综述：miRNA生物标志物及其在结核病诊断中的分子作用

《Medicine in Omics》：miRNA biomarkers and their molecular role in tuberculosis diagnosis

　　普里扬卡·古哈（Priyanka Guha）| 克里希纳·潘迪（Krishna Pandey）| 阿比克·森（Abhik Sen）| 萨米尔·丁格拉（Sameer Dhingra）
印度比哈尔邦瓦伊沙利区哈吉普尔（Hajipur）国家制药教育与研究所药学实践系

**摘要**
微生物利用宿主的微小RNA（miRNA）来逃避免疫反应并建立慢性感染。miRNA是一种小型非编码RNA，在转录后调节基因表达，从而影响宿主与病原体的相互作用。结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）和其他细胞内病原体能够逃避宿主免疫，在巨噬细胞内存活。结核病患者中miRNA表达的失调与疾病进展、免疫调节及治疗结果有关，可作为潜在的生物标志物。生物传感器技术成为快速、敏感检测这些生物标志物的有力工具。基于miRNA的诊断方法为结核病（TB）的精准医疗提供了有前景的途径。本文通过阐述miRNA在帮助病原体逃避宿主免疫方面的机制作用，并结合新兴的生物传感器技术评估其作为诊断生物标志物的潜力，突出了miRNA在结核病中的双重作用。尽管取得了这些进展，但仍存在挑战，如不同人群中miRNA表达的差异以及需要大规模临床验证，这突显了将基于miRNA的诊断方法转化为常规临床实践的必要性。

**1. 引言**
细胞内病原体是一类多样化的微生物，包括病毒、寄生虫和细菌，它们在宿主细胞内生存。由于它们位于宿主细胞内部，因此可以利用宿主的细胞机制进行生存和繁殖，而不会被体液免疫系统或补体蛋白识别[1]。
miRNA是宿主重要的调控分子之一，它在宿主对抗细胞内病原体的防御中发挥作用。成熟的miRNA长度约为21个核苷酸，通过降解目标mRNA或阻止其翻译来调控转录后的基因表达[2]。
最早观察到miRNA在宿主-病原体相互作用中的作用是在病毒中[3]。病原体会利用自身的分子或改变宿主的miRNA表达，以创造有利于自身复制的环境。HIV-1通过调节宿主miRNA来维持其在CD4+ T细胞中的潜伏状态，从而逃避免疫系统检测[4]；而疱疹病毒则编码自身的miRNA（如miR-K12-7和miR-155）以逃避免疫，从而促进其持续存在[5]。这些关于病毒感染中miRNA调节的早期观察结果有助于理解细胞内细菌病原体如何操纵宿主的miRNA通路。
首次记录到细菌感染过程中miRNA调控的证据是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）感染假单胞菌（Pseudomonas syringae）后发现的。研究发现，受感染时上调的miR-393a直接靶向植物防御的负调节因子——生长素受体[6]。随后在哺乳动物系统中的研究表明，脂多糖（LPS）会改变宿主免疫细胞的miRNA谱型，进而影响细菌感染的过程[7]。与健康个体相比，病理状态下miRNA的表达差异可以作为预测幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和结核分枝杆菌（Mtb）引起的疾病的参数[8]。
结核分枝杆菌通过抑制吞噬体-溶酶体融合及抵抗巨噬细胞产生的抗菌防御机制来存活。为了维持其在细胞内的持久存在，结核分枝杆菌会操纵宿主的免疫反应，而miRNA在此过程中起关键作用[9]。据报道，在结核菌感染过程中，miR-155和miR-423-5p等miRNA对宿主免疫逃逸具有重要意义，从而促进了结核病的慢性化[10]。

目前结核病的诊断方法包括体外培养、显微镜检查和基于核酸的技术。然而，这些方法存在样本处理复杂、检测时间长以及需要专业人员的局限性[11]。亟需快速、准确且易于使用的诊断技术。结合生物传感器技术的miRNA检测方法有望满足这一需求。近年来，生物信息学在推进miRNA研究方面发挥了重要作用，尤其是在确定miRNA序列及其靶标相互作用、以及它们在疾病机制中的作用方面。数据库平台（如miRBase）为miRNA调控网络的绘制及其对基因表达的影响提供了丰富的资源[12]。此外，生物信息学还帮助处理与临床数据相关的生物传感器数据，以提高诊断效果并全面了解患者健康状况。

**2. 细胞内病原体对宿主miRNA的调控**
病原体的成功在很大程度上取决于其抑制免疫反应并在宿主细胞内存活的能力[13]。在原生动物感染（如利什曼原虫（Leishmania spp.）、弓形虫（Toxoplasma gondii）、克鲁兹锥虫（Trypanosoma cruzi）和疟原虫（Plasmodium spp.）中，miRNA已成为免疫逃逸的关键调节因子。利什曼原虫通过多种机制逃避免疫反应，例如通过抑制硝酸盐的产生（硝酸盐对杀死寄生虫至关重要）[14]；它还通过干扰宿主的miRNA处理机制（特别是Dicer1核酸酶）来逃避免疫系统[15]。同样，在弓形虫感染中，miR-146a在调节免疫反应中起关键作用。缺乏miR-146a的小鼠对更具毒性的弓形虫株具有抗性，表明这种miRNA被病原体用来维持其存活[16]。在克鲁兹锥虫感染中，miR-146b和miR-21的表达变化与疾病的严重程度相关，进而影响查加斯病（Chagas disease）中的寄生虫血症和心脏受累情况[17]。
病毒（如乙型肝炎病毒HBV、丙型肝炎病毒HCV和人类免疫缺陷病毒HIV）也会影响宿主miRNA的调控。对于HBV和HCV，研究表明miR-210、miR-122和miR-345-3p与疾病进展、纤维化和肝细胞癌（HCC）有关[16]。尤其是miR-122在HBV和HCV患者中过度表达，其表达与病毒复制和肝损伤呈正相关[16]。其他miRNA（如miR-20a和miR-92a）也被发现参与HCV感染引起的纤维化和肝硬化[16, 17]。在HIV中，某些miRNA（如miR-29a和miR-155）参与调节病毒复制和免疫细胞反应，帮助病毒逃避免疫系统的检测并持续存在于宿主体内[18]。
细胞内细菌病原体也利用miRNA调控来促进自身存活。例如，在单核细胞增生李斯特菌感染中，miR-155和miR-146b在巨噬细胞和上皮细胞中上调，调节免疫反应和炎症[19]。这些miRNA影响细胞因子的产生和免疫细胞的募集，对宿主的防御至关重要。然而，李斯特菌通过效应蛋白listeriolysin（LLO）操纵这些通路，逃避吞噬作用并存活于宿主体内[20]。在弗朗西斯菌（Francisella）感染中，miR-155上调巨噬细胞的炎症反应，从而帮助病原体在宿主细胞内存活[20]。

在结核菌感染期间，结核分枝杆菌通过调控miRNA来促进其在巨噬细胞和其他免疫细胞中的存活，利用自噬、凋亡和免疫信号通路[21]。研究表明，多种miRNA（如miR-223、miR-29a和miR-155）在结核病患者中表达差异，并与活动性肺结核相关[21]。为了识别结核病的生物标志物，我们必须了解miRNA如何调节宿主-病原体相互作用。

**3. 支持结核分枝杆菌存活和持续存在的宿主调控机制**
在结核分枝杆菌感染过程中，自噬作为一种防御机制，试图将细菌从宿主细胞中清除。结核分枝杆菌通过受体介导的内吞作用附着在宿主细胞表面的甘露糖受体上并进入巨噬细胞或吞噬细胞。进入细胞后，细菌阻止未成熟的吞噬体与溶酶体融合，从而避开杀灭它的空泡。结核分枝杆菌会消耗宿主细胞中的大分子，以支持其在细胞内的生存和复制[22]。
结核菌感染期间的自噬过程受到miRNA的严格调控（见图1）。感染结核分枝杆菌的人类单核细胞和巨噬细胞表达水平升高的miR-144*，该miRNA靶向关键的自噬诱导基因DRAM2（Damage-Regulated Autophagy Modulator 2）的3′-非翻译区（3′-UTR），抑制DRAM2的表达会减弱自噬活性，帮助结核分枝杆菌逃避宿主防御[22]。更重要的是，结核病患者的PBMC（外周血单核细胞）中miR-144的表达显著高于对照组[23, 24, 25]。其他miRNA（如miR-125a-3p和miR-155）也与结核菌感染期间的自噬调控有关。miR-125a-3p与UV Radiation Resistance Associated Gene（UVRAG）结合，抑制自噬；而miR-155靶向自噬相关基因Atg7，抑制自噬溶酶体的融合[26, 27]。结核菌感染会增加miR-33和miR-33*的水平，这两者会抑制重要的自噬效应器和转录因子[28]。自噬活性的抑制增加了宿主细胞内的脂质积累，为结核分枝杆菌的存活提供了有利环境。缺乏miR-33的小鼠中结核分枝杆菌的清除率更高，表明miRNA在调节自噬反应中起作用[29]。这些策略表明自噬过程的反应性被调整，从而优化了结核病的治疗效果。

**图1. 结核分枝杆菌感染期间miRNA介导的宿主免疫反应调控**
该示意图展示了宿主miRNA如何调节关键免疫通路，促进结核分枝杆菌在巨噬细胞内的生存。miR-144*和miR-125a通过靶向DRAM2和UVRAG抑制自噬，导致吞噬体形成减少和细菌清除受损；miR-223和miR-155通过调节FOXO3抑制巨噬细胞凋亡，延长受感染巨噬细胞的存活时间。此外，miR-26a通过靶向KLF4促进M2型巨噬细胞的极化，使巨噬细胞向抗炎表型转变，有利于细菌的持续存在。miR-21通过抑制IL-12介导的Th1免疫反应，减弱促炎反应[30]。这些miRNA驱动的机制共同促进了结核分枝杆菌在宿主巨噬细胞内的存活。

**图2. 结核病中参与宿主免疫逃逸的miRNA及其靶基因网络图**
巨噬细胞中的凋亡已被证明是防止结核菌感染扩散的重要机制[30]。结核分枝杆菌通过分泌抑制巨噬细胞凋亡的蛋白质来逃避凋亡。在活动性结核病患者中，miR-223上调，通过调节促进细胞死亡的转录因子FOXO3来抑制凋亡[31]。miR-155也被发现通过靶向FOXO3来抑制单核细胞的凋亡[32]。高水平的miR-155与结核菌感染巨噬细胞中较低的硝酸盐（NO）水平相关，导致细菌无法被有效清除[33]。
虽然结核分枝杆菌通过调控miRNA来抑制自噬和凋亡，但它也通过影响免疫反应过程中的巨噬细胞极化来发挥作用（见图1）。巨噬细胞分化为M1型或M2型：M1型巨噬细胞具有促炎性，能产生清除细菌所需的活性氮和氧物种；而M2型巨噬细胞则减少炎症并促进组织修复，为结核分枝杆菌的存活创造有利环境[34]。在结核菌感染期间，miR-26a的表达下降与上调的转录因子KLF4相关，后者介导M2型巨噬细胞的极化[35]。这种向M2型巨噬细胞的转变削弱了清除结核菌所需的促炎反应，使其得以持续存在。

这些miRNA介导的调控机制表明，结核分枝杆菌通过协调宿主免疫反应来确保其在细胞内的存活。多种miRNA同时抑制巨噬细胞中的关键抗菌通路。例如，miR-144*和miR-125a通过靶向DRAM2和UVRAG干扰自噬；miR-223和miR-155通过调节FOXO3信号通路抑制凋亡[23, 24, 25, 26, 27]。此外，miR-26a促进M2型巨噬细胞的极化，使免疫环境向有利于细菌存活的抗炎表型转变。这些由miRNA驱动的调控网络共同促成了免疫逃逸和持续性感染[35]。新的证据还表明，宿主的miRNA可能通过肠道-肺部轴参与系统的免疫通信。肠道微生物群组成的改变可以影响循环中的miRNA谱型，并调节肺部微环境中的炎症信号通路。在结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）感染期间，肠道微生物群与肺部免疫反应之间的这种相互作用可能影响巨噬细胞的激活、细胞因子的产生以及宿主对感染的易感性[36]。尽管这一领域仍在积极研究之中，但考虑到肠道-肺部轴为理解调控宿主-病原体相互作用的复杂网络提供了额外的见解。在Mtb感染期间的免疫调节主要由促炎的Th1反应和抗炎的Th2反应完成，这些反应受到miRNA的高度调控，miRNA调节细胞因子的产生，从而影响Th1和Th2活性之间的平衡[37]。Th1反应通过产生促炎细胞因子在抵抗Mtb的免疫防御中起重要作用。干扰素-γ（IFN-γ）是一种关键的Th1细胞因子，它激活巨噬细胞以破坏细胞内的Mtb，并通过增加抗原的呈现来诱导适应性免疫反应[38]。然而，Mtb通过诱导CD4+ T细胞中的miR-29来调节IFN-γ，从而削弱T细胞对巨噬细胞的活性，进而扰乱免疫系统控制Mtb的能力[39]。同样，T细胞中的miR-144的存在会抑制IFN-γ和TNF-α的产生，导致T细胞增殖和Th1反应受到抑制[40]。miR-144介导的IFN-γ产生减少会损害免疫系统清除感染的能力，突显了miRNA在调节Th1细胞因子产生中的重要性。Mtb可以通过多种miRNA来调节TNF-α的产生，从而调控Th1反应。Mtb脂寡糖成分调节的miR-155稳定了TNF-α mRNA，从而改变TNF-α的产生并增强对控制Mtb感染至关重要的炎症环境[41]。Mtb还在受感染的巨噬细胞中上调miR-223以抑制TNF-α的产生，使Mtb能够下调炎症反应，防止过度的免疫激活，这可能有助于其清除[42]。此外，miR-99b也在Mtb感染的巨噬细胞和树突状细胞（DCs）中过表达。miR-99b还抑制TNF-α和TNFRSF-4的表达，导致促炎细胞因子的产生减少[43]。因此，在Mtb感染期间不同miRNA对TNF-α的差异调节确保了其存活。除了这些Th1细胞因子外，IL-12、IL-23和IL-27的功能在有效调节适应性免疫中也是不可或缺的。IL-12由巨噬细胞和DCs分泌，它诱导幼稚T细胞分化为分泌IFN-γ的Th1细胞。相反，miR-21抑制IL-12p35，从而对Th1极化产生负面影响，促进Mtb的存活[44]。IL-23促进Th17细胞的分化，招募中性粒细胞以维持肉芽肿的稳定性，但IL-23的强烈活性可能对炎症有害[45]。IL-27增强Th1反应，并通过诱导抗炎细胞因子（如IL-10）发挥抗炎作用，而IL-10的表达受到miR-21的调节，从而促进细菌的存活[46]。同样，Th17分化和急性期诱导的细胞因子IL-6也受到miR-155的调节，miR-155具有促炎和调控作用[47]。与Th17亚群相关的最相关细胞因子如IL-17和IL-22招募中性粒细胞并维持上皮屏障的完整性。IL-17在早期感染期间支持肉芽肿的形成，但过高的水平可能导致慢性感染期间的组织损伤。IL-22通过增强抗菌防御来补充IL-17的作用，其表达受到miR-326等miRNA的影响[48]。此外，通过炎性体（inflammasomes）启动的促炎细胞因子如IL-1β和IL-18对抵抗TB的免疫也很重要。IL-1β将免疫细胞带到感染部位，同时增强巨噬细胞的杀菌活性，而IL-18与IL-12协同作用产生IFN-γ。相反，Mtb通过miR-223来操纵这些细胞因子，以控制炎症[49]。Th2反应在TB中具有独特的抗炎细胞因子作用，可以抑制过度的炎症并防止组织损伤。然而，高水平的Th2会抑制Th1反应，使免疫系统清除Mtb的能力降低[50]。病原体Mtb利用这种平衡，改变某些控制Th2细胞因子产生的miRNA的表达，从而使其有利于自身。IL-10属于抗炎细胞因子家族，在Th2反应中起主要作用，可以抑制促炎细胞因子的产生并减少巨噬细胞的激活。已知Mtb通过利用miRNA来调节IL-10的表达，进一步调节免疫反应向Th2表型的偏移[51]。在Mtb感染期间，某些免疫细胞中miR-146a的过表达被证明通过调节IRAK1和TRAF6等中心信号分子来抑制TNF-α的表达。这导致IL-10产生的抑制，因为这有助于创造一个有利于Mtb持续存在的抗炎环境[52]。IL-10对miR-155具有抑制作用，并降低促炎细胞因子的水平。Mtb上调IL-10是一种将其免疫反应向Th2型转变的方法，减少Th1驱动的抗菌活性[53]。转化生长因子-β（TGF-β）是另一种负责调节TB免疫反应的细胞因子。虽然TGF-β可以抑制过度的组织损伤，但其过表达已被证明会抑制Th1反应，从而使Mtb能够逃避免疫系统[54]。Mtb感染会诱导miR-27a的表达，该miRNA针对TLR3信号通路中的关键接头蛋白TICAM1。miR-27a对TICAM1的抑制间接导致TGF-β的产生，同时抑制Th1通路，从而调节免疫反应向Th2型转变，支持Mtb的持续存在[55]。因此，Mtb通过调节促炎和抗炎信号之间的平衡来创造有利于其生存的环境。有趣的是，Mtb与宿主细胞miRNA的相互作用已被认为是逃避免疫检测和病原体在宿主体内长期存活的重要机制。表1列出了参与免疫调节、凋亡和炎症的miRNA及其在结核感染期间宿主-病原体相互作用和免疫逃逸中的作用。这些研究还有助于设计基于miRNA的诊断生物标志物，以评估感染状态和治疗效果。

表1. Mirnas及其在宿主免疫反应中的作用

功能 miRNA 目标分子 研究物种 细胞/组织类型 参考文献

凋亡 miR-145 TRAF6 鼠 干细胞 [56]
let-7 Caspase 3 人 单核细胞衍生的巨噬细胞

miR-29a Caspase 7 人 单核细胞衍生的巨噬细胞

miR-155 FOXO3 人 单核细胞

miR-20a-5p JNK-2 人 巨噬细胞

miR-21 Bcl-2 鼠 RAW264.7巨噬细胞

细胞因子调节 miR-144 IFN-γ, TNF-α 人 全血 [56]
miR-146a IRAK-1/TRAF-6通路 鼠 RAW264.7巨噬细胞

miR-146a TNF-α 人 肺泡巨噬细胞

miR-223 CXCL2, CCL3, IL-6 鼠 miR-223缺陷小鼠 J774A.1, 原代巨噬细胞

miR-125b TNF 人 单核细胞衍生的巨噬细胞

miR-27a IRAK4 人 THP-1细胞

miR-27a IL-10, TAB2 鼠 RAW264.7, BMDM

miR-27a, miR-27b IRF4（计算） Computational TargetScan数据库

一氧化氮抑制 miR-146a NF-κB, MAPK 鼠 RAW264.7巨噬细胞 [57]

细菌存活 miR-155 SHIP1/Akt通路 鼠 巨噬细胞

自噬 miR-155 Rheb 鼠 RAW264.7, BMDM

吞噬作用 miR-142-3p N-Wasp 人, 鼠 J774A.1, 原代巨噬细胞

吞噬体成熟 miR-15a, miR-21-3p, miR-22-3p, miR-23a, miR-30b-5p, miR-142-5p Rab蛋白家族 牛 肺泡巨噬细胞 [59]

抗原呈递 miR-38 1-3p CD1c, T细胞反应 人 树突状细胞

在这篇综述中，我们生成了一个网络图，展示了某些miRNA与参与结核病宿主免疫逃逸机制的相应靶基因之间的相互作用，如图3所示。为了构建miRNA-靶标相互作用网络，使用miRNet 2.0平台分析了选定的miRNA，这是一个用于miRNA功能分析和可视化的集成Web工具。miRNet汇编了来自TarBase v9.0的实验验证和预测的miRNA-靶标相互作用。然后，将识别的miRNA-基因相互作用可视化为一个相互作用网络，以说明关键miRNA及其与结核分枝杆菌感染期间免疫调节和宿主-病原体相互作用相关的靶基因之间的调控关系[61],[62]。网络分析是使用miRNet中的人类相互作用数据集和默认的置信参数进行的，只有由实验验证的数据库支持的相互作用才被考虑用于可视化。我们使用了文献中证明参与自噬、凋亡调节和TB感染期间炎症反应过程的miRNA。miR-21、miR-22和let-7b与其靶基因的映射表明，M. tuberculosis可能调控多个通路以逃避免疫系统的识别。

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图3. 通过has-mir-21参与结核病的关键通路和分子功能的基因本体富集分析

如图3所示，hsa-miR-21与多个基因相互作用，包括PTEN、STAT3和DAXX。miR-21下调PDCD4，使Mtb能够通过防止凋亡而逃避宿主的清除，从而在宿主细胞内存活。通常，在结核病患者中，miR-21的过表达会导致PTEN的抑制。PTEN是一种公认的肿瘤抑制基因，在免疫调节中也起着重要作用[63]。这种抑制也可能帮助Mycobacterium tuberculosis通过抑制宿主的反应而存活。此外，STAT3是一种参与炎症信号通路的转录因子[64]。因此，STAT3与miR-21的相互作用表明miR-21可能控制结核感染期间的炎症活动。与DAXX（死亡相关蛋白）的相互作用表明，miR-21也可以在控制凋亡中发挥作用，在结核病中很重要，因为Mycobacterium tuberculosis可以防止受损细胞死亡并在细胞内存活[65]。此外，hsa-miR-22已被证明参与免疫细胞的分化和功能，这对结核病很重要。它与PPARA的相互作用表明miR-22可能参与脂质代谢和免疫细胞功能，而PPARA参与巨噬细胞激活和结核病肉芽肿中的脂质处理[66]。miR-22的另一个靶标是ESR1，即雌激素受体基因。这种预测性相互作用表明miR-22在结核感染期间的激素调节免疫反应中起作用[67],[68]。在我们的分析中，hsa-let-7b被证明可以调节包括CDK6、HMGA2和LIN28B在内的靶基因，这些基因与细胞周期调节和细胞分化有关。在结核病中，miR-let-7b可能在宿主调节免疫激活与过度炎症之间达到最佳平衡方面发挥作用。miR-let-7b通过靶向HMGA2和LIN28（两者都与细胞分化和生长相关）可能影响免疫细胞的激活和分化，特别是巨噬细胞和T细胞。周期依赖性激酶6参与细胞周期进展，let-7b的调节可能在控制结核感染期间巨噬细胞在肉芽肿内的增殖中起关键作用[69]。接下来，为了进一步了解has-mir-21、has-mir-22和has-let-7b调控的通路，我们对图3中识别的基因进行了基因本体分析。这种分析反映了参与结核病进展和治疗结果的细胞和分子机制中的基因作用。基因本体分析揭示了包括miR-21、miR-22和let-7b在内的microRNAs在调节对结核病发病机制至关重要的细胞过程中的作用。GO（基因本体）分析揭示了与预测的miRNA靶基因相关的生物过程、分子功能和细胞通路。图4、图5和图6中的GO结果突出显示了与结核病发病机制相关的几个通路，包括免疫信号、炎症反应、细胞周期调节、凋亡和巨噬细胞激活。这些通路在结核分枝杆菌感染期间的宿主-病原体相互作用中起着关键作用。例如，炎症信号通路的调节可能影响细胞因子的产生和免疫细胞的招募，而凋亡和细胞存活通路的调节可能使受感染的巨噬细胞成为细菌持续存在的细胞内储存库。因此，富集的GO通路进一步支持这些miRNA在调节宿主免疫反应和塑造结核病进展中的功能作用。

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图4. 通过has-mir-22参与结核病的关键通路和分子功能的基因本体富集分析

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图5. 通过has-let-7b参与结核病的关键通路和分子功能的基因本体富集分析

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图6. 细胞内细菌和病毒的Venn图分析显示了分子特征的重叠区域。独特的miRNA生物标志物在结核病（24）、HIV（19）、肝炎（13）和幽门螺杆菌感染（18）中有所发现。miR-21已被发现参与免疫调节、纤维化和组织重塑。它调节如TGF-β信号通路，这些通路影响免疫反应、巨噬细胞激活和结核病中的肉芽肿形成。此外，miR-21还参与DNA修复、细胞周期调节和凋亡，帮助受感染细胞适应压力并抵抗免疫介导的清除[70],[71]。其对细胞外基质重塑和巨噬细胞迁移的影响可能会进一步影响结核病的进展，如图3所示。另一方面，miR-22调节在结核病感染期间的染色质重塑、转录和免疫反应。miR-22可能调控参与免疫抑制、DNA损伤反应和纤维化的关键转录因子和途径。miR-22对类固醇激素信号传导（如雌二醇反应）的调控会影响免疫细胞的活性，从而可能影响结核病的易感性。它还调节细胞周期和凋亡，控制免疫细胞的增殖以及受感染巨噬细胞的命运[72]。其在紧密连接和上皮重塑过程中的作用表明，它在结核病感染期间维持上皮屏障完整性和肉芽肿形成中发挥作用，如图4所示。let-7b微RNA调控参与细胞因子产生、巨噬细胞功能和炎症的基因，这些在结核病的免疫反应中至关重要[73]。此外，其对紧密连接和染色质结构调控的影响突显了其在结核病感染期间维持组织完整性和免疫反应中的作用，如图5所示。总的来说，这些microRNA（miR-21、miR-22和let-7b）作为免疫反应、组织重塑和细胞存活的关键调节因子，影响着宿主的防御机制和Mtb的存活。has-mir-21、has-mir-22和has-let-7b的表达谱可以反映结核病的进展和免疫调节情况，使其在结核病诊断、治疗监测和疾病预后预测中具有价值。这些microRNA为结核病管理的治疗策略提供了有希望的目标。

在临床实践中，区分潜伏性结核病（LTBI）和活动性结核病（active TB）仍然具有挑战性，因此特征性的microRNA表达谱被认为对此很有帮助。一些microRNA仅在活动性结核病中表现出独特且独有的上调，例如miR-424-5p、miR-365a-3p、miR-144-3p、miR-223-3p和miR-451a-5p。研究发现，与LTBI和健康对照组相比，miR-21-5p和miR-29a-3p在活动性结核病中表达上调[74]，这表明这些microRNA可能用于活动性结核病的检测，从而有助于区分不同情况并避免LTBI患者的经济负担。尽管miR-21、miR-155和miR-223等microRNA被一致报道为潜在的结核病生物标志物，但它们的表达模式可能因不同研究和患者群体而异[74]。一些研究观察到这些microRNA在活动性结核病患者中上调，而其他研究则根据疾病阶段、宿主免疫状态和样本类型观察到不同的表达情况。遗传背景、环境暴露以及样本处理和microRNA定量方法的差异可能是造成这些差异的原因。因此，需要在不同人群中进行进一步的大规模验证研究，以确定可靠的结核病诊断microRNA标志物。一些microRNA显示出作为结核病治疗反应监测生物标志物的潜力。在有效的治疗过程中，与活动性疾病相关的microRNA（如miR-21-5p、146b-3p和miR-92a-3p）的表达水平会随着疾病恢复而降低[75]。其他microRNA（如miR-320a和miR-155）在耐药性和敏感型结核病菌株中的表达不同，可能有助于早期识别耐药性菌株[76]。最近的研究发现了一些特定的microRNA标志物，包括let-7a-5p、miR-196b-5p和miR-589-5p，这些标志物与疾病进展和恢复有关，可以作为评估治疗效果和治疗干预的证据[77]。除了血液外，还在结核病患者的其他体液中（如胸腔液体、痰液、尿液和呼出气体冷凝液（EBC）中检测到了多个microRNA，反映了它们作为诊断和治疗监测生物标志物的潜力。例如，miR-3615、miR-320c、miR-205-5p和miR-135a-5p在胸腔液体中的表达存在差异[78]。miR-200家族靶向ZEB1/ZEB2并调节上皮-间充质转变（EMT），这在结核病期间的组织重塑中起关键作用[79]。miR-147在痰液中上调，并以其抗炎特性而闻名[80]，而miR-625-3p和miR-155在尿液中也上调[81]。miR-649、miR-1264和miR-574-5p在EBC中被检测到，其中miR-1264靶向DNA甲基转移酶-1，后者参与基因表达调控[82]。这些microRNA表明使用基于体液的microRNA标志物可以增强结核病的诊断和治疗监测。

我们主要关注基于血液的microRNA生物标志物，因为它能全面反映与结核病相关的系统免疫反应和炎症过程。与其他体液相比，血液易于收集、储存和处理，而且microRNA提取和定量方法确保了结果的可重复性，从而为确定它们在结核病检测、疾病监测和治疗反应评估中的潜力奠定了基础。这使基于血液的microRNA成为结核病生物标志物研究中最实际和有效的选择。表1中列出的microRNA在调节免疫反应、促进病原体存活和影响疾病进展方面起着关键作用。只有少数几种microRNA同时存在于由细胞内病原体引起的多种疾病中。这些疾病特异性microRNA在宿主体内的调控可能作为细胞内病原体的某些诊断生物标志物，如图6所示。我们使用维恩图分析了细胞内细菌和病毒的分子特征，尽管每种疾病都有其独特的特征和生物标志物，但仍发现了重叠区域。在结核病中发现了24种独特的microRNA，在HIV中发现了19种，在肝炎中发现了13种，在幽门螺杆菌感染中发现了18种。具有相似免疫逃避机制或慢性感染模式的疾病之间的重叠microRNA特征为开发跨疾病诊断或针对共同途径的治疗提供可能性。例如，HIV和结核病之间的共同生物标志物（如miR-155和miR-21）为共感染管理和治疗策略提供了可能性。了解每种疾病的独特标志物将有助于为个性化治疗提供具体的靶点。因此，这种生物标志物的比较有望推动精准医学的发展，从而改善多重感染人群的预后。尽管microRNA作为诊断生物标志物具有巨大潜力，但将其转化为临床实践仍面临一些挑战。microRNA表达谱可能受到共感染（如HIV-TB）以及其他炎症或呼吸系统疾病（如肺炎和肺癌）的影响，这些疾病可能产生重叠的分子特征[83]。此外，人口统计因素（如年龄、遗传背景、环境暴露和地理变异）也可能影响循环microRNA的水平。因此，依赖单一microRNA作为诊断生物标志物可能会导致特异性降低。最近的研究表明，将多个microRNA结合到诊断面板中可以显著提高准确性和疾病区分度[84]。这样的多microRNA标志物有助于区分结核病与其他肺部疾病，并提供更可靠的临床诊断和疾病监测生物标志物。

microRNA的检测方法已经从传统方法发展到先进技术，经历了巨大的改进，从劳动密集型转变为高度敏感、适用于临床和即时检测（POC）的平台[85]。早期方法（包括Northern印迹）提供了组织中microRNA表达的初步视图，但由于需要大量样本且对低丰度microRNA的敏感性有限而受到限制。微阵列通过标记探针与互补microRNA序列的杂交实现了高通量分析，但在敏感性和特异性方面仍存在局限性。新的方法（如qRT-PCR）结合锁定核酸（LNA）修饰和stem-loop引物，大大提高了引物退火和放大效率，特别是对于大约22个核苷酸大小、缺乏poly-(A)尾部的微RNA而言，这些因素限制了引物结合和设计。然而，由于成本效益高和选择性强，qRT-PCR已成为microRNA量化的黄金标准[86]。尽管通过适配器实现了通用的放大策略，但由于序列变异和GC含量变化导致杂交过程中的熔解温度偏差，引物设计仍然具有挑战性[82]。下一代测序（NGS）等技术大大提高了通过高通量分析检测microRNA的能力，并具有非常宽的动态范围。然而，NGS技术价格昂贵且依赖复杂的生物信息学分析，限制了其在常规诊断中的应用[87]。数字液滴PCR（ddPCR）无需标准曲线即可实现绝对定量，并显著提高了对低丰度microRNA的敏感性，但受适当实验室基础设施的限制。Lab-on-chip（LOC）和Lab-on-a-disc（LOAD）系统将样品处理和放大与检测集成在一起，实现了资源有限环境下的快速诊断。微流控纸质分析装置（μPADs）实现了便携、低成本? microRNA诊断，而基于SERS的平台利用拉曼信号放大实现了无标记、高灵敏度的microRNA检测。然而，除了验证和监管批准外，还需要进一步的发展才能实现常规临床应用[89]。使用生物传感器技术检测microRNA面临一些技术挑战。microRNA是非常短的分子（约18-25个核苷酸），这使得探针设计和杂交特异性变得困难[86]。此外，生物流体中的microRNA浓度通常很低，需要高灵敏度的检测方法。另一个挑战是microRNA家族成员之间的序列相似性，即使单个核苷酸的差异也需要准确区分。为克服这些限制，许多生物传感器平台使用信号放大策略（如基于纳米粒子的增强、滚环放大或酶辅助放大）来提高灵敏度和特异性。最近，生物传感器作为一种非常有前途的替代方案出现，因为它们具有高特异性和实时检测Mtb生物标志物的能力[90]。生物传感器技术结合了电化学、光学和质谱传感原理，用于识别特定形式的TB感染生物标志物（蛋白质、脂质和核酸）。表2总结了用于结核病诊断的不同类型的生物传感器及其主要特征。

表2. 不同类型生物传感器的描述。
| 目标生物标志物 | 生物传感器平台 | 转换器/检测策略 | 检测限 | 样本类型 | 主要优势 | 参考文献 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 核酸生物标志物（包括miRNA） | 电化学生物传感器 | 金纳米粒子修饰电极用于核酸杂交 | 需要mM浓度的血清/血浆 | 高灵敏度和快速信号生成 | [93] |
| miR-223 | 石墨烯基电化学生物传感器 | 石墨烯氧化物-金纳米复合材料电极 | 需要mM浓度的血浆 | 由于高导电性和大表面积，可放大信号 | [96] |
| miRNA面板 | 微流控生物传感器 | 基于纸张或CRISPR整合的微流控检测 | 全血/唾液 | 多重检测和即时检测适用性 | [90], [97] |
| 病原体DNA生物标志物 | 光学生物传感器（SPR） | 基于表面等离子体共振的核酸检测 | 唾液 | 无标记实时检测 | [92], [94] |
| 核酸生物标志物 | 纳米 pore生物传感器 | 单分子纳米孔测序 | 单分子 | 血液/唾液 | 直接测序和超高灵敏度 | [98] |

microRNA生物传感器能够同时检测多种生物标志物，因为它们具有更高的灵敏度和特异性，因此确保了更好的准确性和有效性。此外，由于它们适用于即时检测，这些生物传感器速度快、价格便宜且便携。与当前的结核病诊断技术相比，它们在早期检测、高准确性和使用简便性方面具有优势。电化学生物传感器已被开发用于检测与结核病感染相关的miR-223这两种microRNA，它们在免疫失调中起作用。有趣的是，基于AuNPs的生物传感器具有更高的灵敏度，并在临床前研究中显示出有希望的结果，正在进行临床验证。此外，基于石墨烯的microR-223检测生物传感器利用石墨烯的高表面积和电导率，能够在低浓度下特异性区分结核病患者[92]。尽管这些生物传感器的商业化尚未实现，但有几个平台正在快速发展。未来的方向包括开发能够检测多种microRNA（如miR-146a和miR-223）的多路生物传感器，以提高诊断精度。此外，正在探索基于纳米材料的放大方法，以便在低于传统方法的浓度下检测microRNA。基于纳米孔的生物传感器也能够快速、特异性地检测与结核病感染相关的microRNA[93],[94]。这些生物传感器有望在实验室基础设施有限的地区提供即时诊断。这些生物传感器的快速发展有望为全球带来快速、精确、便携和可访问的诊断方法，从而显著改善结核病管理和全球健康结果。尽管许多生物传感器在实验室研究中表现出优异的分析灵敏度，但它们的临床应用仍有限。大多数报道的生物传感器主要在受控的实验条件下使用合成目标进行测试，而不是大型患者群体。生物样本（如血液或痰液）中含有蛋白质、核酸酶和其他可能影响传感器性能的干扰分子。其他挑战包括传感器批次之间的重复性、复杂的样本制备程序以及基于纳米材料平台的成本。因此，在基于miRNA的生物传感器能够常规应用于结核病诊断之前，进行大规模的临床验证研究是必要的。6. 结论：微小RNA（miRNAs）在调节结核分枝杆菌感染期间宿主的免疫反应中起着关键作用，并有助于促进细菌持续存在的免疫逃逸机制。主要的miRNAs如miR-21、miR-155和miR-223通过调控炎症信号通路、巨噬细胞反应和免疫调节参与宿主-病原体相互作用。这些调节功能突显了miRNAs作为结核病诊断和疾病监测的有前景的分子生物标志物的潜力。除了它们的机制作用外，生物传感器技术的进步为快速、灵敏地检测miRNA特征提供了新的机会。将miRNA分析技术与生物传感器平台结合使用可能比传统方法提供更强的诊断能力。然而，还需要进一步的比较临床研究来验证它们的诊断性能，并确立其在常规临床实践中的可靠性。未来的研究应侧重于在不同人群中验证多miRNA生物标志物组合，优化生物传感器集成，并开发多重检测平台以实现准确的即时诊断。这些进展有助于开发更精确和易于获得的诊断策略，以支持全球结核病控制工作。7. 遵守伦理准则：本文基于先前进行的研究，不包含任何作者参与的人类参与者或动物实验的新研究。数据可用性：由于当前研究中未生成或分析任何数据集，因此不适用于数据共享。未引用的参考文献：[91]、[95]。CRediT作者贡献声明：Priyanka Guha：撰写 – 原始草案、软件、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化；Krishna Pandey：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化；Abhik Sen：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、软件、项目管理、方法学、正式分析、概念化；Sameer Dhingra：撰写 – 审稿与编辑、监督、项目管理、方法学、概念化。资金来源：无