基于三重增强型LIG/PB/PEDOT/Au微电极的无标记、超灵敏H1N1流感病毒免疫传感器

《Microchemical Journal》：Label-free and ultra-sensitive H1N1 influenza virus immunosensor based on a triple-enhanced LIG/PB/PEDOT/Au microelectrode

　　李彦霞 | 余方清 | 李文 | 刘丽萍
福建闽江大学材料与化学工程学院，福州350108，中国

**摘要**
作为季节性流感的主要原因，H1N1病毒需要先进的监测技术。定制图案的导电石墨烯微电极对于构建相关传感平台至关重要。在这项研究中，我们开发了一种基于逐层工程制造的激光诱导石墨烯（LIG）/普鲁士蓝（PB）/3,4-乙烯二氧噻吩（PEDOT）/金（Au）纳米复合微电极的无标记H1N1电化学免疫传感器。与以往仅关注单一成分改性的研究不同，我们的方法整合了多种功能层，以协同提升信号稳定性、灵敏度和抗污染性能。LIG微电极使用低成本智能半导体激光直接在聚酰亚胺（PI）薄膜上形成三电极系统，随后依次沉积PB、PEDOT和金纳米颗粒（Au NPs）。PB作为超灵敏的电化学信号报告剂，而包裹层PEDOT不仅稳定了中性环境中的PB电信号，还显著增强了电极的抗污染性能。为了构建无标记免疫传感器，引入了Au NPs以提高导电性，并通过Au–S–COOH键合实现对H1N1抗体的固定。在最佳条件下，LIG/PB/PEDOT/Au复合电极表现出优异的电化学活性和导电性。所制备的免疫传感器具有从0.1 fg mL?1到100 ng mL?1的宽浓度范围内的超高灵敏度，以及0.063 fg mL?1的极低检测限。结果证实，该免疫传感器具有优异的选择性、精确性和稳定性，因此无需标记探针和样本预处理即可用于复杂生物样本的分析。因此，这种环保且无标记的免疫传感平台代表了即时诊断生物传感技术的重大进展，并在快速现场筛查和预防传染病爆发方面具有巨大潜力。

**引言**
石墨烯是一种二维sp2杂化碳纳米片，仅由一个原子层组成。它最初于2004年通过使用粘合带反复剥离石墨分离得到[1]。由于其独特的性质，如大的比表面积、高电子迁移率、导热性、生物相容性、超低密度和机械柔韧性，石墨烯在光学、电学、化学和物理领域表现出优异的性能[2],[3]。这些独特性质使其在生物传感器[4]、锂离子电池[5]和超级电容器[6]等领域具有广泛的应用前景。早期的高效石墨烯制备方法，如高定向热解石墨（HOPG）的微机械剥离、化学气相沉积（CVD）、外延生长、氧化石墨烯（GO）还原和有机合成等，已被广泛研究和应用[7]。然而，这些技术通常涉及昂贵的仪器、复杂的操作过程和有害环境的试剂[8]，限制了其广泛应用。
当前的研究焦点是直接制备和加工可扩展的基于石墨烯的材料。2014年，James M. Tour团队[9]使用CO2红外激光照射商用聚酰亚胺薄膜，一步制备出具有三维多孔网络结构的石墨烯。其基本原理是激光辐照产生局部高温，破坏CO、CO和NC键，将sp3碳原子转化为sp2杂化碳原子，从而导致原子重新排列形成石墨结构[10],[11]。激光诱导石墨烯（LIG）技术可以将PI基底转化为具有大比表面积、高导电性和生物相容性的三维多孔石墨烯，无需高温或溶剂[12]。因此，激光诱导直接书写技术因其简单性、环保性和易于图案化而在基于石墨烯的材料的制备中得到广泛应用[13],[14]。
2009年全球爆发的A型H1N1流感是由新型猪源性A型H1N1病毒引起的急性呼吸道传染病[15]。最初被称为“猪流感”，后来世界卫生组织（WHO）将其更名为“流感A（H1N1”以避免误解。A型H1N1病毒通过呼吸道飞沫或直接/间接接触在人与人之间快速传播。主要临床症状包括类流感症状；大多数患者表现出发烧、咳嗽和喉咙痛等常见症状，部分患者可能出现腹泻和呕吐[16]。此外，某些病例可能发展成并发症[17]，如肺炎、呼吸衰竭、多器官功能障碍，严重情况下甚至会导致死亡[18]。因此，及时有效地检测A型H1N1病毒对于控制其大规模传播至关重要[19],[20]。
目前常见的H1N1检测方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[21]、表面增强拉曼光谱（SERS）[22],[23]、比色法[24]、荧光光谱[25]和免疫测定[26]。基于高度特异性的抗原-抗体免疫反应的免疫测定在临床诊断和生物医学领域发挥着不可替代的作用[27]。传统的免疫测定通常采用双抗体夹心技术结合酶或纳米材料标记来实现信号转换和放大[28],[29]。另一种方法是通过测量介质溶液中的电子转移来检测物质[30]。然而，这些方法需要添加氧化还原介质溶液，使操作过程复杂化[31],[32]。相比之下，电化学免疫测定由于其高灵敏度、强特异性、宽检测范围、简单性、稳定性和快速性而具有广泛的应用前景[33],[34]。最近，使用先进纳米材料的其他电化学传感平台也实现了类似的优势。例如，Ma等人开发了一种基于Co单原子催化剂的H?O?传感器，利用低成本铅笔石墨电极实现了宽线性范围（1–12,000 μM）和低检测限（0.21 μM），进一步展示了电化学传感在实际应用中的潜力[35]。

普鲁士蓝（PB），又称铁氰化物（Fe4[Fe(CN)6]3），由Berliner Diesbach于1740年首次发现，是最古老的配位化合物之一。作为一种最早的电子介质，PB具有可逆的电化学反应动力学、稳定的氧化还原形式和低的氧化还原电位。PB由低自旋的Fe2+和高自旋的Fe3+组成，钠、钾和铵离子作为反离子维持电荷平衡[36]。大量研究集中在PB基生物传感器的基本机制和性能提升上[37],[38]。传统的PB改性方法包括合成PB粉末，然后将其滴涂或机械研磨到电极表面。然而，这种方法复杂、耗时且效率低下，常常导致PB颗粒分布不均。一种更方便的方法是电化学沉积（ED），可获得颗粒分布均匀的PB改性电极。研究表明，PB改性电极在酸性环境中具有长循环寿命，但在中性和碱性溶液中稳定性较差，可能是由于Fe3+的水解。当溶液pH值超过6.3时，Fe3+与OH?反应生成Fe(OH)3，导致PB从电极表面脱落，从而降低电化学信号。为了解决这一长期存在的问题，我们引入了PEDOT聚合物层的协同作用，显著提高了传感器在生理环境中的可靠性。与以往主要利用PEDOT提高导电性的研究不同，我们的工作强调了其在稳定PB纳米颗粒和提供亲水性抗污染表面的双重作用[39]。此外，PEDOT聚合物的高度亲水性提供了抗污染能力，并减少了免疫测定中的非特异性结合干扰[40]。
尽管取得了上述进展，大多数现有的基于LIG的电化学传感器仍依赖于单一成分改性，这未能同时解决三个关键问题：PB在中性生物介质中的信号稳定性不足、检测灵敏度有限以及在复杂样本中的严重非特异性吸附。本研究的核心科学问题是开发一种多功能集成传感界面，通过合理材料设计协同提升信号稳定性、检测灵敏度和抗污染性能。为了克服这些限制，我们提出了一种基于逐步电位沉积的新型三重增强策略，构建了LIG/PB/PEDOT/Au复合微电极。在这种分层设计中，LIG提供高导电性的三维多孔框架；PB作为内在的氧化还原信号报告剂，具有高灵敏度；PEDOT形成保护性封装层，稳定中性环境中的PB信号并提供抗污染能力；金纳米颗粒提供丰富的活性位点用于抗体的固定并进一步提高导电性。这种多层协同设计避免了单一成分改性的缺点，实现了信号稳定性、灵敏度和抗污染性能的集成改进。类似地，Li等人最近报道称，他们的Au@Co3O4 NPs/NiCo(HITP)电化学免疫传感器在HBsAg检测中的高性能归因于Au纳米颗粒、Co3O4纳米颗粒和双金属导电MOF之间的协同效应，实现了高达15 fg mL?1的检测限[41]。

在这项研究中，我们提出了一种基于逐层工程制造的LIG/PB/PEDOT/Au复合电极的新型无标记电化学生物传感器，用于超灵敏的H1N1检测。我们设计的核心是将普鲁士蓝（PB）作为高响应氧化还原介质进行战略集成，其在中性介质中的固有不稳定性通过保护性的PEDOT封装层得到有效缓解，该层同时也起到抗污染屏障的作用。通过进一步加入Au NPs并通过MUA功能化促进抗体固定，传感器利用了LIG的多孔结构、PB的氧化还原活性、PEDOT的稳定性和Au NPs的导电性的协同作用。这种三重增强、逐层策略直接解决了PB基传感器在中性环境中的长期不稳定问题，以及无标记免疫传感器中灵敏度和抗污染能力之间的常见权衡。这种独特配置不仅简化了操作过程，而且通过利用电极本身的强电化学信号消除了对外源性氧化还原介质的需求，从而实现了对H1N1的直接定量分析。这种集成设计不仅克服了以往单一成分改性的局限，还为即时诊断（POCT）应用提供了多功能和稳健的平台。

**材料**
聚酰亚胺薄膜（PI，厚度80 μm）购自中国的天津佳音纳米科技有限公司。四水合氯化金（HAuCl4·4H2O）购自中国医药化学试剂有限公司。磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.0）、11-巯基十一烷酸（MUA）和3,4-乙烯二氧噻吩（EDOT）购自Aladdin试剂有限公司。氯化钾（KCl）、六氰合铁（K3Fe(CN)6）、盐酸（HCl）、六水合三氯化铁（FeCl3·6H2O）和三钠硝酸铁（NaFe(NO3)3）等试剂也用于实验。

**无标记H1N1免疫传感器的策略**
无标记H1N1免疫传感器的策略如图1所示。Ye等人[11]详细描述了激光诱导在PI上形成图案化石墨烯的过程。首先，使用LIG技术制备的三维介孔石墨烯构建了一个高导电性的传感界面，具有较大的比表面积（图1a），为有效的电子传递和丰富的生物识别位点奠定了结构基础。与传统方法相比……

**结论**
本研究提出了一种新型无标记电化学免疫传感器，用于超灵敏的H1N1检测，基于合理设计的LIG/PB/PEDOT/Au微电极。与以往仅关注单一成分改进的工作不同，我们的设计整合了多种功能材料，实现了信号稳定性、灵敏度和抗污染性能的协同提升。使用低成本半导体激光制备的LIG基底提供了导电性强的三维结构……

**作者贡献声明**
李彦霞：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念构思。
余方清：撰写——初稿撰写、验证、方法学、实验研究、数据管理。
李文：验证、实验研究、数据管理。
刘丽萍：软件开发、实验研究、数据管理。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述工作。

**致谢**
本项目得到了福建省自然科学基金（2024J011175）、福建省生态与环境信息图谱重点实验室（ST24003）以及福建师范大学福寿基金会的研究项目（MFK25017）的财政支持。