大型胞外囊泡（EVs）通过STING（干扰素基因刺激因子）信号传导的系统性传播

《Journal of Extracellular Vesicles》：Systemic Propagation of STING Signalling via Generation of Large Extracellular Vesicles

　　

摘要 源自肿瘤细胞的大型胞外囊泡（EVs）在肿瘤形成和进展中扮演重要角色。然而，恶性细胞为何产生这些大型EVs以及它们在体内如何发挥作用仍不清楚。研究人员利用一个特征明确的果蝇肿瘤模型，证明大型EVs从恶性细胞的生物发生是一个进化上保守的过程。该研究揭示了环鸟苷酸-腺苷酸合成酶（cyclic GMP-AMP synthase, cGAS）-干扰素基因刺激因子（stimulator of interferon genes, STING）通路在驱动大型EVs生物发生和诱导肿瘤系统性免疫反应中的关键作用。该通路介导了对胞质DNA的先天免疫反应。STING激活了一条包含JNK和FAK的信号轴——该过程独立于TANK结合激酶1（TBK1）和核因子κB激酶抑制剂（IKKβ）——来驱动果蝇和人类恶性细胞中大型EVs的生物发生。将果蝇肿瘤产生的大型EVs移植到野生型幼虫中，足以通过在巨噬细胞样细胞中激活STING信号来重现针对肿瘤的系统性免疫反应。因此，该研究建立了一个研究源自恶性细胞的大型EVs的新动物模型，并阐明了STING信号如何通过驱动大型EVs的生物发生，从肿瘤细胞传播到免疫系统，从而诱导针对肿瘤的系统性免疫反应。

一、 研究背景、问题与目的

胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是细胞释放的、具有生物活性的异质性膜囊泡，通过传递蛋白质、核酸、脂质和代谢物等活性物质，在细胞间通讯中发挥重要作用，参与免疫、发育、凝血、组织修复及癌症等多种生理病理过程。根据大小和产生机制，EVs可分为外泌体、微囊泡和大型EVs等。肿瘤细胞可产生包括大型癌体（large oncosomes）和胞质体（cytoplasts）在内的多种EVs，它们在肿瘤形成、进展和转移中扮演关键角色。然而，由于EVs尺寸远小于细胞，在生理环境下直接观察其作用具有挑战性，且对其生物发生的遗传学研究通常需要同时操纵供体和受体细胞，这使得对EVs生物学的深入研究存在障碍。

在免疫学层面，肿瘤与免疫细胞的相互作用可诱导抗肿瘤或促肿瘤免疫反应。在哺乳动物中，cGAS-STING信号通路是感知胞质DNA（如源自细菌/病毒感染、染色体不稳定性或线粒体损伤）并启动先天免疫应答的核心途径。染色体不稳定性（Chromosomal Instability, CIN）是癌症的标志之一，可能导致胞质DNA积累并激活cGAS-STING通路，进而影响肿瘤免疫和进展。有研究提出，肿瘤来源的EVs（如外泌体和凋亡泡）可能携带肿瘤DNA，并激活免疫细胞中的STING信号。然而，cGAS-STING信号是否驱动肿瘤源性EVs，特别是携带肿瘤DNA的大型EVs的生物发生，目前尚不清楚。同样，在果蝇中，虽然存在cGAS-STING通路并在抗病毒免疫中发挥作用，但其在肿瘤背景下的功能，以及果蝇肿瘤是否产生大型EVs并介导系统性免疫反应，也未曾有清晰描述。

因此，本研究旨在利用遗传工具丰富的果蝇恶性上皮肿瘤模型，探究大型EVs的生物发生是否是一个保守过程，阐明其产生的分子机制，特别是cGAS-STING通路的作用，并揭示这些大型EVs在介导肿瘤与宿主免疫系统通讯、诱导系统性免疫反应中的功能。

二、 研究方法概要

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   果蝇遗传学模型：使用特征明确的果蝇眼-触角盘恶性上皮肿瘤模型，通过在克隆细胞中共表达致癌^RasV12和敲除极性基因^scribble（^scrib-/-）来诱导肿瘤。
2. 2.
   活体与离体成像技术：利用共聚焦显微镜对整只幼虫和离体培养的成虫盘进行实时成像，追踪GFP标记的克隆细胞产生大型EVs的过程。
3. 3.
   超微结构分析：通过透射电子显微镜观察肿瘤表面EVs样结构的形态。
4. 4.
   胞外囊泡分离与鉴定：通过差速离心法从果蝇成虫盘或人癌细胞系（MDA-MB-231, DU145, U87）培养上清中分离富集大型EVs，并使用纳米颗粒追踪分析、荧光成像和蛋白质印迹法进行表征和定量。
5. 5.
   功能获得与缺失实验：在果蝇肿瘤细胞或人癌细胞中，利用RNA干扰（RNAi）敲低目标基因（如^Sting, ^JNK, ^FAK），或使用激动剂（如poly(dA:dT), 2‘3’-cGAMP）和抑制剂（如H-151）操纵cGAS-STING通路，观察对大型EVs产生的影响。
6. 6.
   移植与免疫应答分析：将分离自肿瘤的大型EVs组分移植到野生型果蝇幼虫体内，通过定量PCR（qRT-PCR）检测脂肪体（果蝇的免疫器官）中抗菌肽（如^Drosomycin, ^{Diptericin B}）基因的表达水平，评估系统性免疫反应的诱导情况。
7. 7.
   分子生物学分析：通过蛋白质印迹法检测信号蛋白（如p-IRF3, p-JNK, p-FAK）的磷酸化水平；通过qRT-PCR检测STING靶基因和免疫相关基因的表达变化。

三、 研究结果

2.1 恶性细胞产生大型EVs是一个进化保守的过程

研究发现，在携带^RasV12， ^scrib-/-克隆的果蝇幼虫体内和离体成虫盘上，均可观察到大量从肿瘤细胞脱落的GFP⁺颗粒，而野生型或仅表达^RasV12的克隆则很少产生。电镜显示这些颗粒为直径约1.7μm的囊泡样结构，与哺乳动物癌细胞产生的大型癌体特征相似。通过差速离心可成功富集这些颗粒。这表明恶性细胞产生大型EVs是一个在进化上保守的过程，确立了果蝇作为研究肿瘤源性大型EVs的新型动物模型。

2.2 大型EVs以血细胞依赖性方式诱导系统性免疫反应

研究发现，血细胞（果蝇的巨噬细胞样细胞）可吞噬源自^RasV12， ^scrib-/-肿瘤的GFP⁺大型EVs。更重要的是，将从^RasV12， ^scrib-/-肿瘤分离的大型EVs组分移植到野生型幼虫体内，足以显著提高脂肪体中多种抗菌肽（^DptB, ^Drs, ^Def）的mRNA表达，模拟了肿瘤诱导的系统性免疫反应。而移植对照EVs或小型EVs则无此效果。遗传学剔除血细胞后，大型EVs诱导的免疫反应被阻断。这表明大型EVs是肿瘤与宿主免疫系统通讯的信号载体，其诱导系统性免疫反应依赖于血细胞。

2.3 染色体不稳定性特征在^RasV12， ^scrib-/-肿瘤中普遍存在，且STING信号激活

在^RasV12， ^scrib-/-克隆细胞中观察到染色质桥、微核和染色质核外渗漏等与染色体不稳定性（CIN）相关的特征。同时，STING信号通路的下游靶基因（^Srg1, ^Srg2, ^Srg3）表达显著上调，且该上调依赖于STING。这表明CIN可能与STING信号的激活有关。

2.4 在^RasV12， ^scrib-/-肿瘤中敲低STING减少大型EVs的生物发生

在^RasV12， ^scrib-/-肿瘤细胞中敲低^Sting，虽然CIN特征仍然存在，但STING靶基因表达被抑制，同时大型EVs的产生也显著减少。此外，敲低^Sting也削弱了肿瘤诱导的脂肪体免疫反应。这证明STING对于大型EVs的生物发生以及随后的系统性免疫反应是必需的。

2.5 激活cGAS-STING信号增加多个人类癌细胞系的大型EVs产生

在MDA-MB-231、DU145和U87等人癌细胞系中，转染双链DNA（poly(dA:dT)）或cGAS产物2’3’-cGAMP以激活cGAS-STING通路，可显著增加大型EVs的产量。使用STING抑制剂H-151处理可逆转此效应。这表明STING在驱动恶性细胞产生大型EVs方面的功能在人类细胞中也是保守的。

2.6 JNK和FAK在STING下游发挥作用以产生大型EVs

在果蝇^RasV12， ^scrib-/-肿瘤中，磷酸化JNK（p-JNK）和磷酸化FAK（p-FAK）水平升高，且该升高依赖于STING。敲低^JNK（^Bsk）或^FAK可显著减少大型EVs的产生。此外，STING或JNK的缺失抑制了肿瘤克隆边缘的膜泡样动态活动，而FAK缺失则无此影响。在MDA-MB-231细胞中，抑制JNK或FAK也能减少poly(dA:dT)诱导的大型EVs产生。这些结果表明，STING通过激活一条包含JNK和FAK的新型信号轴来驱动大型EVs的生物发生，该途径独立于经典的TBK1-IRF3和IKKβ-NF-κB轴。

2.7 大型EVs激活血细胞中的STING信号，且血细胞STING是大型EVs诱导免疫反应所必需的

在人癌细胞产生的大型EVs中检测到cGAS蛋白，且其水平在激活STING信号后增加。在果蝇中，移植^RasV12， ^scrib-/-肿瘤来源的大型EVs，可上调血细胞中STING靶基因的表达，该效应在血细胞特异性敲低^Sting后被削弱。同样，血细胞中STING的缺失也减弱了大型EVs诱导的脂肪体免疫反应。这表明大型EVs能够将其携带的活性成分（可能包括cGAS-DNA复合物）传递至血细胞，激活其内的STING信号，进而启动针对肿瘤的系统性免疫应答。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：

本研究证实了恶性细胞产生大型EVs是一个进化保守的过程，并建立了果蝇作为在体研究大型EVs生物学的新型模型。该模型允许在生理背景下观察大型EVs从生物发生到介导系统性免疫反应的全过程。

本研究的核心发现是揭示了cGAS-STING信号通路在驱动大型EVs生物发生中的保守作用。值得注意的是，STING利用了一条独立于TBK1/IKKε-IRF3/NF-κB的、由JNK和FAK构成的新型信号轴。考虑到JNK存在于所有后生动物中，而IRF3和I型干扰素仅在脊椎动物中出现，STING-JNK-EV轴可能代表了在干扰素系统出现之前，后生动物抵御恶性细胞的一种古老免疫机制。此外，抑制STING、JNK或FAK会减缓细胞对胞质DNA的清除，提示该轴也可能通过促进DNA外排来参与胞质DNA的清除。

研究还阐明了STING信号如何通过大型EVs从肿瘤细胞传播至免疫系统。肿瘤细胞因CIN产生胞质DNA，激活STING信号，进而促进大型EVs的生物发生。这些EVs可能包裹了cGAS-DNA复合物等STING信号相关成分。当EVs被血细胞/巨噬细胞吞噬后，其携带的货物激活了细胞内的STING信号，最终诱导了脂肪体/肝脏等远端组织的系统性免疫反应。因此，STING在肿瘤细胞和免疫细胞中均不可或缺，而肿瘤源性大型EVs是实现胞质DNA反应系统性传播的关键媒介。

在人体中，大型EVs可能以类似方式与肿瘤相关巨噬细胞或单核细胞相互作用，影响肿瘤免疫微环境。调控STING信号以控制大型EVs的产生，可能成为癌症治疗的一个潜在策略。

研究结论翻译：

总之，我们的研究证实了源自恶性细胞的大型EVs是真正的信号实体，并确立了果蝇作为研究这些EVs在体功能的合适模型。我们发现了STING信号在驱动恶性细胞大型EVs生物发生中的保守作用，这对于STING信号从肿瘤细胞传播至免疫细胞以诱导系统性免疫反应至关重要。来源于癌细胞的EVs可根据具体情境发挥抗肿瘤或促肿瘤作用。因此，操纵STING信号可能成为增加或减少大型EVs产生以实现癌症治疗预期效果的一种途径。重要的是，未来利用果蝇遗传学的研究将有助于我们解答关于大型EVs介导的信号过程的基本问题。特别是，果蝇模型有助于理解大型EVs如何在免疫细胞中被处理以诱导系统性免疫反应，以及它们引发何种生理后果，这可能有助于发现新的靶点来调控EVs介导的反应。