《The Journal of Physiology》：The endocrine product of renal (preglomerular) contractile pericytes depends on prolyl-4-hydroxylases 2 and 3
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肾脏肾小球旁肾素生成细胞和肾小球前血管平滑肌细胞是两类具有显著可塑性的特化周细胞。在严重低血压或缺盐条件下，肾小球前血管平滑肌细胞可转化为肾素生成细胞；而当缺氧诱导因子-2α因脯氨酰-4-羟化酶2和3缺失而稳定时，肾素细胞可转化为促红细胞生成素生成细胞。这些发
肾脏肾小球旁肾素生成细胞和肾小球前血管平滑肌细胞是两类具有显著可塑性的特化周细胞。在严重低血压或缺盐条件下，肾小球前血管平滑肌细胞可转化为肾素生成细胞；而当缺氧诱导因子-2α因脯氨酰-4-羟化酶2和3缺失而稳定时，肾素细胞可转化为促红细胞生成素生成细胞。这些发现引出一个问题：脯氨酰-4-羟化酶2和3是否同样调控肾小球前血管平滑肌细胞的内分泌可塑性？为探究脯氨酰-4-羟化酶2和/或3在（肾小球前）收缩性周细胞中的作用，研究人员在基础条件下或通过低盐饮食联合血管紧张素转换酶抑制剂依那普利处理以刺激肾素生成后，检测了可诱导的平滑肌肌球蛋白重链特异性缺失脯氨酰-4-羟化酶2和/或3的小鼠模型。在基线状态下，尽管脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷小鼠中存在缺氧诱导因子-2α稳定，但所有缺失均未改变肾小球前周细胞样血管平滑肌细胞中的肾素生成或诱导促红细胞生成素表达。然而，由脯氨酰-4-羟化酶2或脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺失引起的缺氧诱导因子-2α稳定触发了间质平滑肌肌球蛋白重链+收缩性周细胞中的促红细胞生成素生成。低盐饮食/依那普利处理诱导了对照、平滑肌肌球蛋白重链CreERT2脯氨酰-4-羟化酶2ff和平滑肌肌球蛋白重链CreERT2脯氨酰-4-羟化酶3ff小鼠血管平滑肌细胞和肾小球外系膜细胞中的肾素。相比之下，脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷小鼠的血管平滑肌细胞产生促红细胞生成素而非肾素，而肾素诱导仅持续存在于系膜细胞中。值得注意的是，尽管缺氧诱导因子-2α持续稳定，但这种低盐饮食/依那普利诱导的促红细胞生成素生成是可逆的。转录变化表明脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷血管平滑肌细胞从收缩/肾素细胞样特征向收缩/促红细胞生成素细胞样特征转变。这些发现表明，缺氧诱导因子-2α稳定决定了肾小球前血管平滑肌细胞和间质周细胞的内分泌产物。特别值得注意的是，脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3的缺失并不损害血管平滑肌细胞可逆性地承担内分泌功能的能力。
一、研究背景、问题与目的
肾脏承担着重要的内分泌功能，主要包括由肾小球旁器特化的肌内分泌性周细胞样细胞产生的肾素，以及由位于皮髓质交界处的间质血小板衍生生长因子受体-β阳性成纤维细胞/周细胞产生的促红细胞生成素。两者在调节血压、容量、电解质平衡以及红细胞生成方面发挥核心作用。值得注意的是，肾素生成细胞和促红细胞生成素生成细胞共享一个共同的间质细胞起源，并展现出显著的细胞可塑性。在特定生理或病理刺激下，肾小球前血管平滑肌细胞可逆地转化为肾素生成细胞，而肾素细胞在缺氧诱导因子-2α稳定时能转化为促红细胞生成素生成细胞。缺氧诱导因子-2α的稳定性受脯氨酰-4-羟化酶2和3的负向调控，它们是肾脏促红细胞生成素表达的关键调节因子。然而，对于同属周细胞谱系、具有可塑性的肾小球前血管平滑肌细胞，其内分泌产物（生成肾素还是促红细胞生成素）是否受到脯氨酰-4-羟化酶2和3的调控，以及这种调控如何影响其可逆性转化，尚不清楚。为解决这些问题，研究人员开展了本项研究，旨在阐明脯氨酰-4-羟化酶2和3在肾小球前血管平滑肌细胞内分泌功能决定和可塑性调控中的具体作用，相关成果发表于《The Journal of Physiology》。
二、主要关键技术方法概述
研究主要构建并使用了平滑肌肌球蛋白重链启动子驱动的他莫昔芬诱导性Cre重组酶小鼠模型，通过与携带LoxP侧翼脯氨酰-4-羟化酶2和/或3等位基因的小鼠杂交，获得平滑肌肌球蛋白重链细胞特异性缺失脯氨酰-4-羟化酶2、脯氨酰-4-羟化酶3或两者同时缺失的基因敲除小鼠。通过低盐饮食联合血管紧张素转换酶抑制剂依那普利处理来建立刺激肾素生成的模型。利用RNA原位杂交技术，特别是RNAscope多重荧光检测，结合免疫荧光和免疫组化，在组织水平精确分析特定mRNA和蛋白的表达定位与丰度。通过实时定量PCR、酶联免疫吸附测定检测肾组织和血浆中相关基因表达及蛋白水平。通过尾套法测量清醒小鼠的收缩压。所有动物实验均获得当地伦理委员会批准，并遵循相关动物使用指南。
三、研究结果
1. 脯氨酰-4-羟化酶2和脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷在基础条件下不诱导肾小球前血管平滑肌细胞产生促红细胞生成素，但可在间质收缩性周细胞中诱导
通过RNAscope证实，在野生型小鼠中，肾小球前平滑肌肌球蛋白重链+血管平滑肌细胞均表达脯氨酰-4-羟化酶2和脯氨酰-4-羟化酶3 mRNA。在平滑肌肌球蛋白重链细胞特异性缺失不同脯氨酰-4-羟化酶的小鼠中，基础状态下，所有基因型小鼠的肾素生成均无变化。尽管在脯氨酰-4-羟化酶2缺失和脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失小鼠中检测到肾组织和血浆促红细胞生成素水平显著升高，但RNAscope分析显示，促红细胞生成素mRNA的诱导仅发生在间质平滑肌肌球蛋白重链+/血小板衍生生长因子受体-β+收缩性周细胞中，而肾小球前血管平滑肌细胞中并未检测到促红细胞生成素表达。免疫组化结果显示，脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失导致了肾小球前血管平滑肌细胞中缺氧诱导因子-2α的明显稳定，但这并不足以在基础条件下激活其促红细胞生成素转录。
2. 低盐饮食联合血管紧张素转换酶抑制剂依那普利处理在脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷的肾小球前血管平滑肌细胞中诱导促红细胞生成素而非肾素
低盐饮食/依那普利处理可有效诱导对照、脯氨酰-4-羟化酶2缺失、脯氨酰-4-羟化酶3缺失小鼠肾小球前血管平滑肌细胞和肾小球外系膜细胞的肾素表达。然而，在脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失小鼠中，低盐饮食/依那普利处理并未诱导肾小球前血管平滑肌细胞产生肾素，而是触发了这些细胞表达促红细胞生成素mRNA，同时肾素诱导仅局限于肾小球外系膜细胞。这种内分泌产物的转换伴随着血浆肾素水平的相对降低和血浆促红细胞生成素水平的进一步升高。收缩压测量表明，低盐饮食/依那普利处理在对照组和双敲除组引起了同等程度的血压下降，排除了血压差异的干扰。缺氧诱导因子-2α免疫组化显示，在低盐饮食/依那普利处理的脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失小鼠中，血管平滑肌细胞中的缺氧诱导因子-2α稳定模式与基础状态相似。
3. 低盐饮食/依那普利诱导的脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺陷小鼠肾小球前血管平滑肌细胞促红细胞生成素表达是可逆的
通过让脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失小鼠和对照小鼠交替接受低盐饮食/依那普利处理和正常盐饮食，研究人员发现，每次低盐饮食/依那普利处理周期都会导致双缺失小鼠血浆促红细胞生成素水平升高，并在随后的正常盐饮食周期中回落到基线水平。血浆肾素水平也呈现相应的周期性变化，但在双缺失小鼠中，低盐饮食/依那普利诱导的肾素升高幅度始终低于对照组。RNAscope分析证实，促红细胞生成素阳性肾小球前血管平滑肌细胞仅在低盐饮食/依那普利处理周期后出现，而在正常盐饮食周期后基本消失。这表明，尽管存在持续的缺氧诱导因子-2α稳定，但肾小球前血管平滑肌细胞向促红细胞生成素生成表型的转化是可逆的。
4. 短期药理性脯氨酰-4-羟化酶抑制不诱导肾小球前血管平滑肌细胞或间质收缩性周细胞产生促红细胞生成素
为了模拟临床应用，研究人员对正常盐饮食或低盐饮食/依那普利处理的野生型小鼠给予脯氨酰-4-羟化酶抑制剂罗沙司他进行短期（12小时）处理。尽管在两种条件下均观察到广泛的缺氧诱导因子-2α稳定，但在肾小球前血管平滑肌细胞、肾小球旁细胞或间质收缩性周细胞中均未检测到促红细胞生成素mRNA的诱导。强烈的促红细胞生成素表达仅出现在皮质和髓质外带的间质成纤维细胞中。这表明，短期缺氧诱导因子-2α稳定不足以触发肾小球前血管平滑肌细胞或间质收缩性周细胞的内分泌表型转换。
5. 脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺失诱导肾小球前血管平滑肌细胞从收缩/肾素细胞样特征向收缩/促红细胞生成素细胞样特征的转录转换
通过RNAscope对多种细胞标志物进行靶向空间分析，研究人员比较了不同条件下肾小球前血管平滑肌细胞的转录特征。在脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3双缺失小鼠中，即使在基础条件下，肾小球前血管平滑肌细胞也失去了肾素细胞标志物醛酮还原酶家族1成员B7和连接蛋白40的表达，同时获得了促红细胞生成素细胞相关标志物如缺氧诱导因子-2α靶基因肾上腺髓质素和分化簇73的表达。收缩性标志物如平滑肌肌球蛋白重链、连接蛋白45、G蛋白信号调节蛋白5的表达得以维持。这种转录谱的变化表明，脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺失驱使肾小球前血管平滑肌细胞从一种更偏向于肾素细胞的特征，转向一种更偏向于促红细胞生成素细胞但同时保留收缩性特征的混合表型。
四、讨论与结论总结
本研究系统探讨了脯氨酰-4-羟化酶2和3在调控肾小球前血管平滑肌细胞和间质收缩性周细胞内分泌功能决定中的核心作用。主要结论可归纳如下：
首先，缺氧诱导因子-2α的稳定是决定肾小球前血管平滑肌细胞和间质周细胞内分泌产物的关键开关。在脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3缺失导致的持续缺氧诱导因子-2α稳定背景下，当受到低盐饮食/依那普利处理等肾素诱导刺激时，肾小球前血管平滑肌细胞不再分化为肾素生成细胞，而是转向产生促红细胞生成素。
其次，这种内分泌表型的转换是可逆的，并且不依赖于短期缺氧诱导因子-2α稳定。即使缺氧诱导因子-2α持续稳定，一旦刺激解除，血管平滑肌细胞的促红细胞生成素生成表型也会逆转，这表明脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3的缺失并未损害血管平滑肌细胞可逆性承担内分泌功能的内在可塑性。
第三，不同的细胞类型对脯氨酰-4-羟化酶缺失和缺氧诱导因子-2α稳定的响应存在差异。间质收缩性周细胞在基础条件下即可被激活产生促红细胞生成素，而肾小球前血管平滑肌细胞则需要额外的生理刺激（如低血压）才能启动促红细胞生成素程序。
最后，在分子水平上，脯氨酰-4-羟化酶2/脯氨酰-4-羟化酶3的缺失引发了肾小球前血管平滑肌细胞的转录重编程，使其特征从收缩/肾素细胞样转变为收缩/促红细胞生成素细胞样。
综上所述，本研究揭示了脯氨酰-4-羟化酶-缺氧诱导因子轴在肾脏周细胞内分泌命运决定中的精细调控机制，强调了细胞类型特异性和生理信号整合的重要性，为理解肾脏内分泌细胞的可塑性及其在相关疾病中的变化提供了新的见解。
