可3D打印的GelMA/PEGDA水凝胶通过SIRT1介导的血管生成和骨形成促进骨骼再生

《Materials Today Communications》：3D-Printable GelMA/PEGDA Hydrogel Promotes Bone Regeneration through SIRT1-Mediated Angiogenesis and Osteogenesis

　　**上海齿科修复与再生工程研究中心、同济大学口腔医学院及口腔医院修复科**
**张恒|郭梦佳|刘伟才|于涛|陈光权|李雄**

**摘要**
血管生成与骨生成的整合对于有效的骨再生至关重要，这需要开发多功能生物材料。本研究介绍了一种可3D打印的GelMA/PEGDA水凝胶，其中含有白藜芦醇（Resveratrol, Res），旨在通过SIRT1介导的血管生成和骨生成来促进骨再生。该水凝胶具有优异的打印性能和生物相容性，能为细胞生长和分化提供支撑性基质。白藜芦醇作为SIRT1的强效激活剂，可增强血管生成和骨生成途径。体外研究表明，GelMA/PEGDA@Res水凝胶显著上调了血管生成因子的表达，从而改善了血管化。体内实验表明，在大鼠颅骨缺损模型中，该水凝胶加速了骨愈合，表现为血管形成和骨组织再生增强。这些发现表明，GelMA/PEGDA-白藜芦醇水凝胶是骨组织工程的有前景的候选材料，通过SIRT1激活实现血管生成和骨生成的双重功能。本研究为开发集药物释放与组织工程于一体的生物活性支架提供了新的策略。

**1. 引言**
骨再生仍然是组织工程领域的一个重大挑战，尤其是因为骨生成与血管生成等不同细胞过程之间的复杂相互作用[1]。有效的骨愈合依赖于血管化组织的形成，其中血管生成为成骨祖细胞的招募、营养物质输送和代谢调节提供了支持性微环境。因此，促进血管生成驱动的骨再生是改善骨修复效果的战略性方法，尤其是在关键尺寸的缺损中[2]。尽管外科技术和骨移植材料有所进展，但仍迫切需要能够不仅支持骨形成，还能主动刺激血管生长的创新生物材料[3]。

水凝胶作为骨组织工程的支架引起了广泛关注，因为它们能够模拟天然细胞外基质（ECM），为细胞附着、增殖和分化提供有利环境[4]。在探索的各种水凝胶中，明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）和聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）因其出色的生物相容性、可调的机械性能以及适用于3D打印而特别有前景[5],[6],[7]。GelMA源自变性的胶原蛋白，保留了其前体的细胞结合基序，促进细胞粘附和增殖[8]。PEGDA则增强了水凝胶的机械稳定性和可调性，使得可以构建具有所需物理特性的支架[9]。GelMA和PEGDA的结合提供了一个多功能平台，可以轻松修改以结合生物活性分子，从而提高支架的再生潜力[10]。

白藜芦醇（Resveratrol, Res）是一种天然的多酚化合物，存在于多种植物中，具有多种生物学活性，包括抗炎、抗氧化和抗癌作用[11]。最近的研究强调了白藜芦醇在促进血管生成和骨生成中的作用，使其成为骨组织工程应用的理想候选物质[12]。白藜芦醇的促血管生成效应主要通过激活Sirtuin 1（SIRT1）来实现，SIRT1是一种依赖于NAD+的去乙酰化酶，在细胞代谢、应激反应和寿命延长中起关键作用[13],[14]。研究表明，白藜芦醇激活SIRT1可增强血管内皮生长因子（VEGF）等血管生成因子的表达，从而促进新血管的形成[15]。此外，SIRT1激活还与间充质干细胞（MSCs）的骨生成分化有关，进一步支持了其在骨再生中的潜力[16]。

在此背景下，我们开发了一种可3D打印的GelMA/PEGDA@Res水凝胶，结合了支架的结构支撑和白藜芦醇的促血管生成生物活性，旨在增强体内的血管生成介导的骨生成。这种方法侧重于利用血管生成作为骨再生的关键调节因素，而不是直接在体外诱导骨生成分化。将白藜芦醇掺入水凝胶支架中，旨在创造一种多功能生物材料，不仅为细胞生长提供结构支撑，还主动刺激有效的骨愈合所需的再生过程。3D打印技术在制备水凝胶支架方面具有显著优势，能够精确控制支架架构，并以空间可控的方式结合生物活性分子[17]。这种精确性在骨组织工程中尤为重要，因为支架的架构会影响细胞行为和组织形成。使用3D打印技术设计和制备具有复杂几何形状的个性化支架，进一步增强了这种方法的临床相关性[18]。本研究利用3D打印技术制备了含有白藜芦醇的GelMA/PEGDA水凝胶，开发出具有优化机械性能和生物活性的支架，用于骨再生应用。

本研究旨在评估GelMA/PEGDA@Res水凝胶通过SIRT1介导的血管生成和骨生成促进骨再生的潜力。假设水凝胶中的白藜芦醇控制释放将激活周围细胞中的SIRT1，从而增强血管化和骨形成。为了验证这一假设，进行了一系列体外和体内实验。

**2. 材料与方法**
**2.1. 可3D打印GelMA/PEGDA@Res水凝胶的制备**
首先，按照先前报道的协议通过明胶的甲基丙烯酸化反应合成GelMA[19]。简要来说，将明胶（10% w/v，Sigma）与甲基丙烯酸酐（8% v/v）在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中于50℃下搅拌2小时。甲基丙烯酸化程度通过1H NMR测定为80%。为了制备3D打印生物墨水，将GelMA溶解在去离子水中，浓度为10%（w/v），同时加入0.5%（w/v）的PEGDA作为交联剂和0.1%（w/v）的光引发剂Irgacure 2959。混合物在37℃下搅拌直至完全溶解。使用数字光处理（DLP）3D打印机进行打印，层切片厚度为100 μm。打印后，将结构浸入浓度为1 mg/mL的白藜芦醇（Res）水溶液中24小时，使Res负载到聚合物网络中。

3D打印的GelMA/PEGDA和GelMA/PEGDA@Res水凝胶的孔隙率根据结构设计参数和基于图像的分析进行定量评估。首先根据预定义的CAD模型估计打印支架的宏观孔隙率，孔隙率计算为孔体积与总支架体积的比率。此外，通过分析SEM图像进一步量化水凝胶的有效孔隙率。冷冻干燥的水凝胶样品进行成像，并使用ImageJ软件处理代表性横截面SEM图像。通过阈值处理图像并测量孔面积与总面积的比率来计算孔面积分数，以此作为支架孔隙率的近似值。每组至少分析三个独立样本，最终孔隙率值表示为平均值±标准偏差。

**2.2. 人脐静脉内皮细胞（HUVECs）培养**
从中国武汉的HYcell生物技术有限公司获取第3代HUVECs，用于血管生成实验。这些细胞在专门的HUVEC细胞培养基（GIBCO，HYcell，中国）中在受控条件下培养。具体来说，细胞在37°C、5% CO2的培养箱中维持以支持最佳生长和功能。

**2.3. 细胞活力检测**
通常将HUVECs以每孔2 × 10?个细胞的密度接种到24孔板的水凝胶支架上，并在37°C、5% CO2的培养箱中培养。使用CCK-8测定法评估细胞活力。此外，使用Calcein-AM和碘化丙啶（PI）进行活/死细胞染色，并在荧光显微镜下观察结果。所有实验重复三次以确保可重复性。

**2.4. 管状形成测定**
为了评估离子对血管生成的影响，进行了管状形成测定。将Matrigel加入24孔板中，于37°C下聚合30分钟。然后将HUVECs以每孔2 × 10?个细胞的密度接种到Matrigel涂层的板上，并与水凝胶支架提取物一起培养。使用ImageJ软件量化管状形成参数，所有实验重复三次以确保一致性。

**2.5. 5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EDU）测定**
首先在96孔板中接种HUVECs，让其附着并生长至约60-70%的汇合度。细胞准备好后，将水凝胶加入培养基中。处理一段时间后，将胸苷类似物EDU引入培养基。细胞与EDU一起孵育，使其在细胞增殖期间掺入新合成的DNA中。孵育后，用甲醛固定细胞并使其通透以便检测。然后进行点击化学反应，将荧光叠氮化合物与掺入的EDU共价连接，以实现可视化。用DAPI对细胞进行复染以标记细胞核，并使用荧光显微镜观察荧光。掺入EDU的增殖细胞会显示明亮荧光，而非增殖细胞则不会。计算EDU阳性细胞与总细胞的比率以量化增殖情况。实验重复三次以确保准确性，以便比较不同水凝胶对HUVEC增殖的影响。

**2.6. Transwell迁移测定**
使用Transwell腔室，其中含有允许细胞通过的孔洞。将HUVECs接种在Transwell插片的上层腔室中，通常使用无血清培养基以减少外部迁移信号。在下层腔室中加入含有不同水凝胶提取物的培养基，创建趋化梯度以促进细胞迁移。设置于37°C、5% CO2下孵育24小时，以允许迁移。孵育后，用棉签清除留在膜上表面的细胞。穿过孔洞并附着在膜下表面的细胞用甲醛固定并用结晶紫染色，以便观察细胞。然后在显微镜下观察细胞并计数迁移的细胞数量。比较结果以确定每种水凝胶对HUVEC迁移的影响，实验通常重复三次以确保可重复性。

**2.7. 骨缺损模型**
体重在220至250克之间的雄性SD大鼠接受颅骨手术，暴露骨头并用钻头创建5毫米的全层缺损。为了确保缺损区域干净，用无菌生理盐水冲洗每个缺损部位，然后在水凝胶支架植入缺损处。

**2.8. 微计算机断层扫描（micro-CT）检查**
在植入后6周和12周进行micro-CT扫描。动物安乐死后，收集颅骨组织进行分析。这些组织用4%甲醛固定，然后用PBS冲洗。使用micro-CT系统（SkyScan 1276，Bruker，德国）进行成像。扫描后生成图像的3D重建。测量并分析每个组的关键骨再生参数，包括骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb.N）（每个时间点每个样本n = 3）。

**2.9. 组织学染色**
micro-CT扫描后，将颅骨样品浸入EDTA溶液中脱钙。然后对组织切片进行脱蜡，并进行苏木精和伊红（H&E）染色。此外，还进行了CD31的免疫荧光分析以进一步评估样品。

**2.10. 统计分析**
数据以平均值±标准偏差（SD）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）评估统计显著性，随后进行Tukey多重比较测试。统计分析使用SPSS 19.0软件进行，显著性水平设定为*p < 0.05和**p < 0.01**。

**3. 结果与讨论**
**3.1. GelMA/PEGDA@Res水凝胶的设计与制备**
GelMA/PEGDA水凝胶支架的制备过程如图1A所示。可3D打印的GelMA/PEGDA@Res水凝胶的制备是一个多步骤过程，旨在结合GelMA的生物活性与PEGDA的机械强度和打印性能，同时将Res作为治疗剂加入。水凝胶通过配备紫外光源的3D打印机打印，逐层聚合形成稳定的、可定制的水凝胶支架。所得GelMA/PEGDA@Res水凝胶结合了生物相容性、机械支撑和治疗效果，使其成为骨愈合等组织再生应用的有前景的材料。水凝胶支架具有螺旋几何形状，如图1A所示。3D结构的尺寸如图1A所示。支架的宏观多孔3D结构在图1A-C中展示，这突显了该方法的成功实施。扫描电子显微镜（SEM）被用来进一步表征支架的微孔形态，如图2所示。SEM图像显示了一个组织良好、相互连接的网络结构，支架内部没有明显的塌陷或变形。打印水凝胶的孔径约为500微米，接近设计尺寸，这有助于促进细胞迁移和在整个支架中的细胞生长。药物分子的加入并没有显著改变打印水凝胶的孔隙率。

图1. GelMA/PEGDA@Res水凝胶的制备过程及原理示意图。下载高分辨率图像（781KB）下载全尺寸图像

图2. 3D打印的GelMA/PEGDA@Res水凝胶的生物相容性。(A-B) 不同水凝胶组处理的细胞的活/死细胞染色结果。(C) 通过CCK8测定法评估不同处理组的细胞存活率。数据以平均值±标准差表示，样本量为n=3。*表示与对照组有显著差异。

为了进一步了解GelMA/PEGDA水凝胶的微观形态，还对冷冻干燥的未打印水凝胶进行了SEM分析。如图1D所示，这种水凝胶具有高度的孔隙率，孔径约为250微米。较小的孔径也有利于细胞的有效迁移，使细胞能够渗透到水凝胶的内部区域。随后通过UV聚合GelMA/PEGDA混合物评估了GelMA/PEGDA水凝胶的凝胶化能力，如图1E所示，显示出很强的凝胶化行为。这表明该配方具有理想的交联特性，适合用于组织工程应用，因为水凝胶必须在生理条件下保持其结构完整性。

使用流变仪检查了水凝胶的流变特性，以比较3D打印和未打印的GelMA/PEGDA水凝胶的行为。如图1F所示，两种类型的水凝胶支架表现出相似的流变特性，表明其机械性能相当。3D打印样品的储能模量（G'）略高，约为28 kPa，而未打印样品的储能模量约为22 kPa。这表明打印过程略微提高了支架的硬度，可能是由于更明确的结构排列。在整个频率范围内，两种类型水凝胶的储能模量（G'）都显著大于损耗模量（G''），证实形成了弹性水凝胶网络。较高的储能模量值表明其具有强烈的弹性行为，这对于在生理负载条件下保持支架的机械完整性至关重要。

图1G显示了水凝胶支架的机械性能在压缩测试中的表现。GelMA/PEGDA支架的压缩强度约为563 kPa。同样，加载了Res的GelMA/PEGDA水凝胶支架的压缩强度为466 kPa。负载的GelMA/PEGDA网络良好的机械性能和灵活性在组织工程应用中具有优势，使得支架能够在不损害其结构完整性的情况下更好地适应机械变形。

最后，评估了加载了Res的水凝胶支架的药物释放曲线。如图1H所示，该水凝胶支架能够持续释放Res，释放高峰大约在7小时后达到。达到这个峰值后，水凝胶支架在25小时内保持了有效的药物浓度，表明该系统非常适合需要长期药物释放的应用。支架的控制释放行为可以归因于其明确的孔结构和交联密度，这些因素调节了药物分子从水凝胶基质的扩散。

总之，通过3D打印制备的GelMA/PEGDA水凝胶支架显示出高度有序的多孔结构，这一点通过SEM分析得到了证实。支架的孔径和相互连接的架构有利于细胞迁移和组织生长，使其成为再生医学应用的一个有希望的候选者。在负载药物后，孔径基本保持不变，保留了支架的整体结构特性及其支持细胞活动的能力。水凝胶的机械性能，包括压缩强度和断裂应变，突显了其在需要刚性和灵活性的环境中的适用性。此外，流变分析表明，打印的水凝胶形成了一个稳定的三维网络，这对于在体内保持其功能至关重要。持续的 drug 释放曲线进一步增强了支架的潜力，实现了可控和长期的药物治疗。

确保生物支架的最佳生物相容性是临床成功的关键。本研究使用活/死细胞染色检测方法评估了GelMA/PEGDA和GelMA/PEGDA@Res水凝胶的体外生物相容性。结果表明，这两种水凝胶配方支持的细胞存活率与对照组相当，处理组之间没有统计学上的显著差异。这些发现表明，这些水凝胶不会引起细胞毒性作用，并且能够维持有利于细胞生存的细胞环境。

为了进一步证实这些结果，使用了CCK-8检测法来评估随时间变化的细胞增殖情况。结果显示，培养在这些水凝胶支架中的细胞在第1天、第3天和第5天的存活率保持一致。这些时间点上的细胞稳定增殖表明，GelMA/PEGDA和GelMA/PEGDA@Res为细胞生长和代谢活动提供了支持性框架。

实验组之间相当的细胞存活率和增殖情况，通过活/死细胞染色和CCK-8检测法得到证实，强调了这些水凝胶的有利生物相容性。这对于它们在组织工程应用中的潜在用途至关重要，因为它确保了支架能够有效地与周围组织整合，而不会引起不良的生物反应。这些支架不仅支持细胞存活，还促进细胞的一致增殖，从而加强了它们进一步生物学和临床探索的适用性。

为了进一步阐明GelMA/PEGDA@Res水凝胶的生物功能性，进行了一系列体外实验来评估其对HUVECs（人脐静脉内皮细胞）的影响。这些研究关注水凝胶增强细胞增殖、迁移和血管生成的能力，这些都是组织再生的关键因素。第一个实验使用EDU免疫荧光染色检测方法评估了GelMA/PEGDA@Res水凝胶对HUVECs增殖能力的影响。这种方法可以检测新合成的DNA，从而准确反映细胞增殖情况。如图3A-B所示，与对照组和仅用GelMA/PEGDA水凝胶处理的组相比，用GelMA/PEGDA@Res水凝胶处理的HUVECs表现出明显的增殖增加。统计分析显示组间存在显著差异，表明将Res加入水凝胶基质显著增强了支架的生物活性。这一观察结果与Res作为一种已知具有促进细胞增殖的生物活性分子的文献记载一致，Res通过其抗氧化和抗炎特性促进细胞增殖。假设Res的加入可能通过调节这些信号通路来创造一个有利于内皮细胞增殖的微环境，从而提高水凝胶的整体再生潜力。虽然需要使用特定的炎症模型进一步研究来确认这些通路在当前系统中的情况，但我们的结果与普遍认识一致，即Res介导的氧化应激减轻支持组织再生。

在第二组实验中，使用Transwell迁移检测法评估了HUVECs的迁移能力。迁移是伤口愈合和组织再生的关键步骤，因为内皮细胞必须迁移到损伤部位形成新的血管。结果清楚地表明，GelMA/PEGDA@Res水凝胶显著提高了HUVECs的迁移能力，与对照组和GelMA/PEGDA水凝胶组相比（图3C-D）。在GelMA/PEGDA@Res处理的细胞中观察到的增强迁移可能是由于水凝胶的结构支持与Res的生物活性的协同作用。白藜芦醇已被证明可以影响多个促进细胞迁移的通路，包括激活内皮一氧化氮合成酶（eNOS）和上调血管内皮生长因子（VEGF），这两者对内皮细胞迁移至关重要。这些发现表明，GelMA/PEGDA@Res水凝胶不仅为细胞附着提供了物理支架，还积极促进了细胞功能，这些功能对组织修复至关重要。

除了促进细胞增殖和迁移外，组织再生的一个关键方面是新血管的形成，即血管生成。使用管形成检测法评估了水凝胶的血管生成潜力，这是一种广泛用于评估内皮细胞形成类似毛细血管结构能力的体外方法。如图3E-F所示，用GelMA/PEGDA@Res水凝胶处理的HUVECs显示出比对照组和GelMA/PEGDA组更显著的管形成。这表明，将Res加入水凝胶基质增强了其血管生成特性，可能是通过调节促血管生成因子（如VEGF）来实现的。血管生成是一个复杂的过程，涉及内皮细胞的增殖、迁移和分化，而Res已被证明在这些过程中起着关键作用。通过增强VEGF表达并促进PI3K/AKT和MAPK/ERK通路的激活，Res可能有助于协调细胞活动，从而促进强大的血管生成。GelMA/PEGDA@Res水凝胶支持内皮细胞增殖、迁移和管形成的能力使其成为组织再生应用中的有希望的候选者，特别是在缺血或血管受损的环境中。

这些检测的综合结果强调了GelMA/PEGDA@Res水凝胶的多功能特性。虽然GelMA/PEGDA的结构特性为细胞附着和生长提供了支持性框架，但Res的加入显著增强了支架的生物活性。白藜芦醇的抗氧化、抗炎和促血管生成特性有助于水凝胶促进关键细胞功能，如增殖、迁移和血管生成，这对有效的组织修复和再生至关重要。

先前的研究已经强调了SIRT1信号通路作为Res促血管生成效应的关键调节器的重要性。基于这一知识，本研究旨在探讨GelMA/PEGDA@Res水凝胶是否会影响HUVECs中的SIRT1表达，并确定这一通路在促进内皮细胞功能（如增殖、迁移和管形成）中的作用。为了探索GelMA/PEGDA@Res水凝胶对SIRT1表达的影响，采用了Western blot (WB) 分析方法。该方法提供了不同水凝胶处理的HUVECs中SIRT1蛋白水平的定量数据。结果如图4A所示，与对照组和GelMA/PEGDA组相比，用GelMA/PEGDA@Res水凝胶处理的细胞显示出SIRT1的显著上调。这一发现表明，将白藜芦醇纳入GelMA/PEGDA基质中增强了SIRT1的活性，这可能是早期实验中观察到的细胞功能改善的原因。SIRT1表达的增加与白藜芦醇通过SIRT1相关途径调节细胞应激反应、代谢调节和线粒体功能的已知作用一致[22] [23]。考虑到SIRT1在促进血管生成、抑制炎症和支持血管稳态方面的积极作用[24] [25]，其在内皮细胞中活性的增强尤为重要。下载：下载高分辨率图像（689KB）下载：下载全尺寸图像图4. SIRT1信号通路参与调控GelMA/PEGDA@Res水凝胶的效果。(A) 采用Western blot检测不同组中的SIRT1水平。(B-C) 对不同水凝胶组处理的细胞进行EDU染色。(D-E) 进行Transwell迁移实验以评估不同组中HUVECs的迁移能力。(F-G) 对不同水凝胶组处理的细胞进行管状结构形成实验。数据以平均值±标准差表示，样本量为n=3。*表示与对照组有显著差异。为了进一步研究SIRT1在GelMA/PEGDA@Res水凝胶生物学效应中的机制作用，采用了小干扰RNA（siRNA）技术来下调HUVECs中的SIRT1表达。这种方法使得可以评估观察到的促血管生成效应是否直接由SIRT1信号通路介导。为了验证SIRT1下调的有效性，使用Western blot检测了SIRT1的表达水平。如补充图S3所示，siRNA-SIRT1组与对照组和siRNA-NC组相比，SIRT1蛋白和mRNA的表达均显著降低，证实了SIRT1下调模型的成功建立。SIRT1下调后，使用EDU免疫荧光实验检测了HUVECs的增殖情况。如图4B-C所示，当SIRT1被沉默时，GelMA/PEGDA@Res水凝胶的促增殖效果部分减弱。这一发现证实SIRT1在内皮细胞中介导白藜芦醇的增殖效应中起重要作用，可能是通过其对关键调节通路（如FOXO和p53）的影响，这些通路参与细胞周期调节和细胞凋亡。接下来使用Transwell迁移实验评估了SIRT1在内皮细胞迁移中的作用，这是血管生成的关键步骤。与增殖结果类似，SIRT1在HUVECs中的下调导致GelMA/PEGDA@Res水凝胶的促迁移效果部分减弱（图4D-E）。内皮细胞的迁移和形成新血管的能力对于伤口愈合和组织再生至关重要，而SIRT1已被证明通过调节细胞骨架动态和焦点粘附更新来调节这一过程。具体来说，SIRT1可以增强eNOS的表达，eNOS是内皮细胞迁移和血管生成的关键调节因子[26]。此外，SIRT1抑制炎症信号通路（如NF-κB）的能力进一步支持其在促进有利于细胞迁移的微环境中的作用。这些发现强调了SIRT1在调节白藜芦醇促迁移效应中的关键作用，并强调了在开发用于组织再生的先进水凝胶时针对这一通路的重要性。最后，使用管状结构形成实验评估了GelMA/PEGDA@Res水凝胶的血管生成潜力。如图4F-G所示，SIRT1下调导致HUVECs形成管状结构的能力显著减弱，尽管GelMA/PEGDA@Res水凝胶仍显示出一定程度的血管生成活性。这种管状结构形成的部分减弱突显了SIRT1对血管生成过程的显著贡献，可能是通过其调节关键促血管生成因子（如VEGF）以及参与内皮细胞存活和分化的通路。此外，在没有SIRT1的情况下观察到的残留血管生成活性表明，白藜芦醇可能通过替代通路（如AMPK或其他sirtuin家族成员的激活）发挥额外效应，这些通路也已知会影响血管生成。3.5. 使用GelMA/PEGDA@Res水凝胶进行体内骨再生使用大鼠的5毫米颅骨缺损模型评估了GelMA/PEGDA@Res水凝胶的体内成骨潜力。这个关键大小的缺损模型用于评估水凝胶在6周和12周内的骨再生能力。通过微计算机断层扫描（micro-CT）和组织学分析来捕获骨修复过程的结构和组织水平信息。在未接受水凝胶支架的对照组中，观察到几乎没有骨再生，这表明大尺寸颅骨缺损的自修复能力较差。这种缺乏自我修复的能力突显了在这种情况下需要支持性生物材料来促进骨再生的必要性（图5A）。下载：下载高分辨率图像（649KB）下载：下载全尺寸图像图5. 体内评估3D打印水凝胶的骨再生效果。(A) 在手术后6周和12周分别拍摄了用水凝胶支架处理的颅骨缺损的micro-CT图像，比例尺表示2毫米。(B) 使用micro-CT在手术后6周和12周量化新形成的骨的骨体积分数（BV/TV%）和（C）小梁数目（Tb.N）。(D) 在这些时间点进行了H&E染色以分析组织。数据以平均值±标准差表示，样本量为n=3。*表示与对照组有显著差异。相比之下，接受水凝胶支架处理的组显示出显著的新骨形成，其中GelMA/PEGDA@Res水凝胶显示出最明显的放射学改善（图5A）。Micro-CT成像显示新骨从缺损边缘开始生长并向中心延伸，GelMA/PEGDA@Res支架在促进骨再生方面优于GelMA/PEGDA支架和对照组。这种增强的成骨活性通过骨体积与总组织体积（BV/TV）和小梁数目（Tb.N）等微架构参数进行量化，这些都是骨质量和密度的关键指标。如图5B-C所示，植入12周后，所有支架处理组的新骨形成量均显著增加，其中GelMA/PEGDA@Res组具有最高的BV/TV和Tb.N值。这些发现表明，GelMA/PEGDA@Res水凝胶比其他治疗组促进更快、更强的骨再生。GelMA/PEGDA@Res的优越性能可归因于白藜芦醇的协同效应，已知白藜芦醇通过多种机制增强成骨作用。白藜芦醇激活SIRT1通路，促进成骨细胞分化并抑制破骨细胞活性[27] [28]。此外，它还参与刺激血管生成，这对于向再生组织提供营养和氧气至关重要。GelMA/PEGDA的支架特性与白藜芦醇的生物学活性的结合可能解释了该组中观察到的加速骨形成。组织学分析进一步支持了micro-CT的结果。使用H&E染色来观察缺损部位内新形成的骨（图5D）。在GelMA/PEGDA@Res水凝胶组中，缺损区域被新组织填充，矿化骨组织沿着支架表面生长。这与对照组形成鲜明对比，在对照组中只有稀疏的纤维组织，表明在没有支架的情况下新骨形成极少。这些结果证实，在关键大小的缺损中，支架对于骨再生至关重要，因为缺乏此类支持会严重限制身体修复受损区域的能力。此外，组织学数据显示所有支架处理组的新骨组织都随时间增加，其中GelMA/PEGDA@Res水凝胶组显示出最显著的骨生长。这不仅表明了水凝胶支架的成骨传导性能，还表明它们能够随时间维持有利于骨生长的环境。GelMA/PEGDA@Res水凝胶中观察到的增强骨再生主要归因于血管生成驱动的成骨作用。水凝胶为细胞浸润提供了支持性支架，而局部释放的白藜芦醇增强了内皮细胞的增殖、迁移和管状结构形成，从而促进了缺损内的血管化。这种血管生成微环境促进了体内成骨前体细胞的募集和分化，导致骨形成和重塑的加速。重要的是，这些结果证明了不依赖体外成骨诱导实验的血管生成介导的骨再生效果的有效性。3.6. GelMA/PEGDA@Res水凝胶在体内增强血管生成为了评估GelMA/PEGDA@Res水凝胶的血管生成潜力，进行了免疫组化分析以量化CD31的表达，CD31是内皮细胞的关键标志物。血管生成，即新血管的形成，对于有效的骨再生至关重要，因为它与成骨作用密切相关。CD31是内皮细胞表面表达的关键蛋白质，是组织内血管化的宝贵指标[29]。图6A-C所示的结果表明，在应用GelMA/PEGDA@Res水凝胶处理后的6周和12周，CD31表达显著增加。这种强烈的CD31染色表明水凝胶在长时间内促进血管生成的效果。血管生成的增强，如CD31水平的升高所示，对于骨再生至关重要，因为它有助于向再生组织输送必要的营养和氧气。这一过程不仅支持新形成骨组织的存活，还有助于促成成骨分化和骨形成。下载：下载高分辨率图像（584KB）下载：下载全尺寸图像图6. 植入骨中血管化的免疫组化分析。(A-B) 分别在6周（A）和12周（B）通过免疫荧光分析评估CD31表达水平，阳性染色显示为骨隧道内的棕色细胞，如放大图像所示。(C) 进行CD31表达水平的定量分析以衡量血管化的程度。(D-F) 分析关键血液参数，包括红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）和白细胞（WBC）。数据以平均值±标准差表示，样本量为n=3。*表示与对照组有显著差异。CD31表达的显著增加强调了GelMA/PEGDA@Res水凝胶诱导有利血管生成反应的能力，这是骨修复策略成功的关键组成部分。通过改善对再生组织的血液供应，水凝胶创造了最佳环境，增强了成骨活性并支持骨再生疗法的整体效果。除了其血管生成能力外，还通过对关键血液参数（包括红细胞计数（RBC）、血红蛋白（HGB）和白细胞计数（WBC）的分析，彻底评估了GelMA/PEGDA@Res水凝胶的安全性。结果显示这些血液标志物保持在正常生理范围内，表明该水凝胶不会引起任何显著的系统不良反应（图6D-F）。这一发现对于确保水凝胶不仅有效而且适合临床使用至关重要，因为这保证了材料不会引发不必要的免疫反应或破坏正常的生理过程[30]。4. 结论含有白藜芦醇的3D打印GelMA/PEGDA水凝胶的开发和评估代表了骨组织工程的重大进展。这项研究表明，GelMA/PEGDA@Res水凝胶通过SIRT1激活有效地整合了血管生成和成骨的关键过程，使其成为骨再生应用的有希望的候选者。体外结果表明，该水凝胶提供了有利于细胞生长和分化的生物相容性基质。白藜芦醇的掺入显著增强了血管生成因子的表达，促进了水凝胶基质内的血管化。这些结果强调了GelMA/PEGDA@Res水凝胶通过创造促进新血管形成和骨形成的环境来支持和刺激骨组织再生的潜力。使用大鼠颅骨缺损模型进行的体内实验进一步验证了该水凝胶在加速骨愈合方面的有效性。在治疗的大鼠中观察到的血管化增强和骨组织再生加速现象，突显了这种水凝胶能够以可控方式释放白藜芦醇的能力，从而激活SIRT1并促进对骨骼修复至关重要的再生过程。这项工作不仅为设计兼具结构支撑和活性治疗功能的多功能生物材料提供了一种新策略，还强调了将药物递送与组织工程相结合以应对复杂再生挑战的潜力。3D打印技术在创建具有可控生物活性和机械特性的患者特异性支架方面的成功应用，标志着再生医学领域的一项重大进步。尽管本研究取得了令人鼓舞的结果，但仍需承认一些局限性。首先，虽然已经表征了GelMA/PEGDA@Res水凝胶中白藜芦醇的体外释放特性，但尚未进行全面的体内药代动力学分析。由于该水凝胶旨在局部作用于骨缺损部位，系统药代动力学测量可能无法完全反映局部药物的可利用性；不过，未来的研究将致力于量化体内白藜芦醇的时间和空间分布，以支持其转化应用。其次，虽然我们的工作显示了体内通过血管生成促进的骨再生，但尚未直接进行使用间充质干细胞（MSCs）或成骨细胞的体外成骨分化实验。功能性体内结果表明血管生成可促进成骨前体细胞的招募和骨形成，但未来的实验将采用基于MSC的成骨测定方法或内皮细胞与MSC的共同培养系统，以更深入地探讨血管生成与成骨之间的相互作用机制。第三，本研究并未对水凝胶的降解特性进行彻底研究。理想的骨再生支架应具备“支撑-降解”协同效应：在早期修复阶段维持结构完整性以引导组织再生，同时通过可控降解逐渐代谢，避免长期残留物引起的异物反应，并为新骨生长和功能重塑预留空间。后续研究将对比分析水凝胶的机械特性和降解行为。通过结合体外酶解、体内残留支架的定量检测以及材料成分调节，可以明确交联密度和GelMA/PEGDA比例对降解速率的调控机制。随后将优化配方，以实现机械支撑与降解速率的精确匹配，确保支架在整个骨修复周期内保持结构稳定性并促进组织整合。然而，也应认识到目前的体内研究样本量较少（n = 3），监测时间较短（6–12周），这可能限制了对支架长期稳定性、降解动力学和组织整合能力的全面评估。未来需要更大样本量和更长时间观察的研究来全面评估该水凝胶的性能并支持其转化潜力。最后，尽管SIRT1敲低实验表明水凝胶的促血管生成效应依赖于SIRT1，但下游信号通路和关键血管生成因子尚未直接测量。未来的研究将包括对这些分子的定量分析，以完全阐明SIRT1介导的血管生成机制。

**作者贡献声明：**
- 张航：撰写——审稿与编辑、验证、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。
- 詹灵露：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学、实验设计、数据分析、数据管理。
- 郭梦佳：撰写——审稿与编辑、软件使用、数据分析、数据管理。
- 余涛：撰写——审稿与编辑、资源获取、实验设计、数据分析、概念构思。
- 刘伟才：撰写——审稿与编辑、软件使用、方法学、实验设计、数据分析。
- 李琼：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、资金申请、数据分析、概念构思。
- 陈广权：撰写——审稿与编辑、资源获取、实验设计、数据分析、概念构思。