一种用于电化学检测乳腺癌循环肿瘤细胞的自我复制DNA电路

《Microchemical Journal》：A self-replicating DNA circuit for electrochemical identification of circulating tumor cells in breast cancer

　　

张展|杨浩|倪凯|叶子|安晓天|费艺伟|曹娅|赵静

分子识别与生物传感中心，上海器官修复工程研究中心，生物材料与生物技术在器官修复领域的联合国际研究实验室（教育部），上海大学生命科学学院，中国上海200444

摘要

循环肿瘤细胞（CTCs）现已成为乳腺癌早期诊断、预后评估和个性化治疗的有前景的液体活检生物标志物。然而，尽管取得了显著进展，传统的电化学CTC检测方法仍存在灵敏度不足的长期问题。在此，我们开发了一种新的电化学生物传感方法，该方法结合了双重目标识别和自我复制DNA电路介导的信号放大技术，以实现准确且灵敏的CTC识别。具体来说，制备了一种经过黏蛋白1（MUC1）适配体修饰的金电极，用于特异性捕获乳腺癌细胞；而表皮生长因子受体（EGFR）适配体 conjugated 的触发序列在结合到捕获的细胞后启动DNA电路，诱导四个DNA发夹结构的级联杂交，形成密集排列的DNA纳米结构。最后，亚甲蓝插入生成的DNA纳米结构中，实现了显著的电化学信号放大。在优化条件下，该方法检测范围为20至2×10^5个细胞，检测限低至1.2个细胞，并且对目标细胞具有优异的特异性，在复杂样本中表现稳健。这种双重适配体生物传感策略为液体活检中的CTC监测提供了一种灵敏、可靠且临床可行的方法，有效克服了传统电化学CTC检测方法的根本缺陷。

引言

乳腺癌目前仍然是全球女性癌症相关死亡的主要原因，2022年全球报告了约230万新病例和67万死亡病例。值得注意的是，I期诊断的乳腺癌患者的5年相对生存率可能超过90%，而IV期患者的生存率则骤降至29% [1]，这突显了早期诊断的关键重要性 [2]，[3]。传统的成像技术（如乳腺X光摄影、磁共振成像和计算机断层扫描）存在高假阳性率、高成本和潜在健康风险等问题，限制了它们的临床应用 [4]，[5]。为了解决这些限制，液体活检作为一种有前景的微创替代方法应运而生，能够检测循环肿瘤相关生物标志物，包括循环肿瘤细胞（CTCs）、细胞外囊泡和无细胞核酸 [6]，[7]，[8]。

在液体活检生物标志物中，CTCs携带其来源肿瘤的分子和遗传特征 [9]，[10]，已成为促进乳腺肿瘤非侵入性诊断和实时监测以及疾病进展和预后动态评估的具有临床意义的生物标志物 [11]，[12]，[13]。到目前为止，已经开发了许多CTC检测策略 [14]，[15]，[16]。例如，基于微流控技术的尺寸分离方法可以根据大小差异将CTCs与白细胞（WBCs）分离；然而，这两种细胞类型的尺寸重叠可能导致纯度低和假阴性结果。基于核酸的方法，包括RNA分析和DNA测序，依赖于肿瘤特异性分子特征，但受到严格的样本富集要求、高昂的成本和复杂操作程序的限制。免疫选择方法直接针对CTC表面标志物，与基于尺寸和核酸的方法相比具有更高的特异性，但受到抗体高成本和在非最佳检测条件下易发生变性的影响。

为了克服抗体相关的限制并改进免疫选择方法，人们探索了其他识别元素来特异性识别CTC表面标志物，包括适配体和小分子配体（如硼酸衍生物）[17]，[18]，[19]。在这些元素中，适配体因其独特的优势而受到广泛关注。适配体是通过SELEX选择的单链寡核苷酸，具有类似抗体的结合亲和力，同时还具有优异的热稳定性和易于进行化学修饰的优点 [20]。这些优点使它们成为制备适配体传感器的理想候选者，这些传感器在CTC检测中得到广泛应用 [21]，[22]。然而，传统的适配体传感器仍面临两大挑战：一是当仅针对一个CTC表面标志物时诊断准确性不足；二是对于如此低丰度的目标，信号放大效果不够。为了同时解决准确性和灵敏度不足的问题，我们提出了一种结合双重目标识别与自我复制DNA电路（SDC）的电化学适配体传感器（图1）。一方面，这种方法通过双重目标识别确保了CTC检测的高特异性，可以有效克服由于肿瘤异质性引起的单个CTC表面蛋白表达波动 [23]，[24]，[25]，[26]；另一方面，该方法利用基于DNA自组装的SDC实现了高灵敏度检测。众所周知，DNA自组装具有高效率和可预测性，因此通过合理的序列设计可以实现显著和准确的信号放大 [27]，[28]，[29]，[30]。

如图1所示，跨膜糖蛋白MUC1和表皮生长因子受体（EGFR）是乳腺癌中经常过表达的典型上皮标志物，被用作识别乳腺癌细胞的模型 [31]，[32]，[33]。因此，选择双重阳性的乳腺癌细胞MDA-MB-231作为CTCs的代表 [34]，[35]，[36]。根据先前的研究，本研究中使用的MUC1和EGFR适配体表现出高结合亲和力，MUC1的解离常数为0.135 nM，EGFR的解离常数为0.62 nM [37]，[38]。这两种适配体已成功用于传感器的开发 [39]，[40]。此外，这些研究一致证实了MUC1和EGFR适配体的高特异性。具体而言，目标细胞首先被捕获在经过MUC1适配体修饰的金电极上，然后通过含有触发序列（T）域的工程化的EGFR特异性适配体探针进行双重识别。随后，分支DNA聚合物通过涉及四个发夹探针（H1-H4）的SDC过程自主组装到细胞表面 [41]。亚甲蓝（MB）是一种可以插入双链DNA的电活性分子，可以放大电化学信号 [42]。因此，本文建立了一种结合双重目标识别和DNA自组装放大的实用策略，用于准确检测乳腺癌细胞，在乳腺癌的CTC基于液体活检中具有巨大的临床应用潜力。

章节摘录

化学试剂和材料

6-巯基-1-己醇（MCH）、三（2-羧基乙基）膦盐酸盐（TCEP）和六氨钌（III） chloride（Cl3H18N6Ru）从Sigma-Aldrich（中国上海）购买。人乳腺癌细胞系（MDA-MB-231、MAD-MB-453）、乳腺上皮细胞（MCF-10A）和小鼠巨噬细胞（RAW264.7）从上海Genechem有限公司（中国上海）购买。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基和Leibovitz L-15培养基

为了验证由T序列触发的SDC过程的可行性，采用了基于F?rster共振能量转移（FRET）的检测方法。其中，发夹探针H4同时标记了FAM和TAMRA，由于供体和受体在茎环结构中的空间接近性，FAM的荧光最初被抑制。引入T序列后，H1的发夹构象首先被破坏，从而引发了其他三个发夹H2的开放

总之，我们开发了一种电化学方法，用于灵敏且特异性地检测表达MUC1和EGFR的乳腺癌细胞，该方法结合了双重适配体识别和基于SDC的电化学信号放大。固定在金电极上的MUC1适配体实现了MUC1阳性细胞的选择性捕获，而随后的EGFR-T适配体探针标记有效地触发了SDC过程。树状dsDNA纳米结构的自动组装

张展：撰写——原始草稿，研究，概念构思。杨浩：正式分析，数据整理。倪凯：数据整理。叶子：正式分析。安晓天：研究。费艺伟：研究。曹娅：撰写——审稿与编辑，项目管理，资金获取。赵静：监督，项目管理，数据整理。

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

本工作得到了上海自然科学基金（项目编号23ZR1421400）和中国国家自然科学基金（项目编号82470534）的支持。