综述：关于野生动物中钩端螺旋体（Leptospira spp.）感染的系统评价和荟萃分析：从“同一健康”（One Health）视角的贡献

《One Health》：A systematic review and meta-analysis of Leptospira spp. infection in wildlife: Contributions to a One Health perspective

　　斯蒂芬妮·伯格曼·埃斯特维斯（Stephanie Bergmann Esteves）|安娜·卡罗莱纳·蒙特罗·米兰达·格罗拉（Ana Carolina Monteiro Miranda Grolla）|阿德里亚娜·科尔特斯（Adriana Cortez）|朱莉安娜·德·保拉·尼亚纳雷利（Juliana de Paula Nhanharelli）|伊芙琳·莫拉·德·利马（Evelyn Moura de Lima）|费利佩·福尔纳扎里（Felipe Fornazari）|路易斯·古斯塔沃·梅洛·达·席尔瓦（Luiz Gustavo Melo da Silva）|玛丽安娜·维多利亚·拉莫斯·杜·阿马拉尔（Mariana Vitória Ramos do Amaral）|布鲁诺·阿隆索·米奥托（Bruno Alonso Miotto）
圣阿马罗大学（Universidade Santo Amaro，UNISA），圣保罗，巴西

**摘要**
钩端螺旋体病是一种全球分布的动物源性疾病，由多种哺乳动物作为宿主传播。然而，从定量角度来看，野生动物对病原体传播的贡献仍被低估。这项在PROSPERO注册的系统评价和荟萃分析旨在估计不同野生动物类群的感染率，并记录通过直接检测细菌在这些宿主体内发现的钩端螺旋体物种、血清群或血清型。通过对PubMed、Scopus、Web of Science以及其他四个数据库的系统性搜索，我们找到了2002年至2022年间发表的关于在野生动物中直接检测到钩端螺旋体的研究。符合条件的研究包括使用分子生物学、培养或免疫组化方法在生物样本中检测病原体的观察性研究。数据通过荟萃分析模型进行提取和整合，以估计不同类群的感染率和尿液中的病原体排出情况；描述性分析总结了感染物种和血清群的多样性。为了避免来自共生啮齿动物的偏倚，所有涉及Rattus rattus、Rattus norvegicus和Mus musculus的研究都被排除在分析之外。共有263项研究符合纳入标准，涉及648种野生动物的54,389个个体。感染的整体 prevalence 为14.5%，肾脏中的病原体排出率为16.6%，不同类群之间存在显著差异。啮齿动物和蝙蝠是最常被采样的宿主，它们表现出最广泛的钩端螺旋体物种和血清群多样性。分离数据表明，L. interrogans、L. kirschneri和L. borgpetersenii是最常检测到的物种，而血清群Icterohaemorrhagiae、Australis和Pomona在分离株中占主导地位。尽管证据有限，但来自非哺乳动物类群的研究表明，在特定生态背景下，爬行动物和两栖动物也可能参与病原体的传播。这些发现强调了整合野生动物监测和改进病原体特征描述的重要性，以便更好地理解“同一健康”框架下的钩端螺旋体病生态学。我们提倡改进钩端螺旋体的分离协议，扩大能够进行血清型预测的分子工具的应用，并结合开放的数据共享平台来增强全球合作。

**1. 引言**
钩端螺旋体病是一种由致病性钩端螺旋体引起的动物源性疾病，这种细菌在全球范围内分布广泛，可以感染多种哺乳动物宿主，包括人类、家养动物、共生物种和野生动物[1]。钩端螺旋体物种根据其遗传特征进行分类，共有74个基因组物种[2][3]。致病性钩端螺旋体还因其外膜脂多糖的结构多样性而有所不同，形成了超过300种已知的血清型，这些血清型被分为24个抗原相关的血清群[4]。
在大多数宿主物种中，物种间的传播主要通过间接途径发生，即皮肤或黏膜接触受污染的水或泥土，这突显了环境因素在感染动态中的关键作用[1]。尽管最近有证据表明致病性钩端螺旋体可能在环境中复制[5]，但它们在自然界的长期存在主要依赖于维持宿主的感染——这些宿主无症状地将细菌携带在肾小管中并通过尿液将其排出[6]。偶尔，感染可能会发展成急性疾病，导致严重的甚至致命的结果，影响肾脏、肝脏、肺部和凝血系统，尤其是当感染宿主被认为是偶然宿主时，意味着感染的血清型不适应在宿主肾脏中的长期存活[6][7]。然而，轻度和无症状的感染形式更为常见，受感染的动物可能长期作为病原体的储存库。尽管不是绝对的，但文献中广泛记录了宿主与血清型之间的适应性[8]。牛和羊是Sejroe血清群的常见宿主[9]；狗被认为是Canicola血清群的维持宿主[10]；马主要与Bratislava血清群相关[11]；猪通常携带Pomona血清群[12]；而共生啮齿动物是Icterohaemorrhagiae血清群的已知储存库[13]。
虽然家养动物和共生动物作为储存库的作用已经相对明确，但宿主与血清型之间的关联以及野生动物物种在传播周期中的参与程度仍不清楚。这一知识空白不仅源于历史上对野生动物在钩端螺旋体病流行病学研究中的忽视，还因为人们倾向于将野生动物视为一个单一的、同质的群体。实际上，野生动物包含了一个极其多样化的类群，具有广泛的地理分布，这使得普遍化结论变得困难。迄今为止，只有少数血清型被认为由一种或少数几种野生动物维持，而其他血清型（如Grippotyphosa和Pomona）似乎适应了更广泛的动物宿主[14]。
然而，近年来，由于钩端螺旋病对动物健康、公共卫生和生物多样性保护的影响，野生动物中的钩端螺旋病受到了越来越多的关注。总体而言，致病性钩端螺旋体以感染多种哺乳动物而闻名，能够在具有不同环境特征的地区存活[4][15]。钩端螺旋体感染已在许多非传统宿主体内被描述，包括变温动物（如爬行动物和两栖动物[8]）以及严格的海洋哺乳动物（如鲸鱼和海豚[16]）。这些因素使钩端螺旋体成为一种普遍存在的病原体，具有广泛的储存库和复杂的流行病学情景，这些情景因地理区域而异。
由于间接传播占主导地位，野生动物与人类之间的联系主要受它们共存和共享环境景观的影响[17]。这些界面经常因土地利用的突然变化和森林砍伐而加剧，为跨物种传播创造了机会，并为许多病原体（包括钩端螺旋体）的出现、持续存在和进化提供了新的生态位[18]。特别是考虑到超过70%的新发动物源性疾病起源于野生动物[19]，以及人类与野生动物互动的加剧在过去几十年显著增加了病原体溢出到人类群体的风险[17][19][20]，因此加强科学努力以阐明野生动物在钩端螺旋体传播中的作用应被视为研究的优先事项并得到持续鼓励。
大多数研究采用血清学方法来检测野生动物中的钩端螺旋体感染，尤其是显微镜凝集试验（MAT）。这些研究通常报告高比例的血清反应动物，至少表明环境污染普遍存在。由于MAT仅针对特定血清群，且假阳性反应频繁，血清学数据通常无法准确反映从野生动物群体中实际分离出的钩端螺旋体菌株[15][21]。这种不兼容性突显了使用MAT全面评估高度复杂环境中的钩端螺旋体流行病学的局限性，尤其是在易感宿主之间有强烈相互作用的情况下。通常需要通过分离后进行分子和血清学分型才能在血清型或血清群水平上进行鉴定[6]。然而，由于钩端螺旋体生长要求苛刻且培养过程中经常受到其他微生物的污染，培养钩端螺旋体仍然是一个重大挑战。成功的分离通常依赖于使用新鲜的临床样本，这在野外条件下进一步复杂化了这一过程，尤其是在针对野生动物的主动监测工作中。在这种情况下，分子方法可能提供重要优势，不仅用于诊断（通常通过多种单基因扩增方法进行评估[1]），还用于菌株特征描述。基于DNA的分型方法，如脉冲场凝胶电泳（PFGE）、多位点序列分型（MLST）、多位点可变数目串联重复分析（MLVA）和全基因组测序（WGS），在某些情况下即使没有细菌分离株也能提供血清型或血清群水平的分辨率[22]。
在这种背景下，结合分子和微生物数据的系统评价在整合分散且方法异质的数据、识别宿主-病原体关联的空白以及指导未来的研究工作和监测策略方面发挥着关键作用。更清楚地了解哪些钩端螺旋体菌株在野生动物中传播——以及在哪些宿主物种中传播——可以改善动物源性疾病传播的风险评估，支持“同一健康”倡议，并为基于证据的公共卫生规划和保护政策提供依据[23]。
20世纪60年代和70年代的早期努力试图系统化钩端螺旋体菌株的鉴定和受感染哺乳动物宿主的地理分布[24][25]。此后，相关文献大幅增加，强调了定期进行综合数据综述的必要性。Fratini等人[26]和Cilia等人[8]提供了关于野生动物中钩端螺旋病的全面概述，强调了多种动物宿主在传播周期中的参与。同样，Vieira等人[27]和Guernier等人[28]也做出了重要贡献；然而，这些研究要么具有地理局限性，要么不是作为系统评价设计的。其他综述则专注于特定的分类群，如蝙蝠[29][30][31][32]、非人类灵长类[33]、海洋哺乳动物[16]和啮齿动物[13]，从而留下了考虑所有野生动物类群的全面评估的空白。
最近，Browne等人[34]和Hagedoorn等人[14]进行的两次系统评价研究了动物宿主体内钩端螺旋体血清群和血清型的鉴定和分布。尽管这些工作代表了重要进展，但由于其范围较广（包括家养和共生动物），可能对野生动物特异性数据的关注不足。此外，由于未纳入基于DNA的方法进行钩端螺旋体检测和分型的研究（尤其是那些未能分离出细菌的研究），因此限制了相关研究的纳入。
鉴于这些潜在的空白，仍需要系统地、以野生动物为中心整合现有文献，包括多种适当的钩端螺旋体鉴定方法。为此，本研究进行了专门针对野生动物中钩端螺旋体的系统评价和荟萃分析，旨在估计不同野生动物类群的感染阳性率，并记录通过直接细菌检测方法在这些宿主体内发现的钩端螺旋体物种、血清群或血清型。我们希望这项工作有助于巩固现有证据，识别关键的知识空白，并为未来针对野生动物钩端螺旋体储存库的研究和监测策略提供指导。

**2. 方法**
本系统评价遵循2022年系统评价和荟萃分析的优先报告项目指南（PRISMA），并在国际前瞻性系统评价注册平台（PROSPERO - 协议CRD42021259993）上进行了额外验证和注册。

**2.1. 入选标准**
选择标准是全文文章（观察性研究或病例报告），描述在野生动物或自由活动的动物中直接检测到钩端螺旋体物种的情况。详细的入选标准（包括被视为野生动物的物种描述）见补充表1。仅关注家养动物、人类和共生动物的研究被排除在外。在筛选阶段，保留了同时评估多个物种的研究，但在分析过程中采取了适当的预防措施以确保排除这些物种的数据。因此，Rattus rattus、Rattus norvegicus和Mus musculus被从所有分析中移除。
直接检测方法包括细菌培养、PCR、其他分子技术和光学显微镜检查。符合条件的研究必须发表于2002年1月至2022年4月之间，并以英语、西班牙语或葡萄牙语撰写，无论来源国家如何。仅基于间接检测方法（主要是MAT）或涉及体内实验感染的研究被排除。仅报告阴性分子检测结果的研究也被排除，以避免对阳性率估计产生偏倚。未发表的研究、会议摘要、学位论文、文献综述、系统评价和实验研究以及缺乏定量结果描述或无法通过数字数据库获取的研究也被排除。

**2.2. 信息来源和搜索策略**
文献搜索在七个电子数据库中进行，包括PubMed、SciELO、Embase、Web of Science、BVS（虚拟健康图书馆）、Scopus和LILACS。搜索词包括：(leptosp* OR “l. biflexa” OR “l. interrogans” OR “l. borgpetersenii” OR “l. kirschneri” OR “l. licerasiae” OR “l. santarosai” OR “l. weilii”) AND (wild OR wildlife OR nondomestic OR reserve OR fauna OR zoo OR mammal? OR carnivore? OR bird? OR reptile? OR amphibian? OR cetacean? OR colonial bird? OR seabird? OR primate? OR marsupial? OR chelonian?) AND (isolated OR isolation OR isolates OR culture OR molecular OR DNA OR urinalysis OR detection OR PCR OR sequenc* OR characterization OR identification)。根据所使用的每个数据库，对搜索策略进行了轻微调整（见补充表2）。初步搜索于2022年4月1日进行，所有检索到的条目都被导出到参考管理软件中，以便后续的筛选和选择。此外，还采用了滚雪球策略，通过检查所有纳入研究的参考文献列表来识别数据库搜索中未捕获的潜在相关文章。2025年5月5日进行了额外的滚雪球搜索，包括了关于野生动物中钩端螺旋体感染的最重要综述[8]、[12]、[13]、[14]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]。2.3. 选择和数据提取过程检索后，使用Mendeley参考管理软件删除了重复条目。所有识别出的文章的标题和摘要都被筛选并分类为“排除”或“潜在合格”。被分类为“潜在合格”的研究被完整检索出来，并由两位独立审稿人（AG和EM）根据预定义的资格标准进行评估。通过与第三位审稿人（SBE）的讨论解决了任何分歧。对于滚雪球搜索，一位作者（BAM）检查了纳入文章的参考文献列表，另一位作者（SBE）根据预定义的资格标准验证了资格。数据提取由两位审稿人（AG和EM）在事先培训后使用标准化电子表格独立完成。数据提取中的分歧由三位资深作者（BAM、AC和SBE）进行了审查和解决。2.4. 数据项从研究中提取的数据被组织到三个单独的工作表中：I. 一般研究级别数据：在研究级别收集的信息包括：第一作者、发表年份、国家、大陆、采样期间、评估的动物物种数量、总样本量、动物环境（自由放养、圈养或两者都有）、是否报告了样本量计算、采样方法以及进行的诊断测试类型。测试以二进制格式（是/否）记录在以下类别中：细菌培养和分离、分子检测、免疫组化（IHC）、血清群或物种鉴定以及肾脏排泄测试。II. 物种级别数据：对于研究中评估的每个动物物种，提取了以下信息：纲、科和物种名称；测试的个体总数以及每种直接检测方法呈阳性的数量；收集的样本类型（例如，肾脏、血液、肝脏）；鉴定的钩端螺旋体物种；以及测试结果之间是否存在任何差异（例如，在一种测试中呈阳性但在另一种测试中呈阴性）。III. 分离株级别数据：对于每个钩端螺旋体分离株，我们记录了以下信息：宿主动物信息（物种、纲、科和样本来源）、分离株鉴定（ID）、是否进行了分子特征分析、目标基因以及使用的方法（例如，VNTR、MLVA、MLST、RAPD、PFGE或WGS）。如果进行了血清学鉴定，我们记录了使用的技术（例如，多克隆或单克隆抗体、MAT或CAAT），以及鉴定的钩端螺旋体物种、血清群和血清型。2.5. 偏倚风险评估使用Joanna Briggs Institute（JBI）观察性研究关键评估清单的改编版本对每个纳入研究的偏倚风险进行了评估，该清单基于JBI证据综合手册[38]。对于每篇文章，计算了被评为“是”、“否”或“不清楚”的项目的百分比，以提供与审查问题相关的整体定性评估。每个文章的七个领域根据预定义的标准被评为“是”、“否”或“不清楚”。第一个领域评估了纳入标准是否明确定义。如果作者提供了关于动物选择的明确信息，例如临床状况（例如，有症状的、无症状的、已接种疫苗的）、地理来源和纳入理由，则认为研究是充分的。在第二个领域，我们评估了研究主题和环境是否描述得足够详细。这包括对动物种群的清晰描述，包括样本物种的描述和鉴定、采样地点和采集期间。缺乏物种特定信息或提供未区分的汇总数据的研究被认为是不清楚的。第三个领域检查了暴露测量的有效性和可靠性。对于基于培养的方法，我们评估了研究是否报告了样本采集和接种之间的时间，以及储存条件。对于基于PCR的检测，特别关注了尿液样本的处理，因为长时间冷冻可能会影响DNA的完整性。第四个领域调查了是否使用了标准化和客观的标准来测量条件。对于基于培养的研究，如果仅依赖视觉指标（例如，浑浊度、环形成、暗场显微镜）而没有分子或血清学确认分离株，则认为风险较高。对于分子测试，我们验证了是否对所有样本和物种应用了一致的协议。第五和第六个领域涉及潜在混杂因素的鉴定和处理。我们考虑了作者是否使用了先前验证的PCR引物或开发并验证了新的引物，以及是否讨论了这些变量的调整或控制。最后，第七个领域评估了结果的有效性和可靠性。那些在培养和PCR中报告了一致结果的研究，或者通过测序或其他方法确认了PCR阳性的研究被评为正面。仅使用PCR而没有测序的研究被认为有较高的偏倚风险。通过查看漏斗图探索了研究之间的潜在偏倚风险，如发表偏倚或小样本效应。在适当的情况下，进一步使用Egger回归测试评估了不对称性。2.6. 数据综合和统计分析进行了批判性的定性分析，以检查纳入研究的主要特征、方法学方面和局限性。使用描述性统计来总结提取的数据。对于分类变量，结果以绝对频率和相对频率表示，并使用Clopper–Pearson精确方法计算95%置信区间（CI）。对于连续变量，分析包括中心趋势和离散度的度量，如平均值、标准差、中位数、四分位数范围（IQR）和范围。当有足够且可比的数据时，使用逆方差方法[39]通过元分析模型估计了钩端螺旋体属直接检测的汇总阳性率。比例主要使用原始比例模型（PRAW）进行汇总。当数据集包含大量零事件时，在汇总之前应用了对数转换（PLOGIT）来稳定方差。汇总的估计结果使用森林图呈现，并使用I2统计量[40]评估了研究之间的异质性。进行了亚组分析，以根据地理区域（大陆）、分类学纲、科和使用的诊断测试类型（例如，培养、PCR、IHC）探索潜在的异质性来源。当识别出显著异质性（I2 > 50%）时，应用随机效应模型；否则，使用固定效应模型。汇总的阳性率报告了95%的CI。所有分析都在R统计环境（R版本4.4.2）中使用“meta”包（版本8.0–1）进行元分析[40]。用于分析的R代码可以根据要求提供。3. 结果3.1. 研究选择系统搜索共产生了6581条条目，这些条目来自以下数据库：PubMed（n = 3205）、Web of Science（n = 1281）、Scopus（n = 765）、EMBASE（n = 715）、LILACS（n = 589）和SciELO（n = 26）。去除2493个重复条目后，剩余4088篇文章用于标题和摘要筛选。其中，3269篇文章和499篇文章分别基于标题和摘要筛选被排除，最终有320篇文章被选中进行全文审查。有4篇文章无法以数字形式获取，其余316篇全文文章被评估了资格。在全文评估后，75篇文章因以下原因被排除：研究设计不足（n = 19）、研究人群不合适（n = 43）或结果报告不符合纳入标准（n = 13）。通过引用搜索（滚雪球策略）又发现了1180篇文章。总共263项研究符合资格标准并被纳入本综述，其中241项研究是通过数据库和注册表搜索发现的，22项是通过引用搜索发现的。图1显示了选择过程的总结，包括在全文阅读阶段导致文章被排除的原因。下载：下载高分辨率图像（539KB）下载：下载全尺寸图像图1. PRISMA流程图，显示了符合本系统综述的研究选择。3.2. 研究特征鉴于从选定研究中提取的信息量很大，数据以原始形式呈现以便于客观咨询（见补充表3）。完整的参考文献列表也可以在补充表4中找到。在纳入的263篇文章中，231篇（87.8%）适合对野生动物中的感染频率进行总体分析，57篇（21.7%）提供了从野生动物中恢复的分离株数据。美洲是研究数量最多的大陆，共有123篇文章（46.8%），其中27.8%来自南美洲，17.1%来自北美洲，1.9%来自中美洲（图2）。欧洲有60篇文章（22.8%），其次是亚洲36篇（13.7%），非洲34篇（12.9%），大洋洲10篇（3.8%）。研究数量最多的国家是巴西（42篇；16.0%）、美国（32篇；12.2%）和意大利（11篇；4.18%）。可以在补充表3中找到所有国家及其详细特征。关于研究人群，大多数文章关注野生捕获的动物（227篇；87.3%），而18篇（6.9%）涉及圈养人群，15篇（5.8%）同时包括两种类型的动物。在关于圈养动物的研究中，50%在动物园进行，50%在其他类型的管理环境中进行。在263篇文章中，只有3篇（1.1%）报告了样本量计算，只有一篇文章采用了概率抽样方法。每项研究中包含的动物数量从1到3950不等，平均为256只动物（SD ± 536）。此外，每项研究中分析的物种数量从1到69不等，平均为5个物种（SD ± 7）。下载：下载高分辨率图像（404KB）下载：下载全尺寸图像图2. 本系统综述中包含的研究的全球分布。3.3. 研究中的偏倚风险对所有纳入的研究进行了偏倚风险评估。在第一个领域，只有10.3%的研究被评为“是”，而6.5%被评为“否”，大多数（83.3%）被归类为“不清楚”，通常是由于对用于选择研究人群的特征描述不足。在第二个领域，69.6%的研究被评为“是”，18.3%被评为“不清楚”，12.2%被评为“否”。大多数未能满足这一标准的研究缺乏物种级别数据或没有按动物来源或采样地点区分结果。在第三个领域，69.4%的研究被评为正面，表明样本处理程序的报告充分，特别是对于分子和基于培养的方法。然而，20.5%被归类为“不清楚”，10.1%被评为“否”，主要是由于缺乏方法学细节，例如从尿液中提取DNA或样本保存用于培养。第四个领域表现最好，93.1%的研究被评为“是”，5.0%被评为“不清楚”，只有1.5%被评为“否”。第五和第六个领域共同评估了潜在混杂因素的鉴定和处理。这些领域有83.3%的研究被评为“是”，12.2%被评为“否”，4.6%被评为“不清楚”。最后，第七个领域显示出略微更多的变异性。虽然66.2%的研究被评为“是”，但20.9%被归类为“否”，12.9%被评为“不清楚”。那些仅依赖PCR而没有测序或支持性确认方法的研究在这个领域更有可能存在较高的偏倚风险。在单独分析研究时，大多数研究的偏倚风险为中等到低，每个文章的领域平均评分为65.3%。完整的研究级别评估见补充表4。3.4. 钩端螺旋体的直接检测在263篇进行钩端螺旋体属直接检测的研究中，数据按宿主物种进行了分类，共得到1083份报告和54,389个个体。总共在648个野生动物物种中评估了钩端螺旋体的存在，这些物种分布在7个分类学纲、30个目和92个科中。哺乳动物占据了报告数量的绝大多数（1030份；95.1%；53,529个个体），其次是爬行动物（32份报告；2.9%；541个个体）、两栖动物（14份报告；1.3%；267个个体）、鸟类（2份报告；0.2%；44个个体）以及原口动物（2份关于腹足类的报告，0.2%，2个个体；1份关于昆虫的报告，0.1%，2个个体；以及1份关于软甲类的报告，0.1%，1个个体）。采样频率最高的三个动物目分别是啮齿目（410份个体报告；37.9%；31,685个个体）、翼手目（234份报告；21.6%；5415个个体）和食肉目（130份报告；12.0%；6563个个体）。其他哺乳动物目也有出现，尽管比例较低，例如真盲缺目（如刺猬、鼹鼠和鼩鼱——54份报告；5.0%；2081个个体）、负鼠目（如负鼠）48份报告；4.4%；539个个体）、非洲猬科（如金鼹和十齿鼠）35份报告；3.2%；630个个体）、偶蹄目（如羚羊、瞪羚、猪科动物和鹿）34份报告；3.1%；4927个个体）以及灵长目（31份报告；2.9%；640个个体）。相比之下，非哺乳动物目的出现频率较低，包括有鳞目（如蛇、蝰蛇——19份报告；1.8%；219个个体）、龟鳖目（如龟——11份报告；1.0%；254个个体）、无尾目（如青蛙和蟾蜍——7份报告；0.7%；189个个体）以及尾索动物（如蝾螈——7份报告；0.7%；78个个体），还有鸟类（鸻形目如海鸥——n=43个个体；以及鸡形目如鹧鸪——n=1个个体）和无脊椎动物（鞘翅目如甲虫n=2个，十足目如虾n=1个，以及舌形目如蜗牛n=2个）。在208篇文章中进行了分子检测（79.1%），共计924份报告（85.3%；95%置信区间：83.1–87.4%）。样本类型包括血液（89份报告；检测了1913个个体，其中174个呈阳性）、尿液（85份报告；检测了2604个个体，其中365个呈阳性）、肾脏（662份报告；检测了34,968个个体，其中4135个呈阳性）以及其他样本类型（164份报告；检测了3932个个体，其中676个呈阳性），这些样本类型还包括脓肿、牛奶、粪便、肝脏、脾脏、子宫液、淋巴结、肺、胎盘、胎儿组织、神经系统和生殖器官（表1）。

表1. 根据样本类型对钩端螺旋体的分子检测和物种鉴定。

| 样本类型 | 报告数量 | 检测个体数 | 总阳性数 | 阳性百分比（95%置信区间） | 鉴定物种（n） |
|---------|---------|---------|--------------|-----------------|
| 血液 | 89 | 1913 | 174 | 9.10% (7.84–10.48%) | L. interrogans (50) |
| 尿液 | 85 | 2604 | 365 | 14.02% (12.68–15.45%) | L. interrogans (51), L. borgpetersenii (38), L. santarosai (9), L. kirschneri (6) |
| 肾脏 | 662 | 34,968 | 4135 | 11.83% (11.48–12.19%) | L. interrogans (635), L. kirschneri (627), L. borgpetersenii (220), L. noguchii (24), L. weilii (22), L. kmetyi (20), L. mayottensis (10), L. fainei (9), L. biflexa (6), L. santarosai (8), L. meyeri (3) |
| 其他 | 164 | 3932 | 676 | 17.19% (15.97–18.47%) | L. interrogans (57), L. borgpetersenii (48), L. kirschneri (20), L. mayottensis (8), L. fainei (6), L. wolffii (2) |

在342份报告中进行了钩端螺旋体的培养和分离（104篇文章），占所有涉及野生动物的报告的31.6%（95%置信区间：28.8%–34.3%）。最常检测的组织是肾脏，共有266份报告，涉及11,501个动物，其中598个呈阳性结果。尿液样本在44份报告中被使用，涉及702个动物，其中58个呈阳性；血液样本在15份报告中被分析，涉及221个动物，其中16个呈阳性。其他类型的样本——包括脓肿、牛奶、肝脏、脾脏、子宫液、肺和混合器官池——在33份报告中被使用，涉及3000个动物，其中70个呈阳性。共有808株钩端螺旋体分离株被描述，并对其进行了某种程度的特征描述。其中大部分来自亚洲（51.1%），其次是欧洲（29.1%）、南美洲（8.4%）、北美洲（7.6%）和中美洲（0.3%）。这些分离株来自87种不同的野生动物，分布在四个脊椎动物纲、15个目和34个分类科中。哺乳动物占绝大多数，占99.5%（804株分离株），而两栖动物、鸟类和爬行动物各自只贡献了一到两个分离株（≤0.25%）。在808株分离株中，只有732株有可用于培养和分离的样本类型数据。在这些样本中，泌尿道是主要来源，占特征化分离株的96.9%（710/732；95%置信区间：94.8%–97.6%）。较少比例的分离株来自血液（2.2%；95%置信区间：1.1%–3.3%）和生殖器官（0.82%；95%置信区间：0.17%–1.47%）。

免疫组化（IHC）检测在22篇文章中被描述（8.4%），涉及32份报告，这些报告使用了肾脏样本，共检测了955个动物，其中195个呈阳性（20.4%）。其余四份报告评估了肝脏样本，检测了21个动物，其中3个呈阳性（14.3%）。通过多种元分析模型进一步探讨了钩端螺旋体检测的频率，包括根据不同的分类学分类（纲、目、科）、检测类型和样本类型进行亚组分析（补充表5）。共有228项研究提供了适合纳入的动物物种级别的数据，共计1252条个体记录。所有脊椎动物宿主中钩端螺旋体感染的总体合并患病率为14.5%（95%置信区间：13.2–15.7%），研究间的异质性很高（I2 = 87.3%，τ2 = 0.0322，p < 0.001）。所使用的诊断方法也影响了合并患病率的估计。通过分子技术检测的动物显示出16.3%的合并患病率（95%置信区间：14.8–17.7%），研究间的异质性很高（I2 = 88.4%）。培养和分离显示的合并患病率明显较低（5.7%；95%置信区间：4.4–7.0%），而免疫组化（IHC）则与较高的总体患病率相关（34.3%；95%置信区间：20.5–48.0%）。方法间的异质性始终很高，表明其他变量可能会影响合并患病率的差异。

仅考虑进行分子检测的群体（数据量最大，n = 41,497个个体），哺乳动物目内的异质性尤为明显（图3A）。负鼠目的合并患病率最高（32.8%；95%置信区间：23.5–42.0%），其次是其他样本量较大的动物目，如食肉目为19.6%（95%置信区间：14.8–24.4%）、啮齿目为17.7%（95%置信区间：15.3–20.2%）、真盲缺目为16.8%（95%置信区间：10.4–20.9%）和翼手目为14.9%（95%置信区间：11.8–18.0%）。尽管样本量较小，鲸目（20.1%；95%置信区间：6.4–33.8%）也值得注意。另一方面，偶蹄目（9.3%；95%置信区间：4.4–14.1%）和兔形目（如兔子——0.7%；95%置信区间：0.0–1.7%）的患病率明显较低。

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图3. 按分类单元划分的钩端螺旋体分子检测合并患病率（A）和按分类单元划分的培养合并患病率（B）。

家族级别的估计显示了显著的变异性（补充表5）。仓鼠科（如仓鼠、田鼠和麝鼠——n=12,587）的患病率为23.9%（95%置信区间：18.9–28.8%），鼠科（如野生小鼠、大鼠和沙鼠——n=7334）为15.6%（95%置信区间：11.8–19.3%），负鼠科（n=383）为32.8%（95%置信区间：23.5–42.0%）。一些蝙蝠科显示出中等患病率，包括叶口蝠科（10.3%）和狐蝠科（10.3%），而蝙蝠科达到了23.9%。一些食肉动物科，如鼬科（16.2%）和犬科（17.1%），也显示出较高的感染率。相比之下，牛科（n=72）、鹿科（n=1226）和淡水龟科（n=109）尽管样本量较大，但没有报告阳性病例。

考虑到方法学因素，样本类型对合并患病率有显著影响。直接在肾脏组织或尿液样本上进行检测的合并患病率为16.5%（95%置信区间：14.9–18.2%），而基于血液的检测较低（7.2%；95%置信区间：3.4–11.0%）。组织样本的阳性率为11.7%，而使用多种或未指定组织的研究显示出更高的患病率（20.2%；95%置信区间：15.3–25.0%）。当仅限于进行基于培养分离的研究时，脊椎动物的总体患病率明显低于分子方法得到的结果，合并估计为5.2%（图3B）。然而，不同分类群的结果差异很大，某些科的阳性率高于预期。在纲级别，哺乳动物在数据集中占主导地位（n=14,837），患病率为5.2%（95%置信区间：4.0–6.4%）。啮齿动物是主要样本来源，患病率为5.2%（95%置信区间：4.0–6.4%）。啮齿动物是主要采样对象（n=10,415），但患病率仅为2.8%（95%置信区间：1.8–4.4%），仓鼠科和鼠科的合并患病率非常低（分别为2.0%和4.4%）。同样，蝙蝠尽管数量较多（n=645），但分离率几乎为零（0.05%；95%置信区间：0.0–23.2%）。相比之下，一些小科显示出高检测率，如豚鼠科（如水豚、豚鼠和豚鼠——33.6%；95%置信区间：4.0–63.2%）、兔科（如野兔——36.2%；95%置信区间：0.0–81.6%）和牛科（83.0%；95%置信区间：67.5–98.6%）。此外，马达加斯加啮齿动物科（Nesomyidae）（46.6%）、鼹鼠科（Bathyergidae）（50.0%）和十齿鼠科（Tenrecidae）（41.9%）也显示出高合并患病率，鲸科（Delphinidae）等鲸类家族也与陆地哺乳动物相比显示出显著的患病率。

为了评估不同动物分类单元中尿液排泄的潜在作用及其对环境污染的影响，图4基于肾脏排泄的分子鉴定进行了合并患病率分析。在232项研究中评估了肾脏排泄的证据（88.9%）。所有脊椎动物宿主中钩端螺旋体感染的总体合并患病率为13.8%，哺乳动物目内的异质性与之前观察到的相似（图3A）。袋鼬目（塔斯马尼亚恶魔）和灵长目的肾脏排泄患病率最高（分别为50%和46.7%），尽管样本量显著减少且置信区间较宽。负鼠目的阳性率为33.7%，但其样本量远小于啮齿目、翼手目、真盲缺目和食肉目，后者的阳性率与图3A中呈现的总体感染率一致。

图4. 仅基于尿液和肾脏样本的钩端螺旋体检测的合并患病率，按分类单元分组。

3.5. 通过直接应用于生物样本的分子方法在590份报告中实现了物种级别的鉴定（63.8% - 表1），其余报告仅将分子工具用于诊断目的。用于确定钩端螺旋体物种的主要方法是测序PCR产物（519份报告），其次是VNTR（43份）、MLST（26份）和MLVA（3份）。在808个样本中的731个（90.5%；95%置信区间：88.5%–92.5%）进行了分离株的分子特征描述，并在730个样本中实现了物种级别的鉴定，揭示了宿主间的广泛分类多样性（补充表6）。最常用的技术是常规PCR后进行测序（73.5%），其次是MLST（59.6%）、多位点可变数串联重复分析（MLVA，16.6%）、脉冲场凝胶电泳（PFGE，13.3%）、可变数串联重复（VNTR，1.9%）和全基因组测序（WGS，1.4%）。共有519株分离株被归类为L. interrogans，主要在哺乳动物中发现（n=517），也在两个两栖动物（蛙科Ranidae）中发现。在哺乳动物中，L. interrogans分布在七个目和23个科中，其中啮齿目中的分布最广（n=396；主要是鼠科Muridae=365），其次是食肉目（60；包括鼬科Mustelidae=16和浣熊科Procyonidae=15）、灵长目（22；主要是卷尾猴科Cebidae=20）和真盲缺目（16；猬科Erinaceidae=14）。其他目，如偶蹄目、鲸目、翼手目、带甲目（如犰狳）、兔形目（Scandentia）（如树鼩）也有分布，但数量较少。

L. borgpetersenii在129种哺乳动物中被鉴定出来，跨越五个目。大多数分离株来自啮齿目（85；主要是鼠科Muridae=78），其次是食肉目（28；尤其是鼬科Mustelidae=25）、真盲缺目（10）和负鼠目（5），以及偶蹄目中的一个分离株（猪科Suidae）。L. kirschneri（n=62）也仅限于哺乳动物，出现在四个目中。大多数分离株来自啮齿目（50；主要是鼠科Muridae=48），其次是食肉目（9；主要是浣熊科Procyonidae=8）和偶蹄目中的个别案例（猪科Suidae=2）和翼手目（狐蝠科Molossidae=1）。其他物种的分布更为有限：L. mayottensis（n=11）仅出现在非洲猬科（Tenrecidae）中，L. santarosai（n=5）出现在啮齿目（豚鼠科Caviidae）中，L. alstonii（n=3）出现在真盲缺目（Soricidae）中。此外，一个分离株被鉴定为L. interrogans或L. johnsonii（鼬科Mustelidae），另一个为L. weilii（鼠科Muridae）。

图5展示了基于分离株和生物样本直接分析的钩端螺旋体物种的分子方法鉴定结果，按宿主分类单元组织。

从考虑不同动物分类单元而非钩端螺旋体物种的角度来看，图5中的综合分析（分离加上分子数据）显示翼手目感染的钩端螺旋体种类最广泛，共鉴定出八种基因型。这些记录大多通过生物样本的分子检测获得。该分析还显示，啮齿目与通过分离单独鉴定出的钩端螺旋体物种相比，还关联了其他物种。尽管如此，L. interrogans、L. kirschneri和L. borgpetersenii在啮齿目中最为常见。这些钩端螺旋体物种在食肉目、偶蹄目、真盲缺目和灵长目中也占主导地位，尽管食肉目和偶蹄目的感染物种多样性更广。值得注意的是，非洲猬科主要感染了L. mayottensis。剩余的动物目主要被L. interrogans感染。在血清群鉴定方面，753个分离株（77.0%；95% CI：74.2–79.9%）接受了血清学特征分析，主要通过多克隆抗血清进行MAT（n = 596），而44个分离株使用了单克隆抗体（见补充表6）。最常见的血清群是Icterohaemorrhagiae（n = 305），在广泛的宿主中都有发现。它主要存在于啮齿目（n = 268；尤其是鼠科 = 244），但也存在于灵长目（22；主要是卷尾猴科 = 20）、食肉目（10）以及其他几个哺乳动物目中。有趣的是，有一个分离株来自鸟类（雉科）。第二常见的血清群是Australis（n = 145），几乎完全局限于哺乳动物（n = 144），尤其是在啮齿目（103；鼠科 = 84），但也存在于食肉目（16）、真盲缺目（15）和偶蹄目（10）中。有一个分离株来自两栖动物（蛙科）。Pomona（n = 86）在多种哺乳动物目中被发现，尤其是在啮齿目（54；鼠科 = 52），但也存在于偶蹄目（13）和食肉目（15），此外还有少数分离株来自鲸目和带甲目。Javanica（n = 71）主要局限于啮齿目（66；鼠科 = 65），在真盲缺目中有少量存在。较少见但值得注意的血清群包括Sejroe（n = 38），主要存在于啮齿目（12）和食肉目（25；獴科）；Grippotyphosa（n = 32），广泛分布于啮齿目（25）、偶蹄目（3）和食肉目（2），甚至在爬行动物（蟒科）中也有发现；Autumnalis（n = 30），几乎完全存在于啮齿目（29；鼠科）；以及Hebdomadis（n = 15），在啮齿目（5）、食肉目（6）和偶蹄目（3）中有记录。图6包括了584个分离株（占总分离株753的77.6%），这些分离株是从尿液样本中获得的，并同时进行了钩端螺旋体物种的分子鉴定和血清学方法的血清群鉴定，从而进一步了解了宿主-血清群特异性关系。下载：下载高分辨率图像（664KB）下载：下载全尺寸图像图6. Sankey图显示了基于尿液分离株数量的钩端螺旋体血清群、钩端螺旋体物种和宿主科之间的关系。每个流向的宽度与连接每个类别的分离株数量成正比。为了提高可视化效果，数据根据每个血清群的总分离株数量被分为两个面板。（A）具有≥20个分离株的血清群。（B）具有<20个分离株的血清群。大多数分离株被归类为L. interrogans，特别是在Icterohaemorrhagiae、Australis、Autumnalis和Pomona血清群中。Icterohaemorrhagiae在啮齿目中占主导地位，尤其是在鼠科（n = 244），也在食肉目（犬科、獴科、鼬科）和其他啮齿科中有所发现。Australis和Autumnalis也主要与啮齿目中的L. interrogans相关（尤其是鼠科），同时也在真盲缺目、食肉目和偶蹄目中发现。Javanica血清群主要与啮齿目中的L. borgpetersenii相关（鼠科，n = 64）。Pomona在食肉目、啮齿目和偶蹄目中表现出更广泛的宿主范围，并与L. interrogans和L. kirschneri相关。Sejroe仅与食肉目（獴科）和啮齿目（鼠科）中的L. borgpetersenii相关。较少见的血清群（n < 20）在钩端螺旋体物种和宿主分类单元中的分布更为分散，主要存在于啮齿目，但也存在于真盲缺目、食肉目和偶蹄目中。当根据宿主分类单元而不是钩端螺旋体物种或血清群来考虑数据时，发现啮齿目释放的钩端螺旋体种类最多（12个血清群），其次是食肉目（7个血清群）、真盲缺目（5个血清群）和偶蹄目（4个血清群）。另一方面，食肉目中的少数科似乎只与一个或少数几个血清型相关。Herpestidae似乎与Sejroe相关，Mephitidae与Grippotyphosa相关，Otariidae和Phocidae与Pomona相关。3.6. 研究中的偏倚风险通过观察漏斗图（补充图1）探讨了潜在的小样本效应和发表偏倚。为总体汇总分析和主要亚组分析生成了漏斗图，包括基于培养的检测、分子检测（图3）以及根据样本类型的培养检测（图4）。研究在漏斗图中的分布显示了效应估计值与其标准误差之间的变异性。视觉检查可能表明研究分布存在某种程度的不对称性，特别是在总体分析和基于培养的检测分析中，标准误差较大的研究之间的估计值分布更广。相比之下，分子检测分析显示研究分布更集中于汇总估计值周围。Egger回归测试表明总体汇总分析存在显著的统计不对称性（t = 20.00，p < 0.001）。4. 讨论这是第一篇经过PROSPERO注册和验证的系统评价，提供了关于野生动物中钩端螺旋体病的全面和综合概述，涵盖了所选时间范围内文献中调查的大量脊椎动物分类单元。纳入了不仅进行分离，还进行其他形式直接检测钩端螺旋体的研究，从而能够对感染和尿液排泄钩端螺旋体的动物频率进行新的估计。元分析显示，全球14.5%的野生动物主动感染了钩端螺旋体。这一阳性率与全球评估中报告的15%的脊椎动物宿主钩端螺旋体感染率相当[35]，尽管该研究采用了明显不同的方法学方法，该方法包括使用MAT测试来估计感染率。还估计了尿液排泄的比例，总体频率为16.6%，这与家养物种（如狗[41]和猫[42] [43]）以及全球范围内的山羊[44]、猪[45]和非人类灵长类[33]的血清流行率相当。然而，鉴于钩端螺旋体感染的动态性质，这些估计值很可能低估了实际流行率，因为感染率在时间和空间上都有很大差异。此外，大多数用于病原体检测的诊断方法可能缺乏足够的敏感性来一致地识别受感染的宿主。这些限制主要是由于钩端螺旋体在宿主组织、血液和尿液中的分布和细菌载量波动所致，这些都受到感染阶段、宿主免疫力、感染剂量和血清型-宿主适应性的强烈影响[46]。这些方法学限制甚至在亚组分析中也得到了体现，结果显示基于混合样本或通过IHC分析的组织样本的直接检测方法比仅基于尿液或肾脏样本的分子检测方法显示出更高的流行率，这突显了应使用多种诊断方法和多种生物样本来研究野生动物中的钩端螺旋体感染。因此，使用混合组织样本可能会增加未来研究中从用于培养的材料中检测到细菌的可能性，无论采样时的感染阶段如何。尽管某些特定分类单元的样本量有限，但结果显示了不同分类单元中钩端螺旋体流行率的广泛范围，哺乳动物和非哺乳动物代表之间的差异很大。负鼠科在感染和肾脏排泄方面的阳性率显著较高，这突显了其作为钩端螺旋体携带者的重要性。这一目主要由负鼠属的标本代表，这些负鼠具有很高的生态灵活性。它们极其广泛的饮食和在多个生物群落中的广泛分布使负鼠成为美洲城市地区最常遇到的共生动物[47]。这些特征可能与高钩端螺旋体感染率有关，因为这种生态适应性使负鼠能够探索多种类型的环境，从而增加了接触钩端螺旋体的机会。此外，由于负鼠与老鼠在城市环境中占据相同的生态位（例如，在人类住所筑巢和在家庭垃圾中觅食[48]，共生负鼠种群可能表现出更高的钩端螺旋体感染率。实际上，所有描述负鼠感染的研究都是在人类-野生动物交界处进行的。大多数样本量足够的哺乳动物目显示出10%到20%之间的感染或肾脏排泄率，表明这些目中的哺乳动物物种可能在钩端螺旋体传播中起重要作用。然而，兔形目和非洲鼩鼱目显示出较低的感染率，表明这些目中的物种在局部传播循环中可能起的作用相对较小。这些低流行率的原因尚不确定，但可能与研究数量有关的偏倚可能影响了结果：尽管测试的动物数量很多，但超过96%的兔形目标本来自法国的单一项研究[49]，而非洲鼩鼱目的个体仅限于少数岛屿环境（留尼汪岛、马达加斯加和马约特）。我们的结果还表明，在四个爬行动物和两栖动物目中也有显著的流行率。这些分类单元包括具有非常不同的生物学和生态特征的动物，如龟类、蛇类、蜥蜴和青蛙。考虑到这种多样性，一些非哺乳动物物种可能参与钩端螺旋体的流行病学——主要是那些由于半水生习性而经常接触水的物种。然而，由于从这些分类单元中分离钩端螺旋体的情况很少被描述，它们对钩端螺旋体流行病学的贡献仍然知之甚少。关于其他非哺乳动物，现有文献非常有限。应谨慎解释所有分类单元的流行率数据，因为感染或尿液排泄的流行率估计可能不足以完全反映不同宿主物种在维持和传播钩端螺旋体方面的生态重要性[50]。更全面的评估还需要考虑种群规模和结构、地理分布和行为生态学，这些因素可以显著影响暴露风险和病原体传播的可能性。在这种情况下，鉴于啮齿动物的广泛分布、丰富数量和高繁殖率[13]，它们可能在自然环境中维持钩端螺旋体传播链方面发挥特别重要的作用。啮齿目拥有近2600个公认的物种，是物种丰富度最大的哺乳动物目，占所有现存哺乳动物多样性的约40%[51]。因此，在啮齿目中发现的16.8%感染率表明野生啮齿动物可能在钩端螺旋体流行病学中起关键作用。这一估计甚至高于Boey等人[13]之前报告的11.2%，他们发现全球有11.2%的野生啮齿动物（包括R. exulans、R. argentiventer、R. tanezumi和R. losea）感染了钩端螺旋体。有趣的是，估计的Cricetidae（第二大啮齿动物科，包含数百种全球分布的物种）的流行率为24.6%，与R. rattus和R. norvegicus（被认为是城市环境中高度暴露于钩端螺旋体的共生啮齿动物物种）的全球流行率24.6%相当[13]。除了啮齿动物，研究还发现Nycteridae、Molossidae和Phyllostomidae科的蝙蝠也表现出一些最高的流行率。这一发现特别重要，因为蝙蝠占所有现存哺乳动物物种的约25%，全球有近1400种[52]。它们能够飞行，结合多样的进食策略和独特的生理和生态适应性，使它们能够殖民多种栖息地——以及它们作为多种人畜共患病病原体储存库的公认作用[31]——强调了它们在自然环境中传播和维持钩端螺旋体方面的潜在重要性。总的来说，来自多个元分析模型的证据揭示了野生动物参与钩端螺旋体传播的复杂性，但仍不足以确定不同物种作为维持宿主或偶然宿主的程度。尽管显示易感动物的范围很广，但它们作为不同钩端螺旋体菌株的维持宿主或偶然宿主的地位仍需在大多数情况下确定。关于病原体多样性和潜在的血清型特异性关联，我们的发现表明全球各种野生动物宿主体内循环着多种钩端螺旋体物种。尽管使用不同的搜索方法、选择标准和研究时期，早期研究也报告了类似的多样性。例如，Hagedoorn等人[14]提供了地理宿主分布和钩端螺旋体多样性的详细概述，但他们的综述仅包括那些报告了血清型水平鉴定的研究，从而排除了仅基于血清分组或除PFGE以外的分子技术的研究。这些决策在方法论上是合理的，符合其研究目标，但可能无意中限制了某些地区包含有关野生动物宿主的相关数据，尤其是在那些资源有限、无法使用复杂且昂贵的技术（如单克隆抗体或CAAT）来鉴定钩端螺旋体血清型的地方。同样，其他一些重要的研究（例如Fratini等人发表的综述[26]）也没有采用系统的方法，而是包含了血清学调查，这使得与我们的结果进行直接比较变得更加困难。尽管如此，它们的工作为我们的发现提供了重要的理论基础，并且也是我们在“滚雪球”程序中参考的宝贵来源，该程序还包括了其他相关的综述研究。值得注意的是，只有104篇文章报告了分离和进一步鉴定结果，占所有研究数量的40%，这限制了我们对受感染动物中钩端螺旋体种类的识别。然而，结果表明野生啮齿动物携带了最多样化的钩端螺旋体，共检测到14个血清群。Icterohaemorrhagiae是最主要的从啮齿动物中分离出的血清群，这与其血清型长期适应与人类共生的啮齿动物的特性相符。有趣的是，Javanica和Autumnalis几乎只从啮齿动物中分离出来，这可能揭示了宿主与病原体之间的特异性。同样，Herpestidae和Otariidae分别与Sejroe和Pomona血清群相关。然而，分离出的菌株数量很少，且主要来自少数地理范围有限的研究。来自Suidae的样本也显示出与Pomona的关联，这与传统上对猪类的描述一致[53]。解释血清群/血清型的特异性需要谨慎，因为不能仅凭观察性研究得出可靠的结论。尿液中的病原体排出可能是暂时的，并不一定表明宿主处于持续感染状态。为了减少这种误解，未来的研究应结合机制学检测的证据，正如其他地方所强调的[50]。此外，由于当前的分析使用了科和目作为分类单位，未来采用更细粒度（物种水平）的研究可能会提供更清晰的见解。原始数据（补充表3）的可用性可能有助于未来更详细地研究这些进化关系。鉴于先前的证据表明某些血清型具有宿主特异性（例如在海狮中的Pomona[54]和在浣熊中的Grippotyphosa[55],[56]），这种方法尤为重要。

对分离株和生物样本的分子鉴定显示，L. interrogans在野生动物中占主导地位，但L. kirschneri和L. borgpetersenii在大多数动物目中也起着重要作用。然而，分离株与直接分子检测之间的丰富度存在显著差异，这可能反映了成功培养的难度，从而影响了正确的鉴定。此外，所使用的培养方法可能更倾向于只恢复特定的病原体或血清型，而忽略其他菌株[57],[58]。在本研究中，当分子分析与血清群鉴定结合使用时，Chiroptera和Rodentia都被发现是能够排出多种钩端螺旋体谱系的潜在宿主。对于Chiroptera来说，对生物样本进行分子鉴定特别有价值，尤其是考虑到从蝙蝠中获得的分离株非常少。目前尚不清楚这些发现是否反映了蝙蝠作为更广泛钩端螺旋体宿主的固有适应性，还是仅仅因为这些类群中的物种暴露更多，导致短暂的肾脏定植。无论如何，这种多样性强调了蝙蝠和啮齿动物在传播钩端螺旋体到环境中的巨大潜力。不过，这些结果必须谨慎解读。啮齿动物和蝙蝠合计占全球哺乳动物种类的约60%[59]，我们在这两个目中发现的钩端螺旋体多样性可能反映了它们在全球哺乳动物中的高比例。在这方面，来自啮齿动物和蝙蝠的样本数量超过了其他目的样本。不同动物类群在钩端螺旋体病（以及其他病原体）流行病学中的比较研究较少。蝙蝠和啮齿动物是否确实比其他类群更有效地携带多种病原体，或者它们的病原体多样性仅仅是由于它们物种丰富度更高，仍然是一个争论的话题。比较这两个目时，蝙蝠每个物种可以携带的动物源性病毒数量通常比啮齿动物更多[60]。尽管如此，蝙蝠和啮齿动物的高物种多样性，加上它们共有的特征——包括广泛的地理分布、显著的生态适应性（能够占领新的生态位[29],[32],[61]，以及某些物种发展出与人类共生的行为——从“同一健康”（One Health）的角度来看，对钩端螺旋体病的流行病学有着深远的影响。在人类改造的景观中，啮齿动物和蝙蝠可能构成特别大的威胁，因为一些物种的共生行为促进了跨物种传播。一些野生啮齿动物特别适应受干扰的环境，经常在城市和城郊地区被发现，包括Peromyscus[62]、Oligoryzomys[63]、Calomys[64]、Mastomys和Arvicanthis[65]等物种。同样，一些蝙蝠类群也出现在类似的环境中，包括一些高度适应城市环境的属，如Molossus、Eumops、Myotis和Rhinolophus[66],[67]。随着土地利用的变化和森林砍伐的加剧，加上全球变暖对传染病动态的影响[68]，预计人类与野生动物之间的相互作用将会增强，因此可以合理推测，在未来几十年内，由野生动物（尤其是Rodentia和Chiroptera）介导的钩端螺旋体传播频率可能会增加[69],[70]，正如其他动物源性病原体所记录的那样[71],[72]。考虑到陆地野生哺乳动物的总生物量估计约为2000万吨[73]，其中23%由Rodentia和Chiroptera组成，尽管这一生物量仍远小于家养哺乳动物的生物量（后者大约是前者的十倍[73],[74]，但野生动物作为潜在环境污染源的流行病学重要性不容忽视。家养动物通常在更受控制的管理条件下饲养，这可能减少了病原体跨物种传播的机会。相比之下，野生动物种群分布在各种自然和城郊环境中，因此可能促进钩端螺旋体在环境中的传播。当考虑到宿主宿主可能连续通过尿液排出钩端螺旋体（中位数排出量每天为10^5到10^8个细胞[75]）时，这一观点变得更加重要，这可能对环境中的病原体压力产生重大影响[76]。此外，由于人类与野生动物的接触点往往集中在不规则和不受控制的地区，社会和经济上边缘化的人群可能面临更高的风险[77]。非法交易、食用野味以及野生动物衍生药品的贸易可能会进一步加剧这些社区中的病原体传播[78],[79]。总之，我们的发现强调了整合公共卫生、环境管理和野生动物保护的紧迫性。在这个框架下，对野生动物、家养动物、与人类共生的物种以及人类中循环的病原体进行被动和有针对性的监测成为“同一健康”范式的核心组成部分。同时，开发新的方法来改进钩端螺旋体的分离技术仍然是推进我们对钩端螺旋体生态学理解的关键。同时，能够直接从遗传数据推断血清型分类的分子和生物信息学方法（特别是针对rbf簇基因组区域的方法，这些区域显然与钩端螺旋体血清型鉴定有很强的相关性[22]）代表了有前景的替代方案，可以大大扩展监测范围并无需培养即可预测血清型。同样重要的是，应鼓励研究人员在公共数据库（如Hagedoorn等人建立的平台[14]）中公开分享他们的分离结果和基因组数据集，以促进数据整合和全球范围内的合作。

本研究存在几个局限性。首先，文献搜索仅限于近期出版物，因此无法与旧数据进行比较。这一决定是为了捕捉最新的钩端螺旋体病流行病学概况，并包括采用更先进诊断和分型技术的研究，因为钩端螺旋体的分类学和分类不断改进。此外，没有进行时空分析，这限制了我们检测随时间变化的流行病学模式的能力。仅依赖MAT（马氏试验）的研究也被排除在外。这一方法学决定基于该技术的固有限制，作为一种间接血清学测试，可能会偏倚急性感染频率的估计。此外，MAT结果与钩端螺旋体的肾脏排出量相关性较差，与感染菌株的关联较弱，这一点在文献中有广泛记录[6]。一些报告从野生动物中分离出钩端螺旋体的研究未被纳入感染菌株的分析中。排除这些研究的原因是缺乏关于样本来源宿主物种的足够信息、用于菌株鉴定的方法，或两者兼有。在某些情况下，数据以汇总形式报告，无法确定宿主特异性特征。尽管确定了在动物园、康复中心、管理条件下或救援设施中进行的研究，但没有进行亚组分析来评估圈养对阳性率或检测到的宿主物种和血清群多样性的影响。这一遗漏被视为一个局限性，因为这些环境中的人工条件可能会引起行为和饮食改变，增加压力水平和感染易感性，并促进与人类共生的动物之间的交叉传播[37],[80]。这些管理条件可能包括在农场系统中饲养的野生动物，这些动物在某些地区属于半管理种群而非传统家养动物。这些因素可能导致流行病学模式与自由生活种群的不同。然而，只有18项研究专门针对圈养或管理动物进行。除了这些局限性外，风险评估还揭示了所包含研究中的几个局限性，通常源于用于定义研究种群的标准描述不足。需要注意的是，许多这些局限性反映了本综述的目的，而不是原始野生动物感染研究的缺陷。常见问题包括缺乏物种级别的报告，以及未能根据动物来源或采样地点区分结果。此外，一些研究仅依赖PCR而不进行测序来确定感染状态，从而无法验证潜在的假阳性结果。另一个局限性是许多研究仅以汇总形式报告数据，阻碍了更详细的评估。此外，分析中观察到的漏斗图不对称性应谨慎解读。在涉及多种野生动物宿主、诊断方法和采样策略的流行病学荟萃分析中，这种不对称性可能反映了潜在的生物学和方法学异质性，而不仅仅是真正的出版偏倚。未来针对野生动物中的钩端螺旋体的研究应提供原始数据作为补充材料，以便研究人员和读者能够重新分析并提高透明度。

5. 结论

我们的发现表明，野生动物在自然生态系统中维持和传播钩端螺旋体方面起着关键作用。通过综合二十年来全球野生动物中直接检测到钩端螺旋体的研究，这项系统综述和荟萃分析提供了该病原体全球生态范围的综合证据。随着人类驱动的环境变化继续重塑景观并加剧人类与野生动物之间的接触，钩端螺旋体溢出的风险可能会增加。我们希望我们的发现能够强化基于“同一健康”方法的综合监测框架的必要性，认识到钩端螺旋体的动态源于野生动物、家养动物、人类及其共享环境之间的复杂相互作用。因此，推进对钩端螺旋体的理解和控制将依赖于跨学科的努力，结合生态学、兽医学和公共卫生的视角。在这方面，改进钩端螺旋体的分离技术并扩大创新分子方法的应用将有助于更好地阐明野生动物在该疾病流行病学中的作用。

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Stephanie Bergmann Esteves：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、软件开发、项目管理、方法论、研究、形式分析、数据管理、概念化。

Ana Carolina Monteiro Miranda Grolla：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据管理。

Adriana Cortez：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据管理。

Juliana de Paula Nhanharelli：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿。

Evelyn Moura de Lima：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据管理。

Felipe Fornazari：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿。

Luiz Gustavo Melo da Silva：撰写——审阅与编辑、形式分析、数据管理。

Mariana Vitória Ramos do Amaral：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿。

Bruno Alonso Miotto：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、数据可视化、项目监督、方法论、形式分析、数据管理、概念化。