基于半胱氨酸（Cys）-氧化锌（ZnO）/配体识别蛋白（LIG）复合界面的电化学传感器的构建，用于检测白色念珠菌（Candida albicans）

《Microchemical Journal》：Construction of an ssDNA-based electrochemical sensor for Candida albicans detection based on a Cys-ZnO/LIG composite interface

　　

范克珍|李家穆|王浩硕|夏向龙|李传和|潘鹏|杨正春|张瑞|何杰|李华义|王春鸿

天津理工大学集成电路科学与工程学院、先进材料与印刷电子中心，薄膜电子与通信器件天津市重点实验室，中国天津300384

摘要

白色念珠菌（C. albicans）是最常见的机会性真菌病原体之一，与高发病率和死亡率密切相关，对免疫系统受损的人群构成特别严重的威胁。在这项研究中，我们开发了一种基于 ssDNA 的电化学传感器，该传感器利用了激光诱导的石墨烯（LIG）和半胱氨酸功能化的氧化锌（Cys-ZnO）。为了解决生物质衍生碳材料导电性差以及构建生物界面困难的问题，我们采用了一步直接激光写入（DLW）技术来实现 CMC/GO 前驱体的石墨化，并对其进行原位掺杂。这一策略促进了富含边缘缺陷的石墨结构的形成，提供了大量的活性位点并加速了电子传输速率。随后，引入了富含氨基的 Cys-ZnO 纳米粒子作为界面连接层，为 ssDNA 探针的方向性固定提供了丰富且稳定的共价锚定点。基于目标捕获诱导的“信号关闭”机制，所提出的传感器在 10¹ 到 10⁶ CFU/mL 的宽范围内表现出可靠的线性响应，检测限（LOD）低至 1.8 CFU/mL。此外，在模拟和稀释的生物基质中（包括人工唾液、稀释的人血清和人工尿液），该传感器的检出率在 96.4% 到 104.6% 之间。本文提出的集成激光制造和界面功能化策略为构建低成本、环保的按需制造诊断平台提供了新的途径。

引言

白色念珠菌（C. albicans）是最常见的真菌病原体之一，与高发病率和死亡率密切相关，对免疫系统受损的人群构成特别严重的威胁 [1]。快速准确地识别 白色念珠菌 对及时进行临床干预和有效抗真菌治疗至关重要。然而，传统的诊断方法 [2]（如微生物培养和聚合酶链反应（PCR））存在检测周期长（24–72 小时）[3]、成本高以及依赖复杂仪器等问题，难以满足资源有限地区的即时检测（POCT）需求。因此，开发低成本、快速且超灵敏的病原体筛查平台迫在眉睫 [4]。尽管电化学 biosensor 由于其高灵敏度、便携性和快速响应能力而成为 POCT 的理想候选者，但传统传感电极（如玻璃碳或金电极）的制备通常涉及复杂的多步重复光刻工艺或昂贵原材料，严重阻碍了其大规模生产和一次性应用。

近年来，基于激光诱导的石墨烯（LIG）的柔性电子技术彻底改变了电极制造工艺 [5]。通过直接激光写入（DLW）技术，聚合物前驱体可以即时转化为三维多孔石墨烯，提供了一种无需掩模、无需化学处理且高度可扩展的方法来制备一次性传感芯片 [6]，[7]。目前，LIG 技术广泛应用于物理传感（如应变和温度检测）和生化检测。商业聚酰亚胺（PI）薄膜长期以来一直是 LIG 制备的主要前驱体，因为它们具有优异的碳形成能力 [8]。然而，PI 的不可降解性引发了日益严重的电子废物问题。为了顺应绿色电子和可持续发展的趋势，研究人员开始关注生物质衍生前驱体 [9]。木材、纸张、木质素、壳聚糖和纤维素等天然材料已成功转化为导电碳骨架，用于构建环保电子设备 [10]。

尽管生物质 LIG 具有广阔的应用前景，但其转化为高性能 biosensor 仍面临诸多瓶颈。与合成聚合物（PI）相比，原始生物质衍生的碳通常具有石墨化程度低、结构缺陷多和导电性差等固有缺点，导致传感器的信噪比不佳 [11]，[12]。为了解决这个问题，当前的研究策略主要集中在引入高导电填料（如金属纳米线）或进行杂原子掺杂（N、B、S 等）[13]，[14]。然而，更棘手的问题在于构建生物界面：惰性的碳表面缺乏特定固定生物受体（如 ssDNA 探针和抗体）的功能基团 [15]，[16]。传统的表面功能化方法通常需要繁琐的化学处理或长时间的浸泡和孵育，这不仅增加了制造复杂性，还可能引入有毒试剂，偏离了 LIG 技术“快速和环保”的初衷 [17]，[18]，[19]。因此，开发一种同时提高生物质碳导电性并赋予其生物锚定位点的策略仍然是构建坚固的生物质 biosensor 的关键挑战 [20]，[21]。

最近，在基于 ssDNA 的电化学传感器领域取得了显著进展，特别是在复杂生物基质中进一步提高灵敏度和选择性方面。各种新型纳米材料和创新的传感策略已被成功应用于放大电化学信号并抵抗非特异性生物污染，从而实现对目标病原体或生物标志物的超灵敏和高选择性检测 [22]，[23]，[24]，[25]。受这些优秀研究的启发，开发一种坚固且抗干扰的传感界面仍然是临床诊断的极具吸引力的目标。

在这里，我们提出了一种逐步构建高性能基于 ssDNA 的电化学传感器的策略。首先，利用直接激光写入（DLW）技术制备了掺锌的三维多孔石墨烯电极 [26]，[27]，[28]。通过将醋酸锌加入 CMC/GO 前驱体中，激光产生的瞬间高温实现了碳化和石墨化，同时促进了锌元素在碳骨架中的原位掺杂。这一快速局部加热过程促进了富含边缘缺陷的石墨网络的形成，这些缺陷作为高效的电催化位点，显著提高了电极的电子传输速率 [29]。随后，通过湿化学方法合成了半胱氨酸功能化的氧化锌（Cys-ZnO）[30]，作为分子连接剂，半胱氨酸在 ZnO 纳米粒子表面引入了丰富的氨基 (-NH?)，通过戊二醛交联为 ssDNA 探针提供了稳定的锚定点，同时保持了 ZnO 的高比表面积 [31]。LIG/Zn 基底的高导电性与 Cys-ZnO 的优异生物相容性相结合，使传感器对 白色念珠菌 具有卓越的检测能力 [32]。利用目标捕获诱导的“信号关闭”机制，该传感器表现出宽线性范围、低检测限和对干扰菌株的出色选择性 [33]，[34]。这项研究不仅为制备绿色、低成本、功能集成的 bioelectrodes 提供了一种新颖且可持续的途径，还为真菌感染的早期临床诊断展示了广阔的应用前景 [35]。

章节片段

材料与试剂

所用材料包括分析级的羧甲基纤维素（CMC）、氧化石墨烯（GO，≥ 99%）、氧化锌（ZnO）纳米粒子（分析级）、醋酸锌二水合物（≥ 99.0%）、柠檬酸（≥ 99.5%）、盐酸半胱氨酸（98%）、牛血清白蛋白（BSA，≥ 98%）、戊二醛（GLD，25% 水溶液）、氯化钾（≥ 99.5%）、铁氰化钾（K₃[Fe(CN)₆），≥ 99.5%）、铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆），≥ 99.5%）和无水乙醇（≥ 99.7%）。干扰物质

晶体结构分析（XRD）

图 4 显示了前驱体和合成材料的 X 射线衍射（XRD）图谱，以分析其晶体结构和相变过程。对于电极基底，原始 CMC 粉末的 XRD 图谱（图 4A）仅在 20° 处显示出典型的宽而弥散的非晶峰，这是由于羧甲基化破坏了天然纤维素的氢键网络所致。相比之下，经过激光辐照处理后

结论

在这项工作中，我们成功开发了一种基于生物质衍生的 LIG/Cys-ZnO 复合界面的高性能 ssDNA 电化学传感器，实现了对 白色念珠菌 的灵敏检测。通过将无掩模激光诱导的石墨烯与随后的 Cys-ZnO 纳米材料滴铸相结合，我们成功构建了一个“软-硬”化学界面，显著降低了界面阻抗，并确保了 ssDNA 探针的高效定向固定。

CRediT 作者贡献声明

范克珍：撰写 – 原稿撰写、研究调查、数据分析、概念化。李家穆：数据可视化。王浩硕：数据可视化。夏向龙：研究调查。李传和：研究调查。潘鹏：撰写 – 审稿与编辑、监督、资源获取、概念化。杨正春：监督、资源获取、概念化。张瑞：项目管理。何杰：数据可视化。李华义：概念化。王春鸿：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢 天津市重点研发计划（资助编号：（Z20260005，Z20250187）和 技术研发项目（资助编号：（H20230015，H20220353，H20220275）的支持。