氧化锌和氧化铜纳米颗粒与那西菌素结合后对金黄色葡萄球菌的协同基因组效应

《Nano-Structures & Nano-Objects》：Synergistic genomic effects of zinc oxide and copper oxide nanoparticles conjugated with nisin on Staphylococcus aureus

　　帕里萨·霍塞尼 | 西敏·拉希迪 | 巴赫拉姆·戈莱斯塔尼·埃玛尼
伊朗乌尔米亚伊斯兰自由大学生物学系

摘要
全球范围内抗菌耐药性的加剧显著削弱了传统抗生素的有效性，迫切需要创新和可靠的抗菌策略。纳米生物技术的进步突出了金属氧化物纳米颗粒，尤其是氧化锌（ZnO）和氧化铜（CuO）纳米颗粒作为具有显著抗菌活性的经济可行材料。本研究评估了ZnO纳米颗粒、CuO纳米颗粒、nisin以及与nisin结合的氧化锌和氧化铜纳米颗粒对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus, S. aureus）的抗菌效果。细菌培养物暴露于不同浓度（25、50、100和150μg/mL）下，持续时间为2、4、6、8和24小时。通过RAPD-PCR分析评估基因反应，并使用NTSYS-PC软件通过Dice相似系数对结果条带模式进行量化，然后进行UPGMA聚类。结果表明，CuO、ZnO纳米颗粒和nisin单独使用都能抑制细菌生长；然而，与nisin结合的氧化锌纳米颗粒（ZnO-nisin）和氧化铜纳米颗粒（CuO-nisin）表现出显著的增强抗菌效果。值得注意的是，ZnO-nisin和CuO-nisin在S. aureus中引起的基因组改变较少，表明其具有较低的诱变效应，同时保持强大的抗菌活性。总体而言，这些发现表明，功能化的金属氧化物纳米颗粒结合了高抗菌效果和良好的生物相容性，使其成为对抗耐药性病原体的下一代抗菌应用的有希望的候选材料。

引言
抗菌耐药性的加速传播已成为一个重大的全球健康问题，威胁到当前抗生素疗法的有效性[1]。耐药微生物越来越多地与医院和社区获得性感染相关，其中许多感染难以管理，并导致严重的疾病和死亡[2]。世界卫生组织的报告显示，医疗相关感染影响了大量住院患者，凸显了这一危机的严重性。这些趋势突显了迫切需要能够规避或中和耐药途径的创新抗菌策略[3][4]。金黄色葡萄球菌（S. aureus）是一种革兰氏阳性病原体，涉及多种人类感染，常被用作抗菌研究的模型生物。这种兼性厌氧菌在临床上非常重要，与从表皮感染到肺炎、骨髓炎、心内膜炎和中毒性休克综合症等严重疾病有关[5][6]。临床和社区环境中多重耐药菌株的增加再次强调了其作为关键全球健康挑战的地位。因此，开发创新、安全、可持续的策略来对抗S. aureus仍然是传染病研究的紧迫焦点[7]。纳米技术的不断进步为设计和开发创新治疗手段提供了新的机会。在各种纳米材料中，金属纳米颗粒如氧化锌纳米颗粒（ZnO NPs）和氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）因生产成本低、合成简单以及显著的抗菌活性而受到广泛关注[8][9]。当这些纳米颗粒缩小到纳米级别时，其大的表面积与体积比大大增加了反应性，并促进了与微生物细胞的密切相互作用[10]。美国食品药品监督管理局认为ZnO NPs通常是安全的，并已证明它们能根据颗粒大小和应用浓度抑制细菌繁殖[11][12]。它们具有广谱抗菌特性，可针对多种微生物，如大肠杆菌（Escherichia coli）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、S. aureus、黄色沙雷菌（Sarcina lutea）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、白色念珠菌（Candida albicans）和黑曲霉（Aspergillus niger）[13][14]。除了抗菌和抗真菌功能外，ZnO NPs还表现出显著的抗病毒特性，能有效抑制HSV-1和柯萨奇病毒B4（Cox B4）的复制，显示出作为可持续纳米材料的潜力[15]。它们的广谱生物活性源于多种协同机制，包括破坏微生物细胞壁、生成活性氧（ROS）、控制释放锌离子以及随后抑制细胞复制[16][17]。同样，CuO NPs也对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌表现出强烈的抑制作用。先前的研究报道了它们对大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）、弗氏志贺菌（Shigella flexneri）、普通变形杆菌（Proteus vulgaris）和S. aureus等病原体的广谱效果[18][19]。除了抗菌作用外，CuO NPs还表现出强烈的抗真菌活性，在实验室和田间条件下都能有效抑制导致黄瓜根腐病的镰刀菌（Fusarium solani）[20]。它们的抗菌机制主要归因于与带负电荷的微生物膜的静电相互作用，导致结构破坏、氧化应激、蛋白质变性和核酸降解。由于这些特性，CuO NPs越来越多地被应用于抗菌涂层、伤口愈合敷料、医疗纺织品和水净化系统[21][22]。此外，细胞研究表明，CuO NPs能诱导HeLa细胞内ROS生成，破坏线粒体功能并触发细胞凋亡，从而显著减少宫颈癌细胞的增殖，支持其作为安全有效的抗癌剂的潜力[23]。随着纳米技术的进步，抗菌肽也重新成为替代或补充传统抗生素的有希望的候选物质。其中，nisin是一种来自乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的核糖体产生的细菌素，已被批准为安全的食品防腐剂，并在食品行业中广泛应用[24][25]。先前的研究表明，nisin能有效抑制多种耐药细菌物种的增殖，包括肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）、艰难梭菌（Clostridium difficile）和S. aureus。此外，nisin还表现出广谱抗菌活性，可对抗革兰氏阳性和革兰氏阴性病原微生物[26]。其抗菌作用主要基于双重机制：高亲和力结合脂质II，随后在细胞质膜中形成孔洞，破坏质子驱动力，耗尽细胞内ATP，并停止肽聚糖的生物合成[27][28]。nisin还与阴离子细胞壁聚合物如壁酸和脂壁酸相互作用，刺激自溶酶活性，最终导致细胞裂解[29][30]。尽管其对革兰氏阳性生物具有强效活性，但其实际效果可能因细菌耐药途径和在复杂生物系统中的不稳定性而减弱[31]。最近的研究表明，nisin不仅由于其显著增强的抗菌活性（可能与细胞内ROS生成增加有关），还对癌细胞表现出强烈的细胞毒性，对正常细胞的影响很小，这突显了其作为有希望的抗癌剂的潜力[32]。此外，nisin处理显著下调了结直肠癌细胞系中关键转移基因的表达，表明其在抑制癌细胞迁移和侵袭方面的潜力[33]。最新研究表明，将纳米颗粒与抗菌肽或标准抗生素结合可以产生比单一化合物更强的协同效应。这种方法提高了抗菌性能，同时减少了剂量，从而降低了细胞毒性并减缓了耐药性的发展[34][35]。证据表明，ZnO NPs可增强β-内酰胺类、氨基糖苷类和糖肽类抗生素的活性，而CuO NPs与天然肽结合时效果更佳[36]。类似地，含有ZnO和CuO NPs的聚合物基水凝胶实现了抗菌效果的增强和机械强度的提升[37]。另一项研究表明，将ZnO NPs与环丙沙星结合后，对S. aureus的抑制区扩大了27%，对大肠杆菌扩大了22%[38]。此外，当ZnO NPs与利拉鲁肽（liraglutide）结合时，观察到协同抗菌和促进血管形成的作用，加速了感染伤口的愈合。动物模型进一步显示，含有这种组合的膜增强了闭合能力并限制了疤痕形成[39]。另一项研究表明，将nisin与传统抗真菌剂结合显著减少了所需的有效药物剂量，从而减少了口腔感染中产生耐药性念珠菌的风险[40]。体外实验数据显示，将nisin与多粘菌素B（Polymyxin B）结合可对鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）、醋酸钙不动杆菌（Acinetobacter calcoaceticus）和洛夫菲不动杆菌（Acinetobacter lwoffii）产生协同抑制效应。联合治疗鲍曼不动杆菌时，发现较低的多粘菌素B浓度即可实现协同效应，有助于减少其剂量依赖的毒性和相关副作用[41]。重要的是，与肽结合可能通过改变DNA完整性或诱变潜力来影响细菌基因组，为作用机制和长期生物安全性提供了见解[42]。本研究调查了ZnO和CuO NPs与抗菌肽nisin联合对S. aureus的协同抗菌效果和基因组影响。抗菌效果在25、50、100和150μg/mL的浓度下进行了评估，暴露时间为2、4、6、8和24小时。此外，使用随机扩增多态性DNA聚合酶链反应（RAPD-PCR）分析了治疗引起的基因组变化。RAPD-PCR是一种成本效益高且多用途的分子指纹技术，不需要预先的序列信息，非常适用于检测序列变异、突变和治疗相关的DNA改变。其应用使其特别适合研究纳米颗粒与病原体的相互作用[43][44]。通过将分子分析与表型抗菌测定相结合，这项工作提供了纳米颗粒-nisin结合物的抗菌效果和基因组影响的综合评估。本研究围绕三个主要目标进行：(i) 研究nisin、ZnO NPs、CuO NPs、ZnO-nisin和CuO-nisin的抗菌特性，包括ZnO-nisin与CuO-nisin相对效力的比较分析；(ii) 评估ZnO-nisin和CuO-nisin对S. aureus的潜在协同抑制作用；(iii) 使用RAPD-PCR分析评估这些处理引起的基因组修饰。本研究的结果预计将有助于设计出具有强疗效且毒性最小的下一代抗菌策略，从而应对多重耐药细菌感染的紧迫挑战。

材料与方法
以下部分介绍了使用的化学物质和试剂、设备、细菌菌株和培养条件、纳米颗粒和抗菌肽的制备方法，以及用于评估抗菌活性的处理程序。此外，还概述了基因组DNA的提取、RAPD-PCR扩增协议和随后的凝胶电泳分析方法。最后，描述了数据处理和解释的方法以确保结果的重复性。

结果
本章展示了从抗菌和分子分析中获得的实验结果。首先评估了nisin、ZnO NPs、CuO NPs及其结合形式（ZnO-nisin和CuO-nisin）的抗菌活性。然后展示了不同处理后S. aureus的RAPD-PCR产物的电泳谱型和相应的条带模式。最后，部分总结了电泳结果的数据分析。

讨论
病原菌中抗菌耐药性的加速传播是一个严重的全球健康问题[45]。为了解决这一问题，纳米技术为设计先进的抗菌系统提供了创新机会。其中，金属纳米颗粒如CuO和ZnO NPs在生物医学应用中受到了广泛关注。当与抗菌肽或传统抗生素结合时，它们的有效性进一步增强。

结论
本研究表明，ZnO-nisin和CuO-nisin显著增强了对抗S. aureus的抗菌效果。与单独使用纳米颗粒或nisin相比，ZnO-nisin和CuO-nisin系统表现出更强且更持久的细菌生长抑制作用，证实了细菌素与金属氧化物纳米结构之间的协同作用。除了改进的抗菌性能外，RAPD-PCR分析表明这些结合物...

作者贡献声明
帕里萨·霍塞尼：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、验证、软件、资源、方法学、调查、正式分析、数据管理、概念化。
西敏·拉希迪：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原稿、可视化、软件、资源、方法学、正式分析、数据管理、概念化。
巴赫拉姆·戈莱斯塔尼·埃玛尼：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源、项目管理、方法学。

利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。

致谢
作者感谢伊朗乌尔米亚伊斯兰自由大学生物学系提供的实验设施，以支持这项研究。