《Journal of Extracellular Vesicles》：Diagnostic and Therapeutic Roles of Extracellular Vesicles in Chronic Kidney Disease: A Systematic Review
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细胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 作为潜在的生物标志物和治疗工具，在多种疾病中受到越来越广泛的研究。迄今为止，研究人员已从尿液、血液、唾液、组织和细胞培养物等多种来源中分离出EVs，研究主要聚焦于其蛋白质和RNA内容物。鉴
细胞外囊泡 (Extracellular Vesicles, EVs) 作为潜在的生物标志物和治疗工具，在多种疾病中受到越来越广泛的研究。迄今为止，研究人员已从尿液、血液、唾液、组织和细胞培养物等多种来源中分离出EVs，研究主要聚焦于其蛋白质和RNA内容物。鉴于其非侵入性的可获得性、选择性的内容物装载以及分子丰富性，生物体液来源的EVs被认为是生物标志物发现的有力候选者。此外，多项研究探索了EVs在治疗方面的应用，包括直接给予病变细胞或生物体，通过工程化增强其功效，或靶向它们以调节病理过程。在本系统性综述中，研究人员综合了目前关于EVs在慢性肾脏病 (Chronic Kidney Disease, CKD) 及相关病症中的诊断和治疗作用的证据，整合了不同EV来源、内容物和疾病模型的研究发现，并对EVs在CKD相关研究中的作用提供了一个整合性视角。通过比较诊断和治疗研究的分子学发现，研究人员还识别了关键的重叠通路和生物学过程，这些可能代表了相关的机制框架。认识到这些趋同的通路有助于统一数据，并指导未来的研究朝着以机制驱动、可临床转化的EV应用方向发展。
论文主体内容总结
1 引言
慢性肾脏病 (CKD) 影响着全球近10%的人口，是一个重大的公共卫生挑战。当前诊断方法通常仅在肾功能显著下降后才发现损伤，而现有疗法也主要是延缓而非逆转疾病进展。这种未满足的需求推动了对细胞外囊泡 (EVs) 日益增长的兴趣，将其视为可获取的、具有机制性信息价值的肾脏健康与疾病指标。EVs由肾脏和非肾脏细胞产生，在尿液和血浆等各种生物体液中循环，为实时监测肾脏病理提供了微创手段。越来越多的证据表明EVs参与了CKD及其并发症的关键过程，提示其分子内容物可作为诊断生物标志物和治疗靶点。尽管取得了这些进展，但基于EV的应用的临床转化仍受到分离、表征和研究设计方法学异质性的阻碍。本综述旨在综合当前证据，并通过比较分子学发现，识别关键的共享机制框架。
2 材料与方法
2.1 系统性检索
研究人员遵循PRISMA (Preferred Reporting Items for Systematic Reviews and Meta-Analyses) 指南，对截至2025年5月22日的PubMed和Embase数据库进行了系统性检索。检索策略包括了“慢性肾脏病”、“细胞外囊泡”等术语。初步检索获得434条记录，经去重及排除综述、评论、书籍章节和不相关研究后，共有364篇原创研究文章纳入最终分析。
2.2 参数分类
研究根据其主要目的被分类为诊断性（侧重于生物标志物发现）或治疗性（强调潜在临床应用）。每项研究还根据疾病、生物体、EV来源和EV内容物进行了审查。所分析的疾病包括CKD、急性肾损伤 (Acute Kidney Injury, AKI)、糖尿病肾病 (Diabetic Kidney Disease, DKD)、肾脏纤维化、肾移植、心血管疾病 (Cardiovascular Disease, CVD) 等。涉及的生物体包括人、小鼠、大鼠、猪和猫模型。EV来源包括肾脏细胞培养 (Kidney Cell Culture, KCC)、间充质干细胞 (Mesenchymal Stem Cell, MSC)、尿液、血液、内皮细胞 (Endothelial Cell, EC)、血管平滑肌细胞 (Vascular Smooth Muscle Cell, VSMC) 等。EV内容物包括蛋白质、信使RNA (mRNA)、微小RNA (microRNA, miRNA)、环状RNA (circRNA)、长链非编码RNA (long non-coding RNA, lncRNA) 等。
2.3 参数关联
为更好地说明疾病、EV来源和EV内容物之间的关系，研究人员生成了连接这些参数的弦图，以可视化特定EV来源和内容物在不同疾病间的分布。
2.4 富集分析
研究人员收集了纳入研究中强调的蛋白质和miRNA，并进行了功能富集分析。对于miRNA，通过miRTarBase鉴定了其实验验证的蛋白质靶点。为确保疾病相关性，通过DisGeNET数据库过滤掉了与肾脏疾病无关的蛋白质。剩余的蛋白质与直接研究的蛋白质一起，进行了基因本体论 (Gene Ontology, GO) 生物过程分析。
3 结果与讨论
EVs在CKD中被用作双重用途的工具：微创诊断指标和模块化治疗剂。在CKD及相关病症中，CKD本身的诊断性和治疗性研究数量大致相当。某些疾病（如肾衰竭、DKD、肾移植、常染色体显性多囊肾病）在诊断方面的研究更强，而肾脏纤维化和AKI则更多在治疗性研究中进行探索。在生物体类型方面，人类临床研究主导了诊断类别，反映了血液和尿液等生物体液的可及性。治疗性研究则主要在鼠类模型中进行，仅有一项治疗性研究使用了人类临床样本，突显了当前在将基于EV的治疗策略转化为临床实践方面存在差距。在EV来源方面，尿液和血液因其丰富性和易获取性而被常用，主要用于诊断研究。相比之下，来源于MSC和KCC的EVs更常用于治疗研究，因为其纯度更高，且能更好地控制实验变量。在EV内容物方面，聚焦于RNA和蛋白质的研究在数据集中占比相似。在诊断研究中，蛋白质和miRNA是最常被分析的EV内容物。然而，蛋白质在诊断研究中更常被评估，而miRNA在治疗研究中被研究的略多。
3.1 EVs作为诊断生物标志物
EV来源：尿液
尿液来源的EVs是诊断研究中最常被用于生物标志物发现的来源之一。尿液EVs提供了一种非侵入性的监测疾病状态的方法，反映了分子生物标志物的动态变化。健康个体中，尿液EVs主要来源于泌尿生殖道上皮细胞，因为肾小球滤过屏障限制了来自体循环的较大囊泡通过。研究尿液EVs时，需要考虑尿液采集的时机和类型，因为EV浓度和内容物组成会因生理和病理条件而异。通常，晨起第一次尿液是首选，因为它含有较高的EV浓度。然而，需注意晨尿可能含有较多的细胞和细菌污染，可能干扰EV分离和下游分析。
EV来源：血液
血液来源的EVs同样在几乎所有疾病类别的诊断研究中被广泛应用。这些EVs主要来源于循环细胞，如红细胞、白细胞和血小板，也部分来源于组织和器官。研究人员通常从血浆或血清中分离EVs，但多项研究强调了这些来源之间的组成差异。血小板在样本处理过程中易被激活，导致EV人工释放，可能混淆生物标志物的发现。一项研究发现，与无糖尿病的患者相比，糖尿病患者的血浆EVs显著增加，且血浆EV水平与死亡风险相关，提示其作为CKD和糖尿病背景下CVD诊断标志物的潜力。
EV来源：组织
尽管尚未直接从受累的肾脏组织中分离EVs，但许多研究将组织表达谱与EV相关标志物相关联。这些研究大多集中于DKD，其次是CKD。例如，对来自不同类型CKD患者的肾小球和小管间质组织的250个微阵列数据集的分析，识别了常见的差异表达基因 (Differentially Expressed Gene, DEG)，这些基因在EV相关组分中显著富集。其他研究调查了来自远处器官的EVs对肾脏病理的影响。例如，一项研究发现，来自CKD小鼠和患者肾脏组织并可在血液循环中检测到的EVs，含有促凋亡miRNA，可诱导心肌细胞凋亡，表明肾脏释放的EVs可能通过转移促凋亡miRNA导致心脏毒性，进而可作为肾-心相互作用潜在的早期诊断生物标志物。
EV来源：肾脏细胞培养
使用KCC的体外研究是发现诊断生物标志物的另一常见领域，同时努力理解候选标志物的作用机制。例如，从经历上皮-间质转化 (Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT) 的肾小管上皮细胞分离的EVs可诱导巨噬细胞的M1极化。另一项研究报道了内皮特异性转录因子Elf3在受损足细胞及其EVs中的存在，并在糖尿病肾病患者的尿液中得到证实，提示足细胞存在不可逆损伤。肾脏细胞培养模型提供了一个可控环境，能够获得更精细的机制见解，并支持无动物实验方法。
其他EV来源
其他EV来源较少用于诊断目的。例如，内皮细胞来源的EVs仅在四项研究中被报道。一项研究调查了肾盂积水，从羊水中分离EVs并进行转录组测序，在六个差异表达的lncRNA中，LINC02863被突出为潜在生物标志物。多项研究使用腹膜透析 (Peritoneal Dialysis, PD) 流出液作为EV来源来监测超滤衰竭。一项研究发现，长期PD患者与新入组患者相比，PD流出液EV蛋白质组存在变异。另一项研究发现，超滤衰竭患者PD流出液EVs的miRNA谱存在差异表达，这些miRNA在与泛素介导的蛋白水解、轴突导向等相关的通路中富集。
EV内容物
由于EVs的分子组成多样，且因细胞类型、生理状态和疾病状况而异，EVs成为潜在生物标志物的多面来源。如之前所述，大多数研究调查了蛋白质和miRNA，但也探索了其他RNA种类和分子组分。
EV内容物：蛋白质
蛋白质在几乎所有疾病类型中都有分析。由于EV生物发生涉及选择性装载机制，EVs的蛋白质含量可能与其来源细胞或相应生物体液不同。在一些情况下，特定的EV相关蛋白已被提议作为诊断生物标志物。例如，在2型糖尿病大鼠模型尿液EVs的蛋白质组学分析中，研究人员观察到早期疾病阶段异柠檬酸脱氢酶1 (Isocitrate Dehydrogenase 1, IDH1) 水平显著增加，且IDH1在无EV尿液中未被检测到，提示其富集是EV特异性的。另一项研究评估了基质重塑相关蛋白5 (Matrix Remodelling-Associated Protein 5, MXRA5) 作为小儿肾盂连接部梗阻的非侵入性生物标志物，发现MXRA5在尿液EVs中显著升高。在猪的代谢综合征模型中，观察到尿液中足细胞来源的EVs标志物nephrin和podocalyxin水平升高，在给予线粒体靶向肽治疗后降低。富集分析显示，诊断研究中反复研究的蛋白质（如uromodulin、aquaporins、CD133、NGAL、WT1）涉及的生物过程主要与肾脏病理生理、细胞迁移、TGF-β信号和炎症调节相关。具体而言，uromodulin mRNA水平在尿液EVs中于DKD早期增加。AQP1和AQP2水平在CKD患者、肾移植受者和AKI大鼠模型中显著降低，提示其可作为监测AKI向CKD转变的指标。CD133作为肾祖细胞标志物，在肾衰竭患者尿液EVs中缺失，在肾移植后功能恢复的患者尿液中增加，可能反映肾单位的再生能力。
EV内容物：RNA
在RNA类型中，miRNA是研究最广泛的，与蛋白质研究的出版物数量相当。它们在几乎所有疾病类型中都有探索。某些miRNA在不同研究中被一致报道，提示其作为稳健生物标志物的潜力。例如，miR-21在DKD患者尿液和血液来源的EVs中水平反复升高。功能性研究支持EV相关miR-21的致病作用。临床上，EV miR-21也与肾移植相关。miR-150在DKD中也受到关注。尽管不同研究因疾病背景、样本来源和检测方法报告了不同的EV来源miRNA，但对其靶点的功能富集分析揭示了对共同生物过程的汇聚。富集分析显示，EV相关miRNA的预测靶点主要参与细胞分化、迁移、凋亡、转录和miRNA调节以及细胞内信号转导的调控。其他RNA种类，包括mRNA、circRNA和lncRNA也被提议作为诊断生物标志物。例如，CCL2 mRNA在AKI和CKD模型尿液EVs中显著增加，并促进巨噬细胞介导的炎症。CCL21 mRNA在糖尿病肾病患者尿液EVs中上调，在疾病早期可检测，准确度高于eGFR和蛋白尿。转录组学分析也被应用于EVs，以发现疾病条件下的差异表达基因或识别潜在诊断生物标志物。一些研究特别关注EVs中的circRNA和lncRNA。例如，hsa_circ_0008925在TGF-β1诱导的近端小管细胞来源的EVs中表达增加，在肾小球疾病患者尿液EVs中得到验证，并与血清肌酐、eGFR等临床参数相关。
其他EV内容物
在CKD相关疾病中，研究除蛋白质和核酸外的EV组分的研究相对较少。一项研究关注常染色体显性多囊肾病患者尿液EVs中cAMP的存在。研究发现尿液EVs中cAMP水平呈双峰模式变化。另一项研究检查了IKK2/NF-κB信号通路在CKD相关血管钙化中的作用，发现抑制该通路加剧了血管矿化、僵硬和EV钙化。研究表明钙化EVs参与血管骨生成和矿化。
3.2 EVs作为治疗工具
多项研究探索了EVs在CKD中的潜在治疗应用，包括在细胞培养中生产EVs、从生物体液中分离或修饰它们以增强其靶向性或功能。本部分概述了在CKD及相关疾病中已被提议或用于治疗目的的EV来源和内容物类型。
EV来源：MSCs
大多数关于EVs的治疗性研究基于细胞培养来源。其中，MSC来源的EVs占近一半的研究，并与多种疾病相关。MSC来源的EVs因其较低的免疫原性而具有吸引力。一项研究发现，缺氧刺激的脂肪来源MSC (Adipose-derived MSC, AMSC) EVs在输尿管梗阻小鼠模型中通过降低TNF-α和IL-6水平及抑制细胞凋亡改善了肾功能。在猪的肾血管疾病模型中，MSC来源的EVs恢复了血管生成因子，改善了皮质微血管和管周毛细血管密度，并减轻了细胞凋亡、氧化应激和纤维化。一项临床试验评估了人脐带MSC来源的EVs在III期和IV期CKD患者中的治疗潜力，结果发现其增加了血浆TGF-β1、IL-10和TNF-α水平，并降低了死亡率，改善了肾功能。
EV来源：肾脏细胞培养
KCC来源的EVs是治疗性研究中另一个常用的来源，常用于不同疾病模型。一项旨在实现CKD中完全肾组织再生的研究开发了一种生物活性支架，包含生物活性成分、中间中胚层细胞以及在其分化为肾祖细胞过程中分离的EVs。在肾大部切除小鼠模型中应用该支架促进了损伤肾脏的再生。在后续研究中，研究人员通过掺入过表达SDF1α（旨在募集干细胞至损伤部位）并装载自由基清除剂依达拉奉的工程化EVs增强了支架。在严重CKD小鼠模型中，含有褪黑素调节的人脐带MSC来源EVs的多功能支架也显示出疗效。在AKI和糖尿病肾病模型中，肾小管细胞来源的EVs也显示出保护作用。
EV来源：生物体液
尽管血液和尿液是诊断研究中最常用的EV来源，但报道的治疗应用相对较少。一项研究从健康小鼠中分离尿液EVs，鉴定出多囊蛋白 (polycystin, PC1和PC2) 的存在。将这些含有PC1/PC2的尿液EVs给予多囊肾病小鼠模型，挽救了遗传缺陷，减少了肾脏大小和囊肿指数。尿液EVs也因含有抗衰老和肾脏保护蛋白Klotho而显示出对肾损伤的治疗作用。
EV来源：组织
组织尚未被广泛研究为治疗性EVs的来源。然而，一项研究假设通过代谢工程重编程骨骼肌中的EV分泌可能为CKD提供一种治疗方法。研究发现，在慢性组织损伤期间，骨骼肌来源的EVs有助于疾病进展。而高强度运动或腺病毒介导的肌肉线粒体转录因子A过表达增强了线粒体活性，增加了EV分泌，并改变了EV内容物。用这些体内重编程的肌肉来源EVs治疗CKD小鼠模型，在肾脏中减少了促炎细胞浸润、细胞因子表达、肌成纤维细胞活化和基质沉积。
EV来源：内皮细胞和血管平滑肌细胞
只有有限数量的研究调查了内皮细胞和VSMCs作为EV来源，但一些关键发现提示了在CKD相关疾病中的良好治疗效果。研究发现羊膜内皮细胞 (Amniotic Endothelial Cell, AEC) 来源的EVs在缺血再灌注损伤和顺铂诱导的肾毒性中具有肾保护作用。VSMC来源的EVs是CKD患者血管钙化的关键贡献者。研究表明，VSMC来源的EVs与成骨细胞来源的EVs共享相似内容物，高钙水平促进钙化EVs的分泌。靶向VSMC来源EVs与细胞外基质组分的相互作用或其分子内容物可能为限制CKD疾病进展提供策略。
其他EV来源
其他来源，如干细胞、免疫细胞和心球细胞，也在CKD相关疾病中被探索。一项研究评估了脂肪干细胞来源的EVs作为血管紧张素II受体阻滞剂氯沙坦的佐剂。在肾大部切除大鼠中，联合给药显著降低了肾小球硬化和间质浸润，同时改善了肾功能。另一项研究开发了负载氯沙坦的巨噬细胞来源EVs以增强药物递送。在阿霉素诱导的肾病小鼠中，这些EVs降低了血清肌酐、血尿素氮、肾小管损伤和肾小球硬化，通过下调肾素-血管紧张素系统发挥了抗纤维化和抗炎作用。
EV内容物：蛋白质
与诊断研究一样，大多数描述的治疗机制与EV携带的蛋白质相关。EVs不仅被用作天然载体，许多方法还专注于工程化它们以将蛋白质递送至损伤组织并增强其内在治疗活性。例如，通过过表达转录因子Oct-4来工程化MSC来源的EVs用于AKI治疗。另一项研究通过将MSC来源的EVs封装在MMP2响应性水凝胶中来增强其治疗能力并延长其半衰期。此外，一些研究探索了使用红细胞 (Red Blood Cell, RBC) 来源的EVs作为治疗载体，因其高生物相容性、生物安全性、非免疫原性、丰度高且缺乏核或线粒体DNA。在一项研究中，RBC来源的EVs被工程化以特异性靶向损伤的肾小管上皮细胞，并装载针对P65和Snai1的siRNA，减少了肾
