综述：周细胞中钙激活的氯通道及其在调节器官血流中的作用

《The Journal of Physiology》：Calcium-activated chloride channels in pericytes and their role in regulating organ blood flow

　　

周细胞是微脉管系统的壁细胞，具有独特的“木节状”形态特征，其细长的突起沿着毛细血管以及毛细血管前、后段的腔外表面延伸。它们广泛分布于各器官，并表现出功能异质性。收缩性周细胞直接调节局部血流，而非收缩性周细胞则通过产生去极化或超极化事件（这些事件可向上游血管传播并协调组织灌注）来参与电信号传导。这些功能与细胞内离子稳态密切相关。最近的证据强调了钙离子（Ca2+）激活的氯离子（Cl?）通道（Calcium-activated Chloride Channels, CaCCs），特别是跨膜蛋白16A（TMEM16A，亦称ANO1），在将细胞内Ca2+信号与膜去极化及周细胞活动耦联中的作用。在收缩性周细胞中，TMEM16A介导的电流促进去极化，从而激活L型电压门控Ca2+通道（L-type Voltage-gated Ca2+channels），促进Ca2+内流以支持收缩。在非收缩性毛细血管周细胞中，周期性产生的TMEM16A依赖性去极化有助于自发电活动的启动和传播，从而支持微血管网络内的细胞间同步。或者，异步的TMEM16A依赖性去极化可以相互叠加，以维持静息膜电位和基础血管张力。在本综述中，研究人员总结了目前对跨器官周细胞中CaCC通道功能的理解，并讨论了未来研究和治疗靶向的新方向。

引言

周细胞是微脉管系统的壁细胞，最早于19世纪70年代被描述。其胞体具有特征性的“木节状”形态，位于毛细血管的腔外表面。周细胞表达多种分子标记物，如血小板衍生生长因子受体β（PDGFRβ）和神经胶质抗原2（NG2）。周细胞在形态和功能上具有异质性，在中枢神经系统（CNS）中，至少可区分出包鞘（或收缩）型、网状型和细丝型三种亚型。在内脏器官中，周细胞同样表现出显著的形态多样性。周细胞的功能广泛，包括调节局部血流、调节新生血管形成、维持血管完整性以及表达免疫样特性。本综述聚焦于周细胞如何调节局部血流动力学，重点关注Ca²⁺激活的氯通道（CaCCs）及其他氯通道的贡献。

周细胞中的氯通道：一个新兴且尚未充分探索的领域

与血管平滑肌细胞（SMCs）和内皮细胞（ECs）中的离子通道相比，人们对周细胞，特别是氯通道的离子通道组成了解较少。平滑肌细胞和内皮细胞中描述的氯通道类型包括由TMEM16A（ANO1）基因编码的CaCCs、bestrophins（如Best3）、CLC家族通道、体积调节性阴离子通道（VRAC，由LRRC8A基因编码）和囊性纤维化跨膜电导调节因子（CFTR）通道。转录组学数据分析表明，周细胞表达多种阴离子通道。其中，氯/碳酸氢根（Cl^?/HCO₃^?）交换体AE2和钠-钾-氯协同转运蛋白1（NKCC1）在周细胞中高表达，这有助于维持细胞内升高的氯离子浓度（[Cl^?]_i）。升高的[Cl^?]_i使得氯离子平衡电位（E_Cl）相对去极化，因此，氯通道的激活导致氯离子外流，会引起膜去极化，进而激活L型电压门控钙通道（L-type Ca_v），增加细胞内钙浓度（[Ca²⁺]_i）并引起收缩。在周细胞中，类似的功能研究较少，但越来越多的研究表明，氯电流可在收缩激动剂作用下被激活，并导致膜去极化。然而，周细胞内氯离子浓度尚未被直接量化，这是未来研究的重要方向。

TMEM16A/ANO1参与收缩性周细胞对G_qPCR激活的应答

收缩性周细胞的张力由细胞内钙浓度（[Ca²⁺]_i）调节。TMEM16A/ANO1编码的CaCCs在平滑肌细胞和周细胞中表达，可被G_q蛋白耦联受体（G_qPCR）激活后，通过肌醇1,4,5-三磷酸（IP₃）诱导肌浆/内质网（SR/ER）释放钙而引起的[Ca²⁺]_i升高所激活。CaCCs的开放引起膜去极化，从而激活L型Ca_v通道，放大钙内流和收缩反应。TMEM16A/ANO1的结构是同源二聚体，具有多个可变剪接外显子，产生具有不同功能特性的多种异构体。该通道还受磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP₂）等调节。CaCCs已在多个组织和器官的周细胞中被鉴定，包括视网膜、肾脏、大脑和骨骼肌。TMEM16A/ANO1已被证实编码啮齿动物和人类大脑皮层周细胞以及啮齿动物骨骼肌周细胞中的CaCCs。在脑周细胞中，TMEM16A电流可被选择性抑制剂Ani9抑制，并占全细胞钙激活电流的很大一部分。药理学抑制TMEM16A或通过抑制NKCC1降低细胞内氯离子浓度，可抑制周细胞收缩并防止毛细血管在G_qPCR激活下的缩窄。在啮齿动物中风模型中，抑制TMEM16A/ANO1减少了缺血引起的[Ca²⁺]_i升高，降低了毛细血管收缩，并限制了周细胞死亡和中性粒细胞停滞，从而改善了体内脑血管再灌注。孟德尔随机化分析进一步将TMEM16A/ANO1表达改变与人类缺血性卒中后恢复受损联系起来。这些发现确立了TMEM16A/ANO1是脑毛细血管功能的关键调节因子，也是中风、阿尔茨海默病和血管性痴呆等微血管血流障碍的潜在治疗靶点。

自发性钙瞬变诱导的TMEM16A/ANO1激活

TMEM16A/ANO1通道可被G_qPCR介导的钙内流和IP₃介导的肌浆网钙释放激活。然而，有证据表明，自发性钙释放对于其他器官周细胞中TMEM16A的激活也可能很重要。

TMEM16A参与自发性瞬时内向电流及相关自发性瞬时去极化的产生

在视网膜或直小血管降支的离体微血管中，周细胞产生自发性瞬时内向电流（STICs），从而引起相应的自发性瞬时去极化（STDs）。STICs可被血管紧张素II等G_qPCR激动剂增强，并可被广谱氯通道抑制剂（如尼氟酸或9-蒽羧酸）显著减弱，表明STICs源于CaCCs的开放。在直小血管周细胞中，血管紧张素II诱导的STICs与钙瞬变同步发生，且可被兰尼碱或咖啡因抑制，表明肌浆网钙释放在CaCC依赖性STICs/STDs的产生中起主要作用。自发性钙瞬变也被细胞外钙去除或钙库操纵性钙内流（SOCE）抑制剂SKF96365抑制，但不受L型钙通道抑制剂硝苯地平影响，这表明Ca_v非依赖性途径介导的钙内流（例如瞬时受体电位C3通道或Orai介导的SOCE）可能参与了周细胞中CaCC依赖性STICs/STDs的产生。

异步自发性钙瞬变

在小鼠大脑中段毛细血管周细胞中已证实存在异步自发性钙瞬变。假设TMEM16A/ANO1表达在中段毛细血管周细胞中得以维持，则可以推测异步自发性钙瞬变可能促进TMEM16A/ANO1通道开放，从而在这些周细胞中产生STICs和STDs。可以推测，异步自发性钙瞬变会导致单个毛细血管周细胞产生STICs/STDs，以将其静息膜电位维持在约-40 mV的相对去极化水平。在膀胱黏膜下层的微静脉中，尼氟酸可使膜超极化约10 mV，提示TMEM16A/ANO1对其静息膜电位有贡献。在视网膜微血管树中，特别是毛细血管段，膜电位的变化可通过下方的内皮细胞合胞体有效传播。因此，单个周细胞的CaCC依赖性去极化可能传递到相邻周细胞。毛细血管内CaCC依赖性去极化的总和有助于形成相对去极化的静息膜电位，该电位接近L型钙通道的激活阈值。这种去极化的静息膜电位可以传播到上游含有收缩性壁细胞的微血管段，从而引发L型钙通道介导的钙内流，促进基础微血管张力。在大脑中，非收缩性细丝型周细胞感知邻近神经元的代谢需求，并产生传播的ATP敏感性钾通道（K_ATP）依赖性超极化，从而增加活性神经元的血液供应。在心脏中，心室肌细胞代谢需求增加会降低细胞内ATP浓度，导致K_ATP通道开放引起超极化，这种超极化可能通过心肌细胞和毛细血管内皮细胞之间的缝隙连接电耦联传递到邻近毛细血管。由此产生的内皮超极化也将传递到周细胞和小动脉平滑肌细胞，降低其[Ca²⁺]_i，导致其松弛，从而增加局部冠状动脉血流供应活跃的心肌细胞。目前尚不清楚K_ATP介导的钙处理调节是否会影响心脏周细胞中的TMEM16A/ANO1活性，这种耦联对周细胞功能的生理意义也有待阐明。

TMEM16A/ANO1参与内脏器官周细胞的同步自发性钙瞬变

在膀胱黏膜下层的微血管网络中，细丝型周细胞沿毛细血管分布，而毛细血管前微动脉（PCAs）由包鞘型周细胞覆盖，后者与环绕排列的小动脉平滑肌细胞不同。毛细血管后微静脉（PCVs）和集合微静脉则由网状周细胞包裹。膀胱黏膜下层的细丝型周细胞不表达α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），因此被认为是非收缩性的，而位于其他微血管段的表达α-SMA的周细胞（α-SMA⁺）与小动脉平滑肌细胞一起具有收缩性。有趣的是，位于膀胱黏膜下层毛细血管、以及PCA、PCV和微静脉的周细胞会产生自发性钙瞬变，这些瞬变在其网络中表现出时间同步性。自发性钙瞬变驱动含有α-SMA⁺收缩性周细胞的毛细血管前、后微血管段产生自发性阶段性收缩。小动脉的自发性阶段性收缩通过调节微血管阻力和血流分布来增强毛细血管-组织交换，而微静脉的自发性阶段性收缩则促进静脉引流。在膀胱微循环中，周细胞表现出TMEM16A/ANO1表达的层次模式，其中毛细血管周细胞表达水平最高，PCA和PCV周细胞中等，微静脉周细胞最低。因此，单个周细胞中自发性钙瞬变触发的TMEM16A/ANO1依赖性去极化可能沿微血管段（特别是毛细血管）传播，从而促进钙瞬变的细胞间同步。与其高TMEM16A/ANO1表达一致，非收缩性毛细血管周细胞似乎起搏细胞作用，驱动PCA中自发性钙瞬变。缝隙连接阻滞剂羧苄索龙可阻止PCA周细胞产生钙瞬变，同时破坏毛细血管周细胞间钙瞬变的细胞间同步性。广谱氯通道抑制剂DIDS对PCA和毛细血管钙瞬变产生类似的抑制作用。此外，特异性TMEM16A/ANO1抑制剂Ani9破坏了毛细血管中自发性钙瞬变的同步性，表明毛细血管中同步的自发性钙瞬变是由传播的TMEM16A/ANO1依赖性STDs介导的。直肠黏膜下毛细血管中表达TMEM16A/ANO1的周细胞似乎也起到起搏细胞作用，驱动网络范围内自发性钙瞬变的同步。在膀胱和胃肠道，周细胞中的自发性钙瞬变可被抑制IP₃受体介导或兰尼碱受体介导的钙释放所消除，具体取决于微血管段。因此，TMEM16A/ANO1 CaCCs是将细胞内钙信号与膜去极化联系起来的关键环节，从而启动和协调周细胞中的自发电活动。

TMEM16A/ANO1介导的传播性去极化

钙通道对同步钙瞬变的贡献在不同微血管段的周细胞中有所不同。在位于PCA和PCV的膀胱周细胞中，抑制L型钙通道会破坏同步钙瞬变，仅留下在单个周细胞中独立发生的异步钙事件。在膀胱黏膜下层的微静脉中，尼卡地平消除了周期性慢波，留下较小的、尼氟酸敏感的STDs。这表明CaCC依赖性STDs不足以有效传播到相邻细胞，部分原因可能是TMEM16A/ANO1表达较低。因此，这些微血管段内的细胞间同步性似乎依赖于再生性L型钙通道介导的去极化的传播，从而触发钙诱导的钙释放。相比之下，直肠PCA和胃肌间PCA周细胞的钙瞬变同步性不受L型钙通道抑制的影响，但可被L型和T型钙通道联合抑制所中断。毛细血管周细胞的钙瞬变同步性不受L型或T型钙通道抑制的破坏，但可被经典CaCC抑制剂或Ani9消除。这表明TMEM16A/ANO1依赖性STDs足以在毛细血管周细胞网络中有效传播。由于电紧张性去极化随距离衰减，TMEM16A/ANO1依赖性STDs可能需要再生机制来支持长距离传播。毛细血管周细胞中的自发性钙瞬变可能通过去极化诱导的肌浆网钙释放而放大，正如在孤立的中枢神经元中所证实的那样，去极化本身通过激活磷脂酶C依赖性IP₃产生来触发钙释放。慢波的细胞间同步性已通过去极化诱导的、IP₃介导的钙库钙释放模型得到很好的解释，该模型允许远距离细胞通过缝隙连接传播去极化电流而同步振荡。因此，去极化诱导的、IP₃介导的肌浆网钙释放可能赋予了TMEM16A/ANO1依赖性STDs再生能力，使其能够在周细胞网络中传播。质膜TMEM16A/ANO1已知可将肌浆网钙库拴系到膜筏区室，使TMEM16A/ANO1与IP₃受体共定位。因此，在表达高水平TMEM16A/ANO1的毛细血管周细胞中，区室化的肌浆网钙释放可能与TMEM16A/ANO1激活紧密耦联，从而实现稳健高效的通道激活。中枢神经系统毛细血管周细胞也表现出高TMEM16A/ANO1表达和大的TMEM16A/ANO1介导电流；然而，这些细胞是否能够产生同步自发性钙瞬变尚不清楚。与大脑相比，内脏器官毛细血管周细胞可能具有更强的肌浆网钙释放能力或更高的细胞内IP₃水平，这可能解释了它们增强的产生同步自发性钙瞬变的能力。

周细胞-内皮相互作用（传导通路）

周细胞中产生的CaCC依赖性STICs/STDs可以通过直接的周细胞-周细胞电耦联或间接地通过内皮细胞合胞体传递到相邻周细胞。在直小血管中，周细胞沿微血管密集排列，即使在没有完整内皮的情况下，细胞间电耦联也高度协调，这表明有效的周细胞间耦联。相比之下，在离体视网膜微血管的毛细血管中，细胞间电压传递主要由内皮介导。同样，在大脑的中段毛细血管中，周细胞具有细长的突起且分布稀疏，相邻周细胞突起的尖端通常非常接近但没有直接接触或重叠。尽管视网膜中已证实存在周细胞间隧道纳米管（被认为是细胞内钙波的导管），但它们在其他血管中的功能意义尚不清楚。因此，内皮似乎在传递内脏器官周细胞中CaCC或钙通道依赖性去极化信号以及中枢神经系统周细胞中K_ATP依赖性超极化信号方面起着核心作用。除了内皮作为低电阻电传导通路的作用外，内皮来源的电信号和体液信号似乎在维持同步自发性钙波，进而维持CaCC依赖性慢波方面起着关键作用。在直肠黏膜下PCA周细胞中，细胞外钾浓度升高至约30 mM、内向整流钾通道（Kir）阻断剂Ba²⁺或Kv7通道抑制剂XE991，都将同步钙瞬变转变为高频异步钙瞬变，表明膜去极化破坏了自发性钙瞬变的周期性和同步性。钾通道开放剂左克罗卡林可促进膜复极化，从而恢复钙瞬变的同步性。左克罗卡林单独作用可使膜超极化，阻止钙瞬变的产生或降低其频率。这些结果表明，适当的静息膜电位是同步钙瞬变及相关CaCC依赖性慢波发展所必需的。Kir2.1通道主要在直肠黏膜下内皮细胞中表达，而不在周细胞中表达，尽管脑周细胞中已证实存在Kir2.1表达；因此，内皮Kir2.1依赖性超极化信号可能传递到周细胞以稳定其静息膜电位。在直肠毛细血管周细胞中，内皮环氧合酶-2（COX-2）依赖性前列环素（PGI₂）的产生似乎通过激活K_ATP通道稳定周细胞静息膜电位，从而有助于维持自发性钙瞬变的同步性。

邻近细胞对自发活动的调节

在内脏器官中，微血管网络接收分段特异性神经支配。小动脉平滑肌细胞接受双重自主神经支配，包括兴奋性交感神经和抑制性一氧化氮（NO）释放副交感神经，以及降钙素基因相关肽（CGRP）释放感觉神经。小动脉平滑肌细胞中TMEM16A/ANO1低表达，加上高度超极化的静息膜电位（约-70 mV），可以解释交感小动脉收缩对Ani9不敏感的原因。PCA中的收缩性包鞘型周细胞接受NO释放和CGRP释放神经输入，这些输入可降低[Ca²⁺]_i，而交感神经钙升高则不存在。由于PCA周细胞表达TMEM16A/ANO1，[Ca²⁺]_i降低将通过关闭TMEM16A/ANO1 CaCCs使膜超极化，导致L型钙通道失活和PCA扩张。微静脉接受α-肾上腺素能兴奋性和β-肾上腺素能NO介导的抑制性交感神经支配。尽管微静脉周细胞TMEM16A/ANO1表达较低，但Ani9可阻止与微静脉扩张相关的自发性微静脉收缩。由于微静脉周细胞静息膜电位相对去极化（约-45 mV），即使很小的TMEM16A/ANO1依赖性STDs似乎也足以激活L型钙通道。因此，β-肾上腺素能、NO介导的微静脉扩张可能是由NO诱导的[Ca²⁺]_i降低引起的，这与通过关闭TMEM16A/ANO1 CaCCs导致的膜超极化有关。非收缩性毛细血管周细胞似乎缺乏直接的形态或功能神经支配；因此，它们的功能预计受局部组织环境调节。如上所述，非收缩性毛细血管周细胞作为代谢哨兵，响应邻近细胞（如中枢神经系统中的神经元或心脏中的心肌细胞）活动增加导致的局部能量亏缺，通过产生K_ATP依赖性超极化信号来扩张上游收缩性微血管段。在骨骼肌中，毛细血管周细胞可以通过检测扩散因子（如NO、腺苷或K⁺）来感知肌肉收缩，从而产生超极化信号以使上游小动脉扩张。在外尿道括约肌中，表达神经元一氧化氮合酶（nNOS）的横纹肌纤维在括约肌收缩期间从其肌膜释放NO，从而降低相邻毛细血管周细胞的[Ca²⁺]_i。由于毛细血管周细胞表达TMEM16A/ANO1，[Ca²⁺]_i的降低可能通过关闭TMEM16A/ANO1通道诱导膜超极化。这些超极化信号可以向上游传播，扩张收缩性微血管段，从而增加对活跃外尿道括约肌肌纤维的血液供应。在骨骼肌中，肌肉收缩诱导源自毛细血管水平的远程小动脉扩张；这种反应可被NO合成抑制或K_ATP通道阻断所减弱。考虑到骨骼肌毛细血管中TMEM16A/ANO1的表达，肌肉来源的NO可能降低周细胞中的[Ca²⁺]_i，通过关闭TMEM16A/ANO1通道导致膜超极化。

临床相关性

TMEM16A/ANO1通道在多个器官和组织的周细胞中高表达，在调节周细胞兴奋性和局部微血管血流等功能中起关键作用。TMEM16A/ANO1也与人类血管疾病有关。孟德尔随机化研究将TMEM16A表达改变与缺血性卒中后不良临床恢复联系起来。单核苷酸突变与烟雾病有关，尽管改变的通道活性、血管狭窄和侧支血管形成之间的机制关系仍不清楚。TMEM16A/ANO1已被提议作为具有微血管成分的疾病（包括缺血性卒中、血管性痴呆和阿尔茨海默病）的潜在治疗靶点。TMEM16A/ANO1对周细胞生理学的显著贡献突出了其在更广泛疾病（如膀胱过度活动症、肾或心脏缺血）中的潜在相关性。TMEM16A/ANO1的整体结构架构与其他离子通道和转运蛋白无关，这为开发特异性靶向TMEM16A/ANO1的选择性化合物提供了机会。然而，TMEM