一种基于振动增强的可折叠微流体纸基RPA平台，用于快速现场检测副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）

《Microchemical Journal》：A vibration-enhanced foldable microfluidic paper-based RPA platform for rapid on-site detection of Vibrio parahaemolyticus

　　

李晨|刘萍|付龙文|周娜|向佳雯|杨亚琦|孙红晓|陈玲欣|王晓春|王秀娟|李宝伟

青岛科技大学生物工程学院，中国青岛市266042

摘要

快速且可在现场部署的食源性病原体检测方法对于确保食品安全和公共卫生至关重要，尤其是在资源有限的环境中。本文首次报道了一种基于可折叠多层微流控纸质分析装置（μPAD）的振动增强型重组酶聚合酶扩增（RPA）平台，用于现场检测副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）。与传统纸质扩增系统不同，后者受到多孔基质中扩散限制的影响，该平台引入了低功耗微振动模块以增强试剂混合并提高扩增效率。该系统集成了预先储存的空气干燥RPA试剂、带有振动辅助混合的便携式加热单元以及基于智能手机的荧光读数模块。通过简单的样品加载，可在纸张基底上直接启动等温扩增，在40°C下20分钟内完成核酸扩增和荧光检测。该检测方法的检测限为10^2 CFU/mL，与使用实验室荧光光谱仪获得的结果相当。该平台在添加了病原体的海水和海鲜样品中表现出高特异性和可靠的性能，其结果与标准培养方法一致。通过解决纸质扩增中的质量传递限制并实现系统级集成，该平台为现场食品安全监测提供了实用且可扩展的解决方案。

引言

食源性疾病对全球公共卫生构成了日益严重的威胁，近几十年来发病率持续上升[1]，[2]。副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）是一种常见的海洋细菌，是导致海鲜相关感染的主要原因[3]，[4]，可能引发急性胃肠炎，在严重情况下甚至危及生命[5]，[6]，[7]。随着物流网络的完善，海产品的市场流通效率显著提高。因此，内陆地区检测到副溶血性弧菌的频率也逐渐增加，反映了其全球传播的趋势[5]。因此，开发快速筛查、鉴定和定量副溶血性弧菌的方法对于公共卫生和食品安全至关重要。

传统的检测方法，包括基于培养的技术和聚合酶链反应（PCR）[8]，耗时较长且需要复杂的仪器设备，限制了它们在现场应用的效果[9]，[10]。等温扩增技术[11]，特别是重组酶聚合酶扩增（RPA）[11]，[12]，因其快速的反应动力学、低操作温度和最小的设备需求而成为有前景的替代方案[13]。尽管级联等温扩增策略可以提高灵敏度，但仍存在若干局限性，包括相对较高的操作温度[14]、多步骤程序[15]以及对复杂仪器设备或纳米材料制备的依赖[16]。因此，需要一种既能提高灵敏度又能增强便携性的方法。

微流控纸质分析装置（μPADs）为即时检测（POCT）[17]，[18]，[19]提供了一个低成本、便携的平台，通过毛细作用实现流体传输而无需外部设备[20]，[21]。这些装置的优势包括易于制造、可丢弃和集成能力，使其适用于病原体检测[22]，[23]，[24]，[25]。尽管如此，当前的纸质扩增系统仍面临诸如抗干扰性能有限[24]和仪器成本高昂[26]等关键挑战。将重组酶聚合酶扩增（RPA）与纸质微流控荧光检测相结合，结合了μPADs的低成本和便携性以及核酸扩增的高特异性和灵敏度[27]。这类系统在资源有限的条件下具有实现设备小型化和现场病原体检测的巨大潜力[13]，[27]。最近的研究已经展示了基于纸张的RPA平台用于快速检测食源性病原体的潜力。然而，这些方法仍然依赖于非便携式仪器[28]或缺乏定量检测能力，限制了其实际应用[29]。更重要的是，纸质扩增系统的性能从根本上受到多孔基质中有限质量传递的限制。酶和核酸的扩散受限导致试剂分布不均和扩增效率降低，这仍然是提高分析性能的主要挑战。

食源性病原体的即时检测需要快速、便携、成本效益高、用户友好、选择性强和灵敏度高的分析方法。为了解决这些挑战，我们开发了一种基于纸张的振动增强型RPA平台（PF-RPA@μPAD），用于快速现场检测副溶血性弧菌。本研究不仅关注组件集成，还旨在克服纸质核酸扩增的一个根本限制——多孔基质中的质量传递受限问题。通过将微振动模块引入便携式加热系统，我们显著改善了纸张上的试剂混合和扩增效率。该平台集成了预先储存的RPA试剂、可折叠的多层μPAD和基于智能手机的荧光读数功能，实现了闭环、可在现场部署的检测流程。该检测在40°C下运行，并在20分钟内出结果。这项研究不仅为快速病原体检测提供了实用方案，还为提高纸质诊断系统的反应效率建立了通用策略。

节选

材料和仪器

TwistDx TwistAmp?基础试剂盒购自TwistDX有限公司（英国剑桥）。硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂购自鲁桥科技有限公司（中国北京）。基于磁珠的细菌DNA提取试剂盒购自天源生物科技有限公司（中国北京）。用于副溶血性弧菌的EasyID生化鉴定试剂盒购自焕凯生物科技有限公司（中国广东）。碱性蛋白胨水（APW）补充...

纸张膜的表征

扫描电子显微镜（SEM）成像显示，纸张基底由交织的纤维素纤维构成的多孔三维网络组成。这种多孔结构使得液体可以通过毛细作用在基底中传输，无需外部泵。如图1a所示，Whatman No.1、No.2、No.4和No.6展示了由随机沉积和交织的纤维素纤维形成的非织造、各向同性的三维结构。相比之下，GF/A和GF/F则表现出...

结论

在这项工作中，我们开发了一种基于纸张的振动增强型RPA平台，用于快速现场检测副溶血性弧菌。通过集成预加载的试剂、可折叠的μPAD结构、振动辅助混合和便携式荧光检测，该系统能够在40°C下20分钟内完成核酸扩增和信号读数。引入振动有效克服了多孔纸张基质中的扩散限制，从而提高了扩增效率...

CRediT作者贡献声明

李晨：撰写——原始草稿、方法学、调查、数据分析、数据管理。刘萍：撰写——审阅与编辑、方法学、调查。付龙文：可视化处理、调查。周娜：调查、数据分析。向佳雯：数据管理、概念化。杨亚琦：方法学、数据分析。孙红晓：方法学、调查。陈玲欣：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金筹集。王晓春：撰写——审阅与...

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金（批准号：42376188、42476186）、国家自然科学基金重大科研仪器研制项目（批准号：42327805）、山东省自然科学基金一般项目（ZR2024MB066）和辽宁省重点研发计划（2024JH2/102500041）的支持。