《Integrative Zoology》：Snake Gut Microbiota as a Source of Anti-Inflammatory Probiotics: Isolation and Functional Characterization of Two Novel Strains
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肠道微生物组是宿主生理稳态的基础，而其平衡状态的偏离与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发生密切相关。为解决传统抗生素疗法的局限性，本研究以蛇肠道微生物群作为抗炎益生菌的新型来源，对五步蛇（Deinagkistrodo
肠道微生物组是宿主生理稳态的基础，而其平衡状态的偏离与炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）的发生密切相关。为解决传统抗生素疗法的局限性，本研究以蛇肠道微生物群作为抗炎益生菌的新型来源，对五步蛇（Deinagkistrodon acutus）、环纹华游蛇（Trimerodytes annularis）、华游蛇（Trimerodytes percarinatus）、赤链蛇（Lycodon rufozonatus）和福建竹叶青蛇（Trimeresurus stejnegeri）五种蛇类的肠道微生物组进行了宏基因组测序。群落组成分析显示，门水平的主要类群为变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinomycetota）和厚壁菌门（Firmicutes）。研究人员进一步检测到包括肠球菌属（Enterococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）在内的潜在益生菌物种。从196株分离菌株中，研究人员通过严格的体外安全性与功能性评估——包括酸耐受性、胆盐耐受性、病原体抑制能力和粘附能力筛选，最终获得约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）DA0116和罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）DA0218两株候选菌株。在葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）诱导的小鼠结肠炎模型中，两株菌株均显著降低了疾病活动指数（disease activity index，DAI）、促炎细胞因子（肿瘤坏死因子-α[TNF-α]、白细胞介素-6[IL-6]和白细胞介素-8[IL-8]）水平，并恢复了肠道微生物群的多样性。此外，全基因组分析鉴定到细菌素合成基因簇（gassericin-S/T）和碳水化合物代谢相关基因，解释了其抗菌与免疫调节特性的分子基础。该研究不仅强调了爬行动物肠道微生物群在益生菌开发领域的未挖掘潜力，还为IBD治疗和功能性食品应用提供了两株具有治疗前景的候选菌株。
论文解读
炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是一类以肠道慢性炎症为核心特征的消化系统疾病，其发病与肠道微生物群失调存在明确关联。传统抗生素治疗IBD虽可短期控制症状，但易进一步加剧菌群紊乱，诱发抗生素相关性腹泻并加速细菌耐药性的产生，因此亟需开发安全有效的抗生素替代策略。益生菌可通过调节肠道微生态平衡、调控宿主免疫反应缓解肠道炎症，已在IBD干预中展现出应用潜力。现有益生菌资源主要来源于哺乳动物肠道，而爬行动物在长期演化过程中形成了适应极端环境的独特免疫系统与共生微生物组，其肠道微生物可能携带特殊的益生菌功能基因，但目前针对蛇类肠道益生菌的分离与功能评价研究十分匮乏。为此，研究人员以五种蛇类为研究对象，系统挖掘其肠道微生物组的益生菌资源，相关研究发表于《Integrative Zoology》。
研究人员共采用四类关键技术方法：首先采集安徽黄山地区11份五种蛇类的肠道内容物样本作为研究队列；其次通过宏基因组测序解析蛇肠道微生物组的群落组成，结合传统分离培养技术获得肠道菌株，并通过溶血试验、药敏试验、胃肠液耐受试验、病原菌抑制试验及细胞粘附试验完成体外益生菌特性筛选；随后构建DSS诱导的小鼠结肠炎模型，通过疾病活动指数评分、脏器指数测定、组织病理学检查及血清炎症因子检测评价候选菌株的体内治疗效果，同时结合16S rRNA测序分析其对小鼠肠道菌群的调节作用；最后对候选菌株进行全基因组测序，通过功能数据库注释解析其益生特性的遗传基础。
3.1 蛇肠道微生物组揭示候选益生菌物种
研究人员对五种蛇类的11份肠道内容物样本进行宏基因组测序，共获得59.11 Gb过滤后清洁数据，注释到4界82门143纲289目639科2252属6963种微生物，其中细菌占比95.46%。门水平优势类群为变形菌门（58.78%）、拟杆菌门（29.41%）、放线菌门（3.31%）和厚壁菌门（2.42%）。针对具有益生菌开发潜力的厚壁菌门进一步分析发现，其优势科为毛螺菌科（Lachnospiraceae，41.25%）、梭菌科（Clostridiaceae，18.15%），优势属包括肠闭球菌属（Enterocloster，11.38%）、梭菌属（Clostridium，10.71%）；同时检测到乳球菌属（Lactococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）和粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）等潜在益生菌类群，其中乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）相对丰度最高（10.93%），约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）是乳杆菌属的优势种（0.69%），罗伊氏粘液乳杆菌（Limosilactobacillus reuteri）是粘液乳杆菌属的优势种（1.53%）。
3.2 蛇肠道益生菌候选株的分离与鉴定
研究人员从上述蛇类肠道样本中分离得到196株菌株，经物种鉴定排除36株致病株（包括禽肠球菌Enterococcus avium、萨丁岛梭菌Clostridium sardiniense、巴氏梭菌Clostridium baratii），剩余160株具有益生菌潜力的菌株进入后续筛选流程，涵盖屎肠球菌（Enterococcus faecalis，91株）、海氏肠球菌（Enterococcus hirae，23株）、约氏乳杆菌（20株）、罗伊氏粘液乳杆菌（16株）、乳酸乳球菌（4株）、粪乳杆菌（Ligilactobacillus faecis，5株）和粪肠球菌（Enterococcus faecium，1株）。
3.3 两株新型益生菌的筛选
研究人员首先对160株候选菌进行溶血试验，仅海氏肠球菌SA0102表现出α-溶血活性，其余159株无溶血活性；药敏试验进一步筛选出86株对8种抗生素高度敏感的菌株。随后通过酸（pH 1.5~3.0）、胆盐（0.3%~1.0%）耐受试验及模拟胃肠液耐受试验，获得32株可在pH 3.0和0.3%胆盐条件下生长且胃肠液存活率优于鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）的菌株；该32株菌均对大肠杆菌、副伤寒沙门氏菌B型、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾志贺氏菌和肠炎耶尔森氏菌七种肠道病原菌具有抑制作用，多数菌株对沙门氏菌属和志贺氏菌属的抑制能力强于LGG。选取其中12株胃肠适应性和抗菌活性最优的菌株进行HT-29细胞粘附能力评估，其中7株粘附率显著高于LGG，包括4株罗伊氏粘液乳杆菌（DA0204、DA0218、DA0212、DA0208）、2株粪乳杆菌（DA0214、DA0202）和1株约氏乳杆菌（DA0116）。综合各项指标排除功能缺陷菌株后，最终选择约氏乳杆菌DA0116、罗伊氏粘液乳杆菌DA0218和粪乳杆菌DA0202进行HT-29细胞抗增殖与促凋亡效应评价。结果显示三株菌的发酵上清均能显著降低HT-29细胞活力，抑制细胞增殖与集落形成，升高细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平并诱导细胞凋亡，其中DA0218的抑癌效应最为显著。结合体外安全性与功能表现，最终确定约氏乳杆菌DA0116和罗伊氏粘液乳杆菌DA0218为最优益生菌候选株，用于后续体内实验与基因组分析。
3.4 两株益生菌缓解DSS诱导的小鼠结肠炎症状
研究人员将4周龄雄性昆明小鼠随机分为对照组（CK）、DSS模型组、DA0116干预组和DA0218干预组，每组6只。DSS组及两个干预组自实验第8天起饮用含4% DSS的水构建结肠炎模型，干预组同时每日灌胃对应菌株悬液（1.0×109CFU/mL），对照组与模型组灌胃等量生理盐水。结果显示：模型组自第10天起疾病活动指数（DAI）显著升高，而DA0116组和DA0218组的DAI与对照组无显著差异，且在第10~13天显著低于模型组，其中DA0218的症状缓解效果更优。脏器指数与结肠长度检测显示，模型组脾指数升高、肝指数降低、结肠长度缩短，而两个干预组的脏器指数与结肠长度均与对照组无显著差异，且DA0116组的肝指数和结肠长度显著优于模型组。组织病理学结果显示模型组结肠黏膜结构破坏、隐窝结构紊乱，而干预组结肠病变较模型组明显减轻。血清炎症因子检测显示，模型组TNF-α、IL-10、IL-1β、IL-6、IL-8水平均显著升高，而两个干预组的五类炎症因子水平均恢复至接近对照组水平，且显著低于模型组。
3.5 益生菌影响结肠炎小鼠的肠道微生物组
研究人员对实验第1、8、15天的小鼠粪便进行16S rRNA测序，分析肠道菌群变化。α多样性分析显示，实验第1天模型组Shannon指数显著低于对照组和DA0218组；第15天DA0116组的Chao1和ACE指数显著高于模型组。β多样性分析显示，实验第1天各组菌群结构无显著差异，第8天和第15天各组菌群结构出现显著分化，且第15天的组间差异更为明显。扩增子序列变体（amplicon sequence variant，ASV）分析表明，各组共有ASV数量呈先下降后上升趋势，DA0116干预初期增加菌群丰富度、后期降低丰富度，DA0218干预初期降低菌群丰富度、后期增加丰富度。菌群组成分析显示，DSS处理导致模型组厚壁菌门相对丰度升高、拟杆菌门相对丰度降低、弯曲杆菌门（Campylobacterota）显著变化，而DA0116干预可回调上述异常变化的菌群类群，DA0218干预则特异性富集毛螺螺菌科（Lachnospiraceae）等有益类群。线性判别分析效应量（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析显示，结肠炎小鼠的特征菌群为副普雷沃氏菌属（Paraprevotella）和Turicibacter属，DA0116干预后乳杆菌属（Lactobacillus）、粘液乳杆菌属（Limosilactobacillus）和链球菌属（Streptococcus）显著富集，DA0218干预后粘螺旋菌属（Mucispirillum）显著富集。
3.6 两株菌株的基因组特征
全基因组测序显示，约氏乳杆菌DA0116基因组包含1842个蛋白编码基因和107个非编码RNA，罗伊氏粘液乳杆菌DA0218包含2123个蛋白编码基因和128个非编码RNA。平均核苷酸一致性（average nucleotide identity，ANI）分析显示，DA0116与大鼠粪便来源的约氏乳杆菌N6.2亲缘关系最近（ANI=90.31），DA0218与珍珠粟发酵液及黑线姬鼠来源的罗伊氏粘液乳杆菌亲缘关系最近（ANI=92.06~92.28）。功能注释结果显示，两株菌的基因功能均以代谢、信息储存与加工、细胞过程与信号通路为主；碳水化合物活性酶（carbohydrate-active enzyme，CAZy）注释显示两株菌均富含糖苷水解酶（glycoside hydrolase，GH），DA0116的碳水化合物酯酶（carbohydrate esterase，CE）和辅助活性模块（auxiliary activities，AA）占比更高，DA0218的糖基转移酶（glycosyl transferase，GT）和碳水化合物结合模块（carbohydrate-binding module，CBM）占比更高。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析显示，两株菌的核心功能均为碳水化合物代谢，DA0116侧重半乳糖代谢、糖酵解、丙酮酸代谢等通路，DA0218侧重丙酮酸代谢、磷酸戊糖途径等通路。综合抗生素耐药基因数据库（Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD）注释显示，两株菌均携带与万古霉素耐药相关的vanT基因，DA0218额外携带与消毒剂耐药相关的qacJ基因，但耐药基因与数据库的序列相似度仅为33.42%~33.70%，提示实际耐药风险较低。次级代谢产物生物合成基因簇（biosynthetic gene cluster，BGC）预测显示，DA0116含有gassericin-S和gassericin-T两类细菌素合成基因簇，DA0218含有gassericin-T合成基因簇，这与其体外广谱抗菌活性直接相关。
讨论部分指出，蛇肠道微生物组的组成具有物种特异性，本研究在五种蛇类中均检测到多个潜在益生菌类群，其中肠球菌属的分离比例最高，与宏基因组测序的丰度结果一致。体内实验证实两株候选菌可通过调节肠道菌群结构、降低全身炎症水平缓解DSS诱导的结肠炎，其效果与既往报道的乳杆菌属益生菌作用机制一致。肠道菌群分析显示，益生菌干预后结肠炎小鼠的菌群结构向健康状态恢复，特征有益菌如产短链脂肪酸的Kineothrix属、Adlercreutzia属及毛螺菌科显著富集，而结肠炎相关致病菌如Paraprevotella属、Turicibacter属的丰度显著降低。基因组分析进一步揭示了两株菌的益生特性分子基础：丰富的碳水化合物代谢基因支持其在肠道环境中的定植与生长，gassericin-S/T细菌素合成基因簇赋予其广谱抗菌能力，可针对性抑制蛇肠道高丰度的沙门氏菌属病原体。本研究首次证实蛇肠道是新型益生菌的重要来源，为IBD治疗和功能性食品开发提供了新的候选菌株。
结论部分指出，本研究首次探索蛇肠道微生物群作为具有抗炎特性的新型益生菌资源库，通过宏基因组筛选与功能验证，确定了约氏乳杆菌DA0116和罗伊氏粘液乳杆菌DA0218两株优质候选菌株。两株菌均表现出优异的胃肠液耐受性、广谱抗病原菌活性，可通过降低DAI评分和促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-8）水平缓解DSS诱导的结肠炎，其作用机制与富集产短链脂肪酸菌、合成gassericin-S/T细菌素直接相关。该发现不仅推进了对爬行动物宿主-微生物共演化的认知，也为IBD靶向疗法和益生菌功能性食品开发提供了基础。未来研究需聚焦于两株菌的临床转化与安全性评价，特别是针对其携带的万古霉素耐药基因开展风险评估，同时通过模拟复发疾病的循环DSS给药模型验证其长期保护效力。
