固醇、免疫抑制剂和生物制剂）可以诱导症状缓解，但其长期疗效受到高复发率和显著毒性的限制。[5],[6],[7] 鉴于这些局限性，迫切需要既安全又有效的UC治疗策略，同时针对核心病理过程。

肠道微生物群失衡与UC的发生密切相关。[4] 这种失衡表现为有益细菌减少和潜在有害微生物的增殖增加。[8],[9] 这种微生物失衡破坏了肠道上皮屏障，导致持续性黏膜炎症。[10] 因此，针对肠道微生物群的干预措施已成为UC治疗的潜在策略。[6],[9] 益生菌主要通过口服给药，因其良好的安全性、成本效益以及调节免疫功能和促进黏膜愈合的能力而被广泛用于UC治疗。[11],[12] 然而，益生菌的临床疗效常常受到其在胃肠道中存活率低和定植能力弱的限制，从而影响了其在UC中的持久性和治疗效果。[13],[14],[15] 为此，开发了微 encapsulation、聚合物涂层、纳米颗粒和表面修饰等递送策略以提高益生菌在胃肠道中的存活率。[13],[16] 然而，这些方法通常涉及复杂的化学修饰，可能损害益生菌活性并带来体内安全风险。[16],[17] 此外，由于其复杂的制备和纯化步骤，这些方法限制了大规模生产和实际应用。[8] 此外，由于天然微生物群落的强定植抵抗力和UC复杂的炎症环境，单用一种益生菌通常不足以恢复失调的肠道微生物群。[18],[19],[20] 这些问题凸显了开发新型策略的必要性，以增强口服益生菌治疗的有效性和实际应用性。

最近，基于生物膜的益生菌递送策略受到了越来越多的关注。[21] 生物膜由细菌群体组成，这些细菌群体被自身产生的胞外聚合物物质包裹，形成了一个保护性微环境，从而增强了对外部压力的抵抗力。[22],[23] 与浮游益生菌相比，形成生物膜的益生菌表现出更好的耐压性、黏膜黏附性和定植效率。[24],[25] 然而，目前的生物膜构建方法往往缺乏简单性、安全性以及使用食品级材料。[21] 特别是，缺乏天然、可口服的载体成为临床应用的主要障碍。[21] 最近的研究表明，蒙脱石（MMT）这种天然层状硅酸盐矿物可以通过表面电荷介导的机制与益生菌相互作用，促进胞外多糖的产生并有助于形成结构稳定的生物膜。[26] MMT广泛应用于口服止泻药中，以其优异的胃肠道安全性、生物相容性和黏附性而闻名。[26] 这些特性使其成为开发益生菌生物膜递送系统的可行且可扩展的平台。

基于以上研究，我们假设与MMT和保护性益生菌共同构建的生物膜递送系统可以成为治疗UC的有效且具有临床转化潜力的策略。通过挖掘公开数据集，我们首先确定了嗜酸乳杆菌作为对抗UC的保护性菌属（图1A）。随后，我们选择了经临床批准的嗜酸乳杆菌（LAC）并与MMT共培养，构建了蒙脱石-嗜酸乳杆菌生物膜（MLB）（图1B）。本研究旨在评估MLB在小鼠结肠炎模型中的稳定性、黏附性和治疗效果，并探讨其潜在机制（图1C）。总体而言，这项工作提出了一种新型、安全且便捷的基于生物膜的益生菌递送系统，具有强大的临床转化潜力。

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**图1. MLB的制备、口服递送增强及治疗作用的概述。**
(A) 基因数据表明嗜酸乳杆菌数量减少与UC风险增加相关。
(B) MLB的制备过程。
(C) MLB的口服递送及其治疗UC的作用机制。

**材料与方法**
**孟德尔随机化（MR）分析**
为了探索肠道微生物群与UC之间的因果关系，我们使用了来自全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计数据。变异数据来自MiBioGen联盟，包含18,040名个体。[27] UC的汇总统计数据来自两个来源：de Lange等人报告的GWAS数据集（包含12,366例病例和33,609名对照组），以及FinnGen联盟（包含4,320例病例和210,300名对照组）。[28],[29] 为了评估肠道微生物群与UC之间的因果关系，我们应用了多种MR方法，包括径向逆方差加权法、加权中位数、孟德尔随机化-稳健调整的轮廓评分以及MR多效性残差和异常值（MR-PRESSO）测试。[30],[31],[32],[33] 其中，径向IVW方法因在有效MR假设下的高效性而被选为主要分析方法。来自两个数据集的结果通过元分析进行了整合。所有分析均在R语言中完成，使用的是公开且经过伦理审查的数据集。

**细菌菌株和培养**
嗜酸乳杆菌（ATCC 4356）来自中国普通微生物保藏中心（CGMCC），在37°C下摇动条件下培养于MRS琼脂平板或MRS肉汤中。细菌生长通过在600 nm处进行分光光度监测。为了测定菌落形成单位（CFU），将细菌悬浮液系列稀释后接种在MRS琼脂上并在37°C下培养24小时后再进行计数。

**MLB的合成与表征**
MMT（10–30 μm）通过400目和1000目筛子分级，通过高压灭菌（121°C，20分钟）后干燥保存。LAC预先在MRS培养基（100 mL，37°C，过夜）中培养以确保细胞活性。然后将活化后的LAC与MMT共同培养48小时以促进生物膜形成。MLB混合物通过离心（4000 rpm，5分钟）分离，再用磷酸盐缓冲液（PBS）清洗三次以清除残留培养基。

**显微镜成像**
用于扫描电子显微镜（SEM）成像的MLB样本经过冻干（48小时）后固定在样品台上，溅射金层，然后在高真空环境下观察。用于生物膜荧光分析的样本固定在玻璃载玻片上，晾干（37°C），并在2.5%戊二醛中固定（1小时）。荧光染色依次使用ConA四甲基罗丹明结合物（1小时）和DAPI（20分钟）。荧光成像使用Leica 980共聚焦显微镜进行。

**MLB对环境压力的抵抗力**
为了评估耐压性，将等量的LAC和MLB重新悬浮在含有胆盐的培养基中或暴露于强酸性溶液中，同时轻轻摇晃。消化压力通过将悬浮液在胃蛋白酶溶液（10 g/L，0.85% NaCl）或胰蛋白酶溶液（10 g/L，KH2PO4缓冲液）中37°C下恒温轻轻摇晃来模拟。在特定时间点取样（100 μL），用PBS冲洗后涂布在MRS琼脂平板上。在37°C下培养24小时后计数CFU以评估细菌存活率。

**动物实验**
从南京大学实验动物中心购买6–8周大的C57BL/6J雌性小鼠。所有实验程序均遵循机构规定，并获得南京大学动物护理和使用委员会（IACUC）的批准（批准编号IACUC-2502001）。

**患者样本与伦理**
从南京大学医学院附属金陵医院进行手术切除时收集了6名UC患者的肠道标本。取样前获得了患者的书面知情同意。实验获得了金陵医院伦理委员会的批准，所有程序均符合赫尔辛基宣言准则。

**黏膜黏附性评估**
为了研究肠道黏膜黏附性，将荧光标记的LAC和MLB与小鼠和UC患者的离体结肠组织共培养。使用体内成像系统（IVIS）和3D共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）评估细菌对黏膜表面的黏附情况。荧光成像还用于评估体内保留率和黏液黏附性。在动物实验中，C57BL/6雌性小鼠随机分为三组（每组3只），分别口服ICG-NHS标记的LAC、LAC和MMT的物理混合物（ML）或MLB，每组含1 × 10^8 CFU的LAC。使用IVIS Spectrum系统定期监测荧光信号。成像后，根据机构指南人道处死小鼠，并获取结肠组织进行后续实验评估。另一组小鼠分别口服RB-NHS标记的LAC、ML或MLB（1 × 10^8 CFU）。在给药后的预定时间点采集结肠组织，嵌入冷冻保护介质中并切片。切片用MUC-2染色以可视化黏液，然后使用CLSM荧光成像检查LAC在黏液层内的积聚情况。

**结肠炎模型的建立与治疗**
C57BL/6雌性小鼠（6–8周龄）每笼子5只，标准条件下饲养，实验前有一周适应期。小鼠在饮用水中加入3% DSS（36,000–50,000 Da；MP Biomedicals）饲养5天，之后改用普通水饲养直到第10天处死。整个实验期间，对照组小鼠仅饮用普通水。平行组按实验计划口服PBS、MMT、LAC或MLB。

**疾病严重程度评估**
实验期间每日记录体重。通过疾病活动指数（DAI）量化疾病严重程度，该指数通过评估体重减轻、粪便性状和粪便中的血液（0–4分）来计算。实验结束后，切除结肠并测量其长度。

**组织学分析**
处死后，将结肠取出并用PBS冲洗。收集后，组织在室温下用4%福尔马林固定24小时，然后进行石蜡包埋。从石蜡包埋组织中切出5 μm厚的切片，用苏木精和伊红（H&E）染色。根据既定评分系统盲法评估结肠组织损伤。对于黏液分析，结肠用盐水清洗三次，然后在4°C下浸泡在Carnoy固定剂中过夜后进行包埋。切片用MUC-2染色以观察黏液，然后用CLSM荧光成像检查LAC在黏液层中的积聚情况。

**免疫荧光分析**
组织切片用F4/80和CD206抗体双标记以检测M2巨噬细胞，用F4/80和CD86抗体标记M1巨噬细胞。此外，切片还用TNF-α、IL-1β和IL-6抗体进行免疫染色，室温下孵育1小时后用DAB显色。

**ELISA**
用冷PBS制备小鼠结肠组织匀浆液，并根据说明书使用ELISA试剂盒检测炎症细胞因子。

**定量实时PCR**
使用Sangon Biotech的快速提取试剂盒纯化细菌RNA。通过Trizol方法（Invitrogen）分离组织和细胞RNA。在7300系统上进行定量实时PCR，使用SYBR Green I（Roche）和Sangon Biotech合成的引物（序列见表S1）。

**生物安全性评估**
在安全性研究中，C57BL/6雌性小鼠（6–8周龄）每隔一天口服含有1 × 10^8 CFU LAC的MLB，PBS处理的小鼠作为对照。每日记录体重。第10天获取血液样本以评估肝肾功能。安乐死后，切除结肠以测量长度，并采集主要器官进行H&E组织学检查。微生物组分析：使用PowerSoil?（Qiagen）分离粪便DNA，用Nanodrop进行定量，并在1.2%琼脂糖凝胶上检测。使用条形码引物341F/806R和Pfu聚合酶（Thermo Fisher）扩增V3–V4 16S rRNA区域。扩增子经过纯化、定量，然后用TruSeq Nano DNA LT Kit（Illumina）构建测序文库。文库经过质量检测后，在MiSeq（2 × 300 bp）或NovaSeq 6000（2 × 250 bp）上进行测序。使用QIIME2（DADA2）或VSEARCH对序列进行质量处理、去噪、合并和去除嵌合体。OTUs在97%相似性水平上聚类，并使用SILVA/Greengenes进行分类学鉴定。进行了α和β多样性分析（Shannon、Simpson、PCA），用热图可视化微生物组成，并使用PICRUSt2进行功能预测。

通过停止进食（FMT）处理：为了耗尽肠道微生物群，小鼠在饮用水中连续七天分别接受甲硝唑、新霉素、万古霉素和氨苄西林（剂量分别为1、1、0.5和1克/升），随后进行3% DSS处理。对于FMT处理，将粪便样本转移到厌氧室中，并用预还原的无菌Ringer工作缓冲液匀浆至最终浓度100毫克/毫升。然后将匀浆液通过100微米滤膜过滤，所得上清液与等体积的20%（重量/体积）脱脂牛奶混合作为冷冻保护剂。新鲜制备的接种物用于初次移植，剩余部分储存于-80°C以备后续使用。抗生素预处理后，每天通过口服给予200微升粪便悬液，持续七天。

胆汁酸检测：粪便样本中的胆汁酸由苏州PANOMIX生物科技有限公司分析。简要来说，样品与预冷的甲醇和玻璃珠混合后匀浆、超声处理并离心。上清液稀释、过滤后转移到套管中，使用ACQUITY BEH C18色谱柱在水-乙腈梯度下进行UPLC–MS分析，流动相为水和乙腈，梯度中加入0.1%甲酸。化合物在负电喷雾模式下通过MRM检测，通过校准曲线定量，数据使用Analyst软件处理。

BSH活性测定：BSH活性使用市售的ELISA试剂盒（G0933W，Grace Biotechnology）按照制造商的协议进行测定。

BSH抑制剂和胆汁酸处理：对于BSH抑制剂处理，将GR-7（HY-135747，MedChemExpress）（一种胆盐水解酶BSH抑制剂）用5%二甲基亚砜配制在玉米油中。在预定时间点，小鼠通过口服给予200微升GR-7溶液（10毫克/千克），而对照组仅给予溶剂。对于胆汁酸处理，小鼠每天口服给予一定剂量的次级胆汁酸（SBAs）。

巨噬细胞极化：RAW 264.7巨噬细胞在含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基中于37°C、5% CO2条件下培养。在巨噬细胞极化实验中，细胞在LPS（500纳克/毫升）刺激前预先处理20微摩尔SBAs。

细胞免疫荧光：RAW 264.7细胞接种在含有10毫米盖玻片的24孔板上，并按指示进行处理。处理后，细胞用PBS洗涤，用4%甲醛固定30分钟，然后用5% BSA在室温下封闭30分钟。针对Arginase-1和iNOS的一抗在4°C下孵育过夜，随后加入二抗（Alexa Fluor? 488山羊抗鼠IgG和Alexa Fluor? 546驴抗兔IgG，比例为1:200）孵育1小时。用DAPI标记细胞核10分钟，使用Zeiss LSM980显微镜获取免疫荧光图像。

Western blot分析：RAW 264.7细胞接种在6孔板上并按指示进行处理。24小时后，使用Beyotime试剂盒提取总蛋白并用BCA测定法定量。样品与5× SDS加载缓冲液混合，100°C煮沸10分钟，然后在12% SDS-PAGE凝胶上分离。蛋白质在300 mA电压下转移到PVDF膜上，用5% BSA封闭1小时，接着在4°C下与一抗孵育过夜。TBST洗涤后，加入HRP标记的二抗孵育1小时，使用Tanon-5200化学发光成像系统检测蛋白质信号。

统计分析：数据以平均值±标准误差（SEM）表示。两组之间的比较使用双尾Student’s t检验进行，多组之间的差异通过单因素方差分析（one-way ANOVA）分析。统计显著性定义为p < 0.05（p < 0.05：*，p < 0.01：**，p < 0.001：***，p < 0.0001：****）。

结果：乳杆菌丰度与溃疡性结肠炎（UC）易感性的因果关系：研究设计的总结见图1A。从全基因组关联研究（GWAS）汇总数据中识别的遗传变异作为肠道微生物分类单元的指标，然后使用双样本因果关联（two-sample MR）分析其对UC风险的因果影响（图1B）。我们最初采用径向逆方差加权方法（radial inverse-variance weighted method），因其统计效率高，根据de Lange等人的GWAS数据识别可能与UC有因果关联的分类单元。分析显示，较高水平的乳杆菌、Clostridium sensu stricto 1和Eubacterium ventriosum组与UC风险降低相关，而Bilophila、Coprococcus 2、Lachnospiraceae UCG008和Eubacterium ruminantium组与UC风险增加相关（图1C, D）。

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图1. 孟德尔随机化证明乳杆菌丰度与UC风险存在因果关系。(A) 使用 publicly available的GWAS数据集分析肠道微生物群和UC。(B) 用于检测因果效应的双向双样本MR方法示意图。(C) 在发现队列中显示显著关联的分类单元的因果估计值（β），采用径向逆方差加权（P < 0.05）。(D) 在独立队列中进一步验证了发现阶段具有显著效应的微生物分类单元。星号（*）表示MR显著性。正向和负向因果方向分别用红色和蓝色渐变表示。黑色字体显示的分类单元基于验证结果被排除，红色字体突出显示了具有一致因果关联的分类单元。(E, F) 在发现和验证队列以及综合meta-analysis中，不同MR方法下的乳杆菌-UC关联的比值比。(G) 概念图说明推断的因果途径：遗传预测的乳杆菌丰度降低导致UC风险增加。

为了验证这些发现，我们使用独立的芬兰UC队列进行了重复分析，证实了乳杆菌丰度与UC风险之间的显著负相关。然而，在重复数据集中，其他分类单元的关联未达到统计显著性（图1D, E）。为了解决潜在的逆向因果关系，我们进行了反向MR分析，将UC作为暴露因素，乳杆菌丰度作为结果，结果显示UC对乳杆菌水平没有因果效应（图1F）。这些结果通过多种MR方法和meta-analysis得到加强，确认了其可靠性（图1D–F）。总体而言，我们的研究提供了乳杆菌作为UC发展保护因子的遗传证据，强调了基于微生物群的疗法潜力（图1G）。

MLB的制备与特性：这些发现促使我们开发了一种UC治疗手段，以有效补充肠道中的乳杆菌。为此，我们选择了LAC作为代表菌株，因为多项研究已证明其在维持肠道屏障功能及调节黏膜和系统免疫反应中的作用[18],[39],[40]。值得注意的是，LAC在标准MRS培养基中无法形成生物膜[26]。为了诱导生物膜形成，引入了MMT作为粘附底物和生物膜发育诱导剂。这一过程在MMT颗粒上形成了密集的LAC生物膜，称为MLB。为了确认生物膜的形成，我们详细表征了MLB。SEM显示MMT表面没有细菌存在（图2A），而与LAC共培养后在MMT表面形成了明显的生物膜形态（图2B）。ConA染色进一步证实了生物膜的形成，MMT上没有信号，而MLB上有强烈信号（图2C）。此外，MLB的ζ电位与MMT显著不同，这可能是由于表面存在生物膜层（图2C）。此外，对乳杆菌生物膜形成至关重要的群体感应基因LuxS在MMT存在下显著上调，证实了生物膜的增强发育（图2D）。

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图2. MLB的制备、表征及其对环境压力的体外抵抗力。(A) MMT表面上乳杆菌生物膜的SEM图像。(B) ConA染色（红色）显示生物膜基质。(C) MMT和MLB的ζ电位分析。(D) 与生物膜相关的群体感应基因检测。(E-G) 体外细菌对(E) 胆汁盐，(F) 强酸，(G) 高温，(H) SGF和(I) SIF的抵抗力。比例尺，5微米。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

生物膜的一个标志性特征是对环境压力的增强抵抗力。因此，我们假设MLB会赋予更高的对外部挑战的抵抗力。为了验证这一点，我们将自由状态的LAC和MLB暴露于酸性条件、胆汁盐和高温下。如图2E–G所示，MLB显著增强了LAC在极端pH值、胆汁盐和热应力下的存活能力。基于这些结果，我们接下来研究了MLB是否能在模拟的胃肠道环境中增强细菌生存能力。暴露于SGF时，自由状态的LAC活力随时间下降，而MLB即使在暴露2小时后仍保持较高存活率（图2H）。同样，暴露于SIF4小时后，自由状态的LAC细胞活力显著丧失，而MLB仍保持较高水平的存活细菌（图2I）。这些结果共同表明MLB具备增强胃肠道环境抵抗力的潜力，支持其作为UC治疗的有效口服递送系统的潜力。

我们通过体外实验评估了MLB的肠道粘附能力。通过荧光标记的LAC和MLB与离体小鼠结肠组织孵育。孵育后，使用IVIS评估细菌对黏膜表面的粘附情况。图3A显示MLB组显示出强烈的荧光信号，而对照组信号较弱。此外，三维重建的CLSM图像显示MLB组在肠道壁表面的粘附LAC细胞数量更多（图3A）。为了评估MLB的黏膜粘附能力，我们将其与UC患者的结肠活检样本一起孵育。如图3B所示，MLB组的荧光信号明显强于LAC组。这些发现表明MLB更有效地粘附于结肠黏膜。

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图3. MLB在肠道中增强益生菌的黏膜粘附和定植。(A) 体外评估小鼠结肠组织的粘附情况。右侧显示了整个结肠的荧光图像以及放大的3D CLSM重建图。(B) 使用UC结肠活检样本进行的体外粘附实验的荧光图像和腹部信号量化。(C) 口服给予荧光标记益生菌后的体内粘附追踪。(D) 治疗后肠道的荧光成像；对应于(C)的肠道分离部分的荧光图像。(E) (C)中腹部荧光强度的量化。(F) mucus层内LAC的荧光成像。Mucin-2（绿色）标记黏液，而rhodamine（红色）标记LAC细胞。切片染色和IVIS的比例尺分别为50微米和5毫米。数据以平均值±标准误差（SEM）表示。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

在体外确认MLB增强粘附和保留能力后，我们进一步研究了其在体内改善益生菌定植的潜力。为此，小鼠单独口服给予荧光标记的LAC（ML）或MLB。腹部荧光测量显示MLB产生的信号明显更强，并且持续时间更长（图3C–E）。尽管组内存在荧光信号的个体差异（可能是由于肠道微生物群组成的差异），MLB组的平均荧光强度仍显著高于其他组。这种延长的保留时间可能归因于其对黏膜层的更好粘附。给药48小时后，小鼠被处死，并使用IVIS成像系统捕捉肠道荧光。如图3D所示，MLB组的荧光强度明显高于其他组，主要集中于结肠区域。鉴于溃疡性结肠炎（UC）相关的肠道病变主要发生在结肠，MLB特别适合用于针对结肠炎的递送。此外，通过冷冻切片观察了LAC在结肠中的粘附情况，发现MLB组中的LAC在黏膜层上有广泛的附着，而其他组中的LAC分布较为稀少（图3F）。总的来说，这些发现表明MLB显著改善了结肠的黏膜粘附和定植。

**MLB治疗DSS诱导的结肠炎的效果**

受到上述发现的鼓舞，我们进一步评估了MLB对DSS诱导的小鼠结肠炎的治疗效果。通过让C57BL/6小鼠连续5天饮用含有3% DSS的水来诱导急性结肠炎，之后再换成普通水（图4A）。DSS处理（PBS + 3% DSS）在小鼠中引起了典型的炎症性肠病（IBD）症状——如体重下降、疾病活动指数（DAI）升高、结肠缩短以及炎症细胞因子增加——与对照组（PBS + 水）相比（图4B–N），验证了DSS结肠炎模型的有效性。

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**图4. MLB在DSS诱导的结肠炎中的治疗效果。**
(A) 实验方案：C57BL/6小鼠在0-5天内饮用含有3% DSS的水，并在0、2、4和6天分别给予PBS、MMT、LAC、ML或MLB（1 × 10^8 CFU）。
(B) 体重变化。
(C) 疾病活动指数（DAI）。
(D, E) 结肠形态和长度。
(F, G) H&E染色和组织学评分。
(H, I) 阿尔辛蓝染色和每个隐窝的杯状细胞计数。
(J) 紧密连接蛋白的免疫荧光。
(K, L) 紧密连接蛋白的mRNA表达。
(M) MUC2的mRNA表达。
(N) 通过ELISA测定的结肠细胞因子水平（TNF-α, IL-6, IL-1β）。比例尺，100 μm。数据为平均值 ± 标准误差（n = 5）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001。

为了评估MLB的治疗潜力，我们在第0、2、4和6天分别给结肠炎小鼠口服PBS、MMT、LAC或MLB（1 × 10^8 CFU/小鼠）（图4A；补充图5A–E）。通过体重、DAI和结肠长度来评估治疗效果。接受MLB治疗的小鼠体重下降较少，DAI降低，结肠长度较长（图4B–E）。使用H&E染色进行组织学分析进一步证实了MLB的治疗效果。与之前的发现一致，DSS处理导致明显的上皮损伤、隐窝结构破坏和炎症细胞的大量浸润。相比之下，接受MLB治疗的小鼠溃疡较轻，炎症浸润减少，隐窝结构基本保持完整，这通过组织学评分和代表性图像得到证实（图4F, G）。通过ELISA量化IL-1β、TNF-α和IL-6的水平进一步评估了炎症状态。如图4N所示，DSS处理显著增加了这些细胞因子的水平，而MLB处理显著降低了它们的水平，显示出其强大的抗炎作用。

**接下来，我们评估了不同配方对DSS诱导的结肠炎中结肠黏膜完整性的影响。杯状细胞及其黏蛋白对维持结肠黏液屏障至关重要。在DSS处理的小鼠中，MLB处理保护了杯状细胞并保持了更厚的黏液层（图H, I）。此外，MLB恢复了紧密连接蛋白ZO-1和occludin，这些蛋白对屏障完整性至关重要，进一步体现了其对结肠黏膜屏障的保护作用（图4G–M）。

**我们还进行了一系列生物安全性评估。小鼠每隔一天口服MLB，而对照组小鼠则接受PBS。处理10天后，采集血液和主要器官进行进一步分析。MLB处理的小鼠体重和结肠长度没有显著下降（补充图1A和B）。主要器官的H&E染色显示其形态和结构正常，进一步证明了MLB的优异生物相容性（补充图1C和D）。血清的生化分析显示，MLB组和PBS组之间的肝肾功能标志物没有差异，表明MLB处理没有引起肝或肾毒性（补充图1E和F）。**

**MLB调节肠道微生物群的能力**

这些结果表明，MLB主要通过促进活益生菌在肠道中的持续存在和重塑肠道微生物群来发挥其治疗作用。为了验证这一假设，我们给DSS诱导的结肠炎小鼠注射了热灭活的MLB（补充图2A）。灭活配方几乎没有治疗效果，进一步支持了MLB的有益作用主要依赖于活益生菌的增菌作用这一观点（补充图2B）。

**为了探讨MLB如何调节肠道微生物群，我们在第10天收集粪便样本进行16S rRNA测序。使用观察到的OTUs、Shannon和Chao1指数评估微生物α多样性。与健康对照组相比，PBS处理的DSS小鼠的微生物丰富度和多样性显著下降（图5A）。然而，MLB处理有效恢复了这些指数，与健康对照组没有显著差异（图5A）。微生物谱的PCA分析显示MLB组形成了一个独立的簇，反映了社区结构的显著改变（图5B）。**

**接下来，我们检查了主要细菌门和属的相对丰度。与UC患者的先前研究一致，DSS诱导的小鼠结肠炎导致厚壁菌门（Firmicutes）减少而变形菌门（Proteobacteria）增加（补充图3A–C）。MLB处理通过增加厚壁菌门的丰度和减少变形菌门来恢复微生物平衡（补充图3A–C）。在属的水平上，分析25个最丰富的属显示MLB处理显著富集了有益的微生物类群，包括乳杆菌（Lactobacillus）和梭菌（Clostridium），同时抑制了潜在的致病菌属如拟杆菌（Bacteroides）（图5C, D）。线性判别分析（LDA）确定乳杆菌是MLB组中富集的关键鉴别属，进一步验证了治疗后观察到的微生物组成的重塑（图5E）。值得注意的是，MLB组中的乳杆菌丰度显著高于ML组，这可能是由于MLB中的生物膜基质增强了益生菌的定植。**

**为了进一步验证微生物群介导的效果，我们进行了粪便微生物移植（FMT）。在抗生素处理后收集粪便样本并进行细菌平板计数，以确认肠道微生物群的有效清除。随后，将每个供体组在第10天收集的粪便样本口服给予经过抗生素预处理的结肠炎小鼠（图5F）。接受MLB组粪便移植的小鼠体重下降减少，结肠长度增加（图5G-I）。H&E组织学显示MLB-FMT组的组织损伤减少，进一步支持了MLB的治疗效果（图5J, K）。值得注意的是，FMT后粪便样本的16S rRNA测序分析显示MLB-FMT组中乳杆菌的相对丰度显著增加，表明微生物重建和有益类群的富集成功（补充图6A–F）。综合这些结果表明，MLB处理显著增强了乳杆菌的丰度，重塑了肠道微生物组成，并有助于缓解结肠炎。**

**MLB调节胆汁酸代谢的能力**

肠道微生物群通过产生代谢中间产物影响宿主生理和病理生理。[10] KEGG通路分析显示，MLB处理显著改变了多个微生物代谢通路，其中胆汁酸代谢是最受影响的通路之一（图6A）。最近的研究表明，乳杆菌物种通过表达BSH参与胆汁酸代谢[41]。我们的结果也显示了粪便中乳杆菌丰度与微生物合成次级胆汁酸能力之间的正相关（图6B）。

**考虑胆汁酸代谢在UC中的重要性，我们进行了针对性的胆汁酸代谢组学研究，以探讨MLB如何影响肠道胆汁酸组成。[42] 粪便胆汁酸丰度的热图显示不同处理组之间存在显著差异（补充图4A）。PLS-DA分析显示MLB组的胆汁酸谱型接近健康对照组（图6C）。此外，结肠炎小鼠的总胆汁酸水平降低，而在MLB治疗后部分恢复（补充图4B）。值得注意的是，MLB显著降低了结合胆汁酸的水平，并提高了未结合胆汁酸与结合胆汁酸的比例（图6D；补充图4C），表明肠道BSH活性增加。定量分析BSH活性显示MLB显著增强了粪便中的BSH活性（补充图4F）。由于BSH主要由乳杆菌表达，这种激活可能归因于MLB组中乳杆菌丰度的增加。[41] 由于初级结合胆汁酸必须先去结合才能转化为次级胆汁酸，我们接着评估了初级胆汁酸的组成。[43] 在MLB处理的小鼠中，初级结合胆汁酸减少，而非结合形式增加（图6F）。有趣的是，MLB组中未结合的初级胆汁酸（包括胆酸和脱氧胆酸）的水平较低，这可能是由于MLB处理后梭菌等微生物将其转化为次级胆汁酸（图5E和6F）。**

**为了验证微生物群介导的效果，我们进行了FMT。在抗生素处理后收集粪便样本并进行细菌培养实验，以确认移植前肠道微生物群的有效清除。随后，将每个供体组在第10天收集的粪便样本口服给予经过抗生素预处理的结肠炎小鼠（图5F）。接受MLB组粪便移植的小鼠体重下降减少，结肠长度增加（图5G-I）。H&E组织学显示MLB-FMT组的组织损伤减少，进一步支持MLB的治疗效果（图5J, K）。值得注意的是，FMT后粪便样本的16S rRNA测序分析显示MLB-FMT组中乳杆菌的相对丰度显著增加，表明微生物重建和有益类群的富集成功（补充图6A–F）。综上所述，这些结果表明MLB处理显著增强了乳杆菌的丰度，重塑了肠道微生物组成，并有助于缓解结肠炎。**

**MLB调节巨噬细胞极化以缓解结肠炎**

UC的病理微环境以免疫稳态失调为特征，其中促炎免疫细胞浸润显著[46]。其中，巨噬细胞在肠道黏膜中积聚并主要极化为M1表型，产生加剧肠道炎症的促炎细胞因子[47][48]。在这项研究中，MLB处理显著降低了关键促炎细胞因子——IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，这些细胞因子主要由巨噬细胞产生（图4N）。这促使我们认为MLB通过影响肠道中巨噬细胞的极化来缓解肠道炎症。

**为了研究MLB处理后巨噬细胞表型的变化，我们对结肠中的M1（CD86+/F4/80+）和M2（CD206+/F4/80+）巨噬细胞进行了双重免疫荧光染色。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，大量M1巨噬细胞浸润结肠，而M2巨噬细胞几乎不存在，表明M1极化持续（图7A, C）。值得注意的是，MLB处理导致M1巨噬细胞水平显著降低，同时M2巨噬细胞相对增加（图7A, C）。这种巨噬细胞极化的变化通过qRT-PCR得到进一步证实，显示M1相关基因（CD86, iNOS）的表达下调，M2相关标记物（CD206, Arg-1）在结肠组织中的转录增加（图7B, D）。**

**MLB调节巨噬细胞极化以缓解结肠炎**

**UC的病理微环境以免疫稳态失调为特征，其中促炎免疫细胞浸润显著。[46] 在这些细胞中，巨噬细胞在肠道黏膜中积聚并主要极化为M1表型，产生加剧肠道炎症的促炎细胞因子[47][48]。在这项研究中，MLB处理显著降低了关键促炎细胞因子——IL-6、TNF-α和IL-1β的水平，这些细胞因子主要由巨噬细胞产生（图4N）。这促使我们提出MLB通过影响肠道中的巨噬细胞极化来缓解肠道炎症。**

**为了研究MLB处理后巨噬细胞表型的变化，我们对结肠中的M1（CD86+/F4/80+）和M2（CD206+/F4/80+）巨噬细胞进行了双免疫荧光染色。在DSS诱导的结肠炎小鼠中，大量M1巨噬细胞浸润结肠，而M2巨噬细胞几乎不存在，表明M1极化持续（图7A, C）。值得注意的是，MLB处理导致M1巨噬细胞水平显著降低，同时M2巨噬细胞相对增加（图7A, C）。这种巨噬细胞极化的变化通过qRT-PCR得到进一步证实，显示M1相关基因（CD86, iNOS）的表达下调，M2相关标记物（CD206, Arg-1）在结肠组织中的转录增加（图7B, D）。MLB通过调节巨噬细胞的极化来缓解结肠炎。(A, C) F4/80（巨噬细胞）、CD86（M1）和CD206（M2）的代表性结肠免疫荧光图像。(B, D) 各组巨噬细胞M1（CD86, iNOS）和M2（CD206, Arg-1）标记物的mRNA水平。(E) 经处理的RAW264.7细胞中的相应mRNA。SBAs包括：LCA、DCA、HDCA和12-酮LCA混合物。(F) 通过免疫荧光检测巨噬细胞中的iNOS/Arg-1蛋白。(G, H) Western blot及iNOS/Arg-1的定量分析。刻度尺：20 μm。平均值 ± 标准误；n = 3。P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001, P < 0.0001。先前的研究表明，MLB的治疗效果主要源于其促进SBAs的产生。为了确定SBAs是否有助于巨噬细胞表型的调节，我们用四种代表性的SBAs（DCA、LCA、HDCA和12-酮石胆酸（12-酮LCA）混合物体外处理RAW264.7巨噬细胞——这些成分在MLB治疗的小鼠中显著增加，并且含量相对较高（见图6G和补充信息图S4E）。SBAs混合物的处理有效抑制了LPS诱导的M1极化，表现为IL6、TNF-α和iNOS的mRNA水平下降，同时M2标记物CD206的表达增加（见图7E）。这些发现通过免疫荧光和Western blot分析得到证实，结果显示SBAs处理后iNOS水平降低，Arg-1表达恢复（见图7F–H）。总体而言，这些结果表明MLB通过增加次级胆汁酸的水平、抑制M1巨噬细胞的极化以及增强M2巨噬细胞的极化来缓解结肠炎。

MLB在结肠炎治疗中的疗效
为了评估MLB的治疗潜力，我们在C57BL/6小鼠中通过饮用水提供3%的DSS来诱发急性结肠炎，持续五天。从第五天开始，小鼠在第5、6、7和8天分别口服PBS、MMT、LAC或MLB（1 × 10^8 CFU/小鼠）。值得注意的是，MLB治疗显著保护了小鼠免受DSS引起的急性结肠炎的影响，表现为体重减轻减少、DAI评分降低、结肠长度增加、组织损伤减轻、结肠屏障完整性改善以及炎症反应减弱（见图8B-N）。这些发现支持MLB有效缓解DSS诱导的急性结肠炎的结论。

讨论
越来越多的证据表明，溃疡性结肠炎（UC）患者经常表现出肠道微生物群失衡，但由于观察性研究的局限性，这种失衡是否是病因尚不清楚[49][50]。为了建立因果关系，我们采用了机器学习（MR）分析方法，该方法减少了观察性研究中固有的混淆偏差[35]。我们的MR分析发现乳杆菌属具有遗传学上预测的对UC的保护作用，为该细菌的治疗提供了有力的依据[51]。然而，乳杆菌补充剂的临床疗效并不一致，这主要是由于其在胃肠道中的存活率和定植能力较差[12][18][19][52]。正如Zmora等人所展示的，宿主的定植抵抗常常限制了益生菌的粘附[20]。尽管已经开发了微囊化等先进的递送系统，但其复杂性和安全性问题阻碍了临床应用[13][16][17]。一种更有前景的策略是利用生物膜形成，因为生物膜自然增强了细菌的韧性和持久性[21][26]。我们假设MMT（一种安全的黏膜粘附止泻剂）可以作为促进益生菌生物膜形成的理想载体[26]。基于这一概念，我们开发了MLB平台，通过诱导嗜酸乳杆菌在MMT上的自发生物膜形成来实现这一目标。MLB显著提高了细菌在胃肠道压力下的存活率，增强了UC小鼠和患者组织中的黏膜粘附，并促进了体内稳定定植。重要的是，MLB生物膜可以通过使用临床批准且易于获得的材料通过简单的共培养过程生产，无需复杂的化学合成。此外，蒙脱石和乳杆菌都有长期的安全使用历史，我们的体内实验未发现对主要器官功能或组织学有不良影响。值得注意的是，生物膜的形成是通过纯物理过程实现的，无需化学修饰，从而最大限度地减少了与合成链接剂或聚合物相关的潜在安全问题。

MLB的治疗效果基于一种机制，该机制将微生物重塑与免疫调节联系起来[48][53]。MLB给药首先恢复了结肠炎小鼠的肠道微生物群平衡，逆转了多样性及厚壁菌门的下降趋势，同时乳杆菌显著增加，抑制了变形菌门的扩张。这种微生物群重塑通过粪便菌群移植（FMT）验证为因果关系，随后纠正了受损的微生物胆汁酸代谢[44]。具体而言，MLB增强了胆汁酸饱和素（BSH）的活性，这一过程可能受到富集的乳杆菌的促进，导致胆汁酸的去结合作用增强，抗炎性次级胆汁酸显著增加，BSH的抑制证实了这一过程的关键作用[41]。最终，这些由MLB诱导的次级胆汁酸直接调节了结肠的免疫环境，使巨噬细胞的极化从促炎的M1型转变为抗炎的M2型，从而缓解了炎症[54][55]。

我们研究中存在一些局限性。首先，尽管选择了嗜酸乳杆菌作为代表菌株，但同一物种内的乳酸菌菌株之间存在功能异质性，因此在推广我们的发现时需要谨慎。值得注意的是，本研究中开发的蒙脱石增强生物膜策略主要是由蒙脱石与细菌表面电荷之间的物理化学相互作用驱动的，而非特定菌株的生物学特性。因此，这一平台可能适用于其他能够形成生物膜的乳酸菌，包括各种乳杆菌属菌株，甚至可能扩展到双歧杆菌属等其他属，这值得进一步研究。其次，尽管扫描电子显微镜（SEM）和ConA染色证实了MLB生物膜的形成，但我们没有量化生物膜组分（如EPS/蛋白质）或厚度和密度等参数。这是因为我们的研究主要关注生物膜在维持益生菌活力方面的保护功能，这对其治疗效果至关重要。第三，MLB生物膜的完整性和定植持久性尚未在更生理相关的条件下进行系统评估，例如肠道微生物群的竞争、肠道不同区域的差异以及黏液层厚度的变化。最后，临床粘附实验涉及的样本量有限，且缺乏按临床特征分层分析，这可能限制了我们发现的可推广性。需要更大规模的独立研究来验证这些观察结果。