通过 Comprehensive Two-Dimensional Chromatography（综合二维色谱法）对初榨 olive oil（初榨橄榄油）中挥发性成分进行分析时，不同顶空预浓缩技术的对比研究

《Microchemical Journal》：Comparison of headspace pre-concentration techniques for volatile profiling of virgin olive oil by comprehensive two-dimensional chromatography

　　**摘要**
本研究比较了三种基于顶空萃取的技术——常规固相微萃取（HS-SPME）、真空辅助SPME（Vac-HS-SPME）和探针型吸附萃取（HiSorb）——用于分析初榨橄榄油（VOO）中的挥发性有机化合物（VOCs）。采用结合非靶向与靶向的GC×GC-MS方法，共检测到34种VOCs。研究发现，Vac-HS-SPME能够更好地回收与氧化和微生物缺陷相关的半挥发性化合物，而这些化合物在HS-SPME和HiSorb中的检出率较低。相反，HS-SPME和HiSorb更倾向于提取与绿色和果香特征相关的低分子量脂氧合酶（LOX）衍生物挥发物，其中HiSorb显示出更广泛的覆盖范围和对醇类及醛类的更强响应。方差分析（ANOVA）和Tukey事后检验（p<0.05）表明，在24种分析物中这三种技术之间存在显著差异。这些发现为橄榄油挥发性成分分析提供了方法层面的见解，并提示靶向顶空萃取技术在质量控制、分类和感官特征描述方面的应用潜力。

**引言**
食品化学学科起源于有机化学逐渐融入食品成分研究的过程，这一趋势在18至19世纪得到了加速发展。然而，直到现代分析技术如质谱（MS）和色谱法的出现，人们才得以更深入地理解食品的组成及其相关过程[1][2][3]。在各种子领域中，挥发性有机化合物（VOCs）的研究——即研究由生物体、生态系统或食品基质产生的挥发性物质——已成为食品安全评估和追溯性的关键所在[4][5]。
该领域的关键技术里程碑是1952年James和Martin发明的气相色谱（GC）[6]。最初，由于填充柱效率低下，GC的发展受到限制；但随着熔融石英毛细管柱的引入，分离性能得到了显著提升。这一进展最终促成了1991年全面二维气相色谱（GC×GC）的诞生[7]。近年来，与质谱联用的GC×GC-MS成为一种强大的分析工具，具有更高的分辨率、峰容量和灵敏度[8]，特别适合分析像初榨橄榄油（VOO）这样复杂的样品[9]，因为其中含有数百种浓度范围广泛（从ng/kg到mg/kg）的化合物及不同官能团。
在地中海饮食中，VOO具有重要意义，其营养价值和独特的感官品质备受推崇，这主要归功于其芳香特性[10][11][12]。这种芳香复杂性由多种因素决定，包括品种、地理来源、成熟度以及加工条件[13][14][15][16][17]。在VOO中发现的数百种挥发物中，通过脂氧合酶（LOX）途径生成的C5和C6化合物在决定其绿色和果香特征方面起着主导作用（例如1-戊烯-3-酮、1-戊烯-3-醇和(E)-己-2-烯醛）。
LOX酶的的表达和活性因品种而异，从而导致不同品种间具有特色的芳香谱型[13][14][15][16][18][19][20][21][22]。除了LOX衍生物外，烃类、萜烯、苯类、呋喃和酯类也进一步丰富了油的芳香特性[22][23][24][25]。另一方面，不希望出现的异味（通常由微生物作用或氧化降解引起）与C7至C11范围内的挥发物相关，如饱和和单不饱和醛、二烯醛、支链醛、羧酸和酮类[13][15][26]。根据欧盟现行法规[27][28]，感官测试仍是VOO品质分类的参考方法。然而，人类感知的复杂性（受多种浓度不同VOCs的影响）给仪器分析带来了挑战，因此需要可靠的技术手段[12][26][27]。
鉴于特级初榨橄榄油（EVOO）的化学和感官复杂性，尤其是单品种样品（它们反映了特定品种的特点并具备独特的追溯潜力[19][21]），选择合适的采样方法至关重要。基于顶空的技术因其简单性、灵敏度和非破坏性而逐渐取代了传统的溶剂萃取方法，尽管分析物的定量过程本身较为复杂[2][11][13][18][22][23][28][29][30][31][32][33][34]。其中，20世纪90年代初引入的顶空固相微萃取（HS-SPME）因其无需溶剂且能浓缩多种挥发物而成为标准方法[33]。不过，HS-SPME存在灵敏度受限和竞争性吸附效应的问题，可能影响某些分析物的萃取效果。为此，研究者开发了具有更强萃取能力的替代方法[32][34][35]，其中真空辅助HS-SPME（Vac-HS-SPME）通过改善萃取动力学（而不影响热力学过程）有望提高低挥发性化合物的萃取效果[31][35][36][37][38][39]。
本文首次系统地对比了三种顶空萃取技术——HS-SPME、Vac-HS-SPME和HiSorb——在初榨橄榄油中的应用效果。实验在受控条件下进行，旨在初步系统地评估这些技术的分析性能。选择34种目标化合物以简化分析过程，重点关注与正负面属性密切相关的化合物。研究从化合物覆盖范围、信号强度和选择性等方面评估了各技术的萃取性能。

**实验方法**
使用标准的正常烷烃混合物（C7–C30，MilliporeSigma?，美国）计算线性保留指数（LRIs）并辅助鉴定潜在峰峰。HS-SPME和Vac-HS-SPME均采用了 divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane (DVB/CAR/PDMS) 50/30 μm 纤维（Supelco?，Bellefonte，PA，美国）；HiSorb探针由Markes International Ltd.（Llantrisant，英国）提供，具有三层涂层结构。

**关于样品体积和真空条件**
尽管先前的研究[13][18][29][50]使用了1克至4.3克的较大样品体积，但本实验基于Mascrez等人的优化条件，选择了0.1克样品[38]。研究表明，超过1.5克的样品体积可能导致顶空饱和，从而影响分析物分布和重复性。由于使用相同的分析平台（Centri 360?）和相似的样品瓶格式，因此采用了该优化的样品体积。

**结论**
本比较研究表明，在减压条件下进行顶空采样（Vac-HS-SPME）能够扩展可检测的挥发性化合物范围，包括半挥发性及与基质相关的化合物，补充了常压技术（HS-SPME、HiSorb）主要检测的早期释放化合物。Vac-HS-SPME对与氧化和变质相关的低挥发性、 late-eluting （后出峰）化合物具有更好的萃取能力；HiSorb则表现出较好的多样性。

**作者贡献**
Irene Digiglio：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、软件应用、方法学设计、数据分析与验证。
Damien Eggermont：撰写、审稿与编辑、原始稿撰写、数据可视化、软件应用、方法学设计、数据分析与验证。
Natasha Damiana Spadafora：撰写、审稿与编辑、软件应用、方法学设计、数据管理及概念构建。
Tommaso Ugolini：资源协调与数据分析。

**利益冲突声明**
作者声明无已知可能影响本文研究的财务冲突或个人关系。

**致谢**
GP、DE和ID感谢Shimadzu、Markes、SepSolve、Restek和Extratech的支持。本研究得到了ACCESSS（分离科学与传感学术卓越中心）的资助，并得到了欧洲化学学会分析化学分部的支持。部分工作基于Sample Preparation Study Group和Network的研究成果。本研究还获得了欧盟下一代EU（PNRR）项目的资助。

**缩写说明**
HS-SPME：常规固相微萃取
Vac-HS-SPME：真空辅助SPME
HiSorb：高吸附萃取
VOCs：挥发性有机化合物
VOO：初榨橄榄油
GC×GC：全面二维气相色谱
SPME：固相微萃取
MS：质谱
LOX：脂氧合酶
EVOO：特级初榨橄榄油
LRIs：线性保留指数
EI：电子撞击
ANOVA：单因素方差分析
HCA：层次聚类分析
CCD：电荷耦合器件