益生菌的植入作用以及益生菌滴耳液对外耳炎的犬类病原体的抑制作用

《Veterinary Dermatology》：Probiotic Engraftment and Suppression of Canine Otitis Externa Pathogens by Probiotic Ear Drops

　　**摘要**

**背景**
乳杆菌科（Lactobacillaceae）在竞争性上显示出潜力，能够抑制病原体并恢复外耳炎（Otitis Externa, OE）中的健康微生物平衡。

**假设与目的**
本研究旨在评估乳杆菌科细菌在体内的存活情况，以及其在体外抑制常见外耳炎病原体生长的能力。

**实验动物**
共招募了15只健康的狗，随机分为五组（每组3只），使用含有活的Lactiplantibacillus plantarum YUN-V2.0和Lacticaseibacillus rhamnosus YUN-S1的益生菌耳滴剂进行治疗。

**材料与方法**
在单次应用后分别于24小时、48小时、72小时、96小时及7天采集耳部拭子进行培养。为了检测病原体的抑制效果，将临床分离的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、伪中间葡萄球菌（Staphylococcus pseudintermedius）和厚皮马拉色菌（Malassezia pachydermatis）与益生菌耳滴剂以及以下抗菌药物进行对比测试：氟苯尼考（florfenicol）30 μg、庆大霉素（gentamicin）30 μg、马波福洛沙星（marbofloxacin）5 μg、咪康唑（miconazole）10 μg、新霉素（neomycin）120 μg和特比萘芬（terbinafine）1.5 μg。

**结果**
检测到共生微生物和乳杆菌科细菌的丰度较低（约为1.34 × 103 CFU/mL）。应用24小时后，乳杆菌科细菌数量显著增加（2.3 × 10? CFU/mL；p < 0.001），并在应用1周后仍维持在10? CFU/mL以上。与庆大霉素和马波福洛沙星相比，乳杆菌科细菌对铜绿假单胞菌的生长抑制效果更佳；与庆大霉素和新霉素相比，其对伪中间葡萄球菌的抑制效果更明显；对于厚皮马拉色菌，其抑制效果与咪康唑和特比萘芬相当。

**结论与临床意义**
这些结果表明，益生菌株具有优异的体内留存能力，并能有效抑制伪中间葡萄球菌、铜绿假单胞菌和厚皮马拉色菌的生长。

**1. 引言**
犬类耳部疾病的微生物病因已得到充分记录，其中伪中间葡萄球菌和厚皮马拉色菌是最常见的致病菌[1]。相比之下，健康犬类的耳部微生物群落具有多样性且组成平衡，天然含有丰富的共生菌类（如乳杆菌科细菌）[2]。这类细菌对动物、人类和环境都是安全的（欧洲食品安全局EFSA认证），可能在维持耳部微生态平衡中发挥作用。最近的微生物组研究表明，微生物多样性是健康状态的特征，而多样性降低及机会性病原体的优势则与菌群失衡有关[2]。在涉及犬类耳部感染的病原体研究中，78.3%的受影响样本存在微生物过度生长，其中69.8%为细菌过度生长，16.3%为真菌过度生长，7.0%同时存在细菌和真菌过度生长[2]。犬耳皮肤细菌群落的改变与外耳炎相关，其中葡萄球菌属（Staphylococcus spp.）、假单胞菌属（Pseudomonas spp.）和变形菌属（Proteus spp.）占比较高[1, 3-5]。外耳炎（OE）是犬科兽医实践中的常见病症，可能由诱发因素、原发因素、继发因素或持续因素引发[6]。已知过敏性皮炎与微生物菌群失衡有关， merupakan最常见的OE病因，占病例的75%以上[7, 8]。文献中报道的主要病原体包括多种细菌，其中伪中间葡萄球菌在培养培养基上的检出率超过70%，厚皮马拉色菌在30%–60%的OE患者中占主导地位[1, 8]。研究表明，厚皮马拉色菌、伪中间葡萄球菌和铜绿假单胞菌形成的生物膜会影响其致病性，并降低治疗效果[9-11]。随着下一代DNA测序（NGS）技术的进步，研究人员对与OE相关的微生物变化有了更深入的了解。有趣的是，即使在没有明显临床症状的OE患犬中，其耳部微生物群也与健康犬有所不同，表现为α多样性降低及细菌组成的持续变化，尤其是葡萄球菌属和厚壁菌门（Firmicutes）的增加[4]。这些发现表明，微生物群的变化可能在症状缓解后仍持续存在，可能是导致OE复发率较高的原因之一。此外，OE常常与抗生素的过度使用相关，这会促进抗菌耐药性的发展[12]。因此，亟需探索能够维持耳部微生物群平衡的替代疗法。在这方面，益生菌（尤其是乳杆菌科）显示出巨大潜力，它们能够抑制有害病原体并恢复健康微生物平衡[13]。对健康犬外耳道微生物组的研究显示，乳杆菌科是其中最常见的菌属[14]。虽然乳酸（Lactic acid）曾被广泛用于耳滴剂，但目前受REACH法规限制，因此被硼酸和Tris-EDTA等替代品取代[15]。含有活的乳杆菌科菌株的局部耳部制剂已被证明可以减少病原体，并有助于预防儿童的外耳炎[16]。乳杆菌科细菌是皮肤的自然栖息者，可产生多种小分子化合物以维持其生存环境[17]。活的乳杆菌科细菌能够附着在皮肤和黏液上，其上皮黏附性有助于延长其在皮肤上的停留时间，从而使细菌代谢物与宿主细胞和共生菌相互作用[18-20]。乳杆菌科细菌具有免疫调节作用，可通过细菌代谢物和细胞壁相关或分泌的微生物相关分子模式（MAMPs）减轻皮肤炎症[19]。此外，它们还能增强皮肤屏障功能，而这在感染或炎症期间常常受到破坏[13]。proAuris（Ecuphar/Animalcare Group）是一种用于外耳的局部卫生益生菌耳滴剂，每毫升含有约10? CFU的Lactiplantibacillus plantarum YUN-V2.0和Lacticaseibacillus rhamnosus YUN-S1，以及辛酸/癸酸甘油三酯和二氧化硅。这种成分组合旨在帮助恢复健康的耳部微生物群，适用于因抗菌治疗导致耳部敏感或微生物群失衡的犬只。本研究旨在验证这两种乳杆菌菌株在单次应用后在外耳皮肤上的定植和持久性，并进一步评估该益生菌产品相对于传统抗菌药物在抑制犬外耳炎典型病原体方面的效果。

**2. 材料与方法**

**2.1 伦理**
本体内定植研究遵循良好的临床实践和当地关于动物用于临床研究的法规进行。在研究开始前，动物主人签署了书面知情同意书。

**2.2 定植研究**
该实验旨在评估益生菌耳滴剂单次应用后乳杆菌科细菌在犬耳内的存活情况及定植情况。

**2.3 研究对象**
来自比利时Lokeren的Het Zilveren mandje收容所的15只健康犬（无论品种、体重或性别），均无耳部疾病或皮肤问题史。入选犬只年龄须超过6个月，且在入组时无任何与OE相关的症状或耳部分泌物。入组前30天内不得使用全身或局部抗生素或抗真菌药物，研究期间也不允许使用耳部清洁剂。犬只被随机分为五组（每组3只），对应不同的采样时间点：应用后24小时、48小时、72小时、96小时和168小时。该设计有助于评估益生菌在外耳道内的存活情况（见表1）。第0天，所有犬只的两个外耳道均接受一次益生菌产品滴注。由同一兽医进行采样以减少采样偏差。研究期间，负责动物护理的人员通过临床观察记录产品的安全性，并记录任何不良事件（AEs）。

**2.4 样本采集与处理**
耳部拭子（ESwab；Copan）的采集方法如下：轻轻擦拭外耳道皮肤10秒后，立即将其放入采集和运输系统试管（Copan Liquid Amies Elution Swab 2 mL）中，并储存在4°C环境。采样后48小时内，将拭子运送至比利时YUN NV进行微生物分析。复苏缓冲液使用生理盐水（0.85%）。随后将拭子从采集管转移至含有复苏缓冲液的15 mL Falcon试管中，并使用Mini Vortex Mixer（Labbox）以3000 rpm的速度涡旋15秒。在生理盐水（0.85%）中制备10倍系列稀释液。从10^-1至10^-4的适当稀释液中取100 μL样本，分别涂布在Man Rogosa Sharpe（MRS；Biokar）琼脂（标准9 cm培养皿）上用于评估乳杆菌科细菌的存活情况，以及CASO（Biokar）琼脂上用于评估共生菌群。MRS和CASO琼脂平板在35°C下孵育48–72小时以观察菌落形成。所有平板在菌落清晰可见且数量在20–200个范围内时进行计数。

**2.5 病原体抑制研究**
使用Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight（MALDI-TOF）质谱法（MS）鉴定了来自患有OE的犬耳的铜绿假单胞菌、伪中间葡萄球菌和厚皮马拉色菌的临床分离株，并测试其对抗菌药物的敏感性。proAuris耳滴剂中含有L. plantarum YUN-V2.0和L. rhamnosus YUN-S1，同时使用氟苯尼考（florfenicol）30–240 μg、庆大霉素（gentamicin）30 μg、马波福洛沙星（marbofloxacin）5 μg、咪康唑（miconazole）10 μg、新霉素（neomycin）120 μg和特比萘芬（terbinafine）1.5 μg进行测试。黄色微球菌（Micrococcus luteus）肉汤培养液或无菌生理盐水作为阴性对照。

**2.6 统计分析**
所有统计分析均使用Sigma Plot（v16 2024；Grafity）软件进行。通过单因素方差分析（one-way ANOVA）对益生菌应用前后的乳杆菌科细菌计数变化进行评估，数据分析前对数据进行对数转换以满足正态性和方差假设要求。事后多重比较使用Holm–Sidak方法进行，将每个时间点与基线值（益生菌应用前）进行比较。数据以平均cfu/mL ± 标准差（SD）的形式呈现。对于病原体抑制作用，使用了Welch的双尾t检验，数据以抑制圈（mm）± SD的形式呈现。p值小于0.05被视为具有统计学意义。

3 结果

3.1 定植研究

在D0日应用益生菌产品之前，15只健康狗的外耳道中检测到的共生可培养微生物的数量相对较低，计算得出的平均值为：CASO（共生细菌）为1.34 × 10^3 cfu/mL，MRS（乳酸菌）为960 cfu/mL。在将益生菌耳滴剂滴入两只狗的外耳道24小时后，观察到乳杆菌科细菌的数量增加（2.3 × 10^6 cfu/mL），并在应用后3天（72小时）内保持在10^6 cfu/mL以上。4天后（96小时），乳杆菌科细菌的数量逐渐减少到6.4 × 10^5 cfu/mL，1周后减少到1.6 × 10^5 cfu/mL。在所有时间点，乳杆菌科细菌的数量显著高于基线水平（p < 0.001）（图1）。需要注意的是，cfu/mL值提供了细菌数量的估计，但并不直接对应于绝对细菌计数，因为这些计数是基于转移到1毫升液体中的拭子，经过涡旋处理后稀释用于平板培养，这增加了变异性。应用益生菌后，整个研究期间共生微生物群的丰度保持在10^2–10^3 cfu/mL的水平。所有乳杆菌科细菌以及共生耳微生物组的计数均包含在支持信息S1的表S1中。在整个研究过程中，没有观察到任何受治疗的狗出现不良事件。

3.2 病原体抑制研究

含有活性乳杆菌的耳滴剂在抑制铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）方面表现出显著的效果，其效果优于庆大霉素（p = 0.0223）和马波氟沙星（p = 0.0147），而铜绿假单胞菌对所有测试浓度的氟芬尼考尔（florfenicol）都具有抗性。对于假中间葡萄球菌（S. pseudintermedius），益生菌耳滴剂的抑制效果显著优于新霉素（p = 0.0195）和马波氟沙星（p = 0.0017），并且与庆大霉素（p = 0.1813）和氟芬尼考尔（p = 0.5168）相当。针对厚壁马拉色菌（M. pachydermatis），益生菌耳滴剂的抑制效果与特比萘芬（terbinafine）相似（p = 0.7372），略高于咪康唑（miconazole）（p = 0.0654），尽管这些差异在统计学上并不显著。所有测试的抗菌剂以及益生菌耳滴剂的抑制圈（以毫米为单位，± SD）的准确值包含在表3中，并在图2中展示。

4 讨论

在这项研究中，proAuris益生菌耳滴剂中包含的两种益生菌菌株（L. plantarum YUN-V2.0和L. rhamnosus YUN-S1.0）显示出抑制犬耳来源病原体生长的内在能力，包括假中间葡萄球菌（S. pseudintermedius）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和厚壁马拉色菌（M. pachydermatis），其体外活性与本研究中用作阳性对照的抗菌剂相似。与抗生素的比较为体外疗效提供了参考，但仅凭这些结果不能直接推断出临床等效性。这种病原体的抑制作用可能归因于它们的多因素作用机制（MoA），包括对营养的竞争、抗菌肽的产生、乳酸和其他生物活性分子的生成以及环境pH值的改变，正如先前关于益生菌乳杆菌的研究所报道的[13]。需要强调的是，并非所有的乳杆菌科细菌都具有抗病原性；这些效应通常取决于具体的菌株。这突显了选择特征明确的益生菌菌株进行针对性应用的重要性。此外，配方中存在的辛酸/癸酸甘油三酯似乎不会干扰益生菌乳杆菌或病原体的生长。在本研究中，发现临床分离的铜绿假单胞菌对高达240 μg的氟芬尼考尔具有抗性，这并不完全令人惊讶，因为众所周知大多数铜绿假单胞菌菌株都对氟芬尼考尔具有抗性[23]。这一发现强调了在耳炎病例中准确鉴定微生物的重要性，因为经验性使用含氟芬尼考尔的耳药可能是无效的，并且在涉及杆状细菌如铜绿假单胞菌时可能会导致抗性。在患有外耳炎的狗中，微生物的α多样性较低，允许机会性病原体如葡萄球菌和假单胞菌占据优势，据报道其丰度增加了≤65% [4, 5, 24]。此外，在患有外耳炎的狗的外耳道中，酵母的出现率在30%到60%之间，具体取决于研究的群体[1, 24]。鉴于这些变化，并且已知测试的益生菌菌株对这些病原体具有抑制活性，我们的发现支持了益生菌乳杆菌可能有助于恢复更平衡的耳微生物组的假设。长期来看，这种效应可能有助于稳定微生物群落，从而减少病原体的过度生长，正如Leonard等人所建议的[14]。虽然这些发现很有前景，但观察到的抑制效应仅在体外得到验证；统计分析是为了支持这些观察结果而进行的。然而，主要目的是表征这些菌株的体外潜力，这些菌株是因其内在活性而被特别挑选的。因此，需要进行更多的患病动物参与、持续时间更长的体内研究来验证这些假设。除了疗效外，益生菌耳滴剂还提供一种安全的替代抗生素、抗真菌剂和杀菌剂的方案，它们不仅可以减少有害病原体，还能减少有益微生物，并可能降低抗菌剂的抗性[25]。这一问题由于据报道葡萄球菌属、假单胞菌属和厚壁马拉色菌对大多数常用抗菌剂表现出抗性而更加突出[24]。使用益生菌乳杆菌可能通过支持微生物平衡来提供互补策略，并可能减轻导致抗菌剂抗性的选择压力[26]。在健康狗的外耳道中，应用益生菌耳滴剂后，乳杆菌科细菌的丰度相对稳定。在应用单剂量的益生菌耳滴剂后，一周内恢复的活乳杆菌数量超过了建议的益生菌阈值10^5 cfu/mL，表明益生菌活性持续了几天。此外，健康狗的共生皮肤微生物数量相对较低，基线时约为10^2–10^3 cfu/mL，在应用局部益生菌产品后仍保持在这个范围内。鉴于微生物计数较低，观察到的轻微波动与正常的生物变异一致，并不具有统计学意义。作为研究的局限性，共生微生物是使用MRS和CASO培养基进行鉴定的，这限制了由于培养方法的限制而无法准确测定耳道中共生乳杆菌科细菌的比例。另一个局限性是在每个时间点对不同组的动物进行采样，而不是在相同的动物上进行采样，这限制了时间上的比较，并排除了对同一动物随时间变化的推断。然而，本研究的目标是评估益生菌乳杆菌在单次应用后在耳道中可检测到的时间长度，而不是纵向跟踪单个动物。此外，在抗病原体抑制试验中，每种病原体只测试了一个临床分离株，这可能无法完全捕捉到临床环境中遇到的病原体反应的多样性。然而，鉴于益生菌的多因素作用机制，包括对营养和空间的竞争以及在现场产生的乳酸和抗菌肽，预计其他临床分离株的抗性可能性低于通常使用抗生素的情况。这些发现表明益生菌具有有希望的定植和抗病原体活性，但进一步的研究可以更深入地了解重复应用后耳微生物组的长期动态。了解最佳剂量方案对微生物群落的影响将有助于进一步明确其在维持平衡耳微生物组中的作用。基于这些发现，乳杆菌科细菌在长达一周内的保留情况表明，可能不需要每天应用。相反，每隔一天应用一次剂量就足以重新平衡外耳道中的微生物群。此外，益生菌菌株的抗病原体活性突显了它们在管理微生物失调方面在促进健康耳微生物组方面的潜力[14]。总之，proAuris益生菌耳滴剂中的L. plantarum YUN-V2.0和L. rhamnosus YUN-S1.0在外耳道中表现出出色的保留能力。此外，益生菌耳滴剂在体外有效抑制了耳部病原体假中间葡萄球菌（S. pseudintermedius）、铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）和厚壁马拉色菌（M. pachydermatis）的生长。这些结果鼓励继续探索基于益生菌的疗法，作为预防和管理犬外耳炎的新方法和微生物组友好策略。

作者贡献

Hanne Gagroo：概念化、研究、写作——审稿和编辑。Shea Beasley：概念化、写作——初稿、方法论、监督。Alix Simons：概念化、研究、写作——审稿和编辑。Tim Henkens：概念化、方法论、写作——审稿和编辑。Ingmar Claes：概念化、方法论、监督、写作——审稿和编辑。Josep Homedes：写作——审稿和编辑、资金获取。Marta Salichs：概念化、方法论、项目管理、写作——初稿。

致谢

我们衷心感谢兽医外科医生A. Van de Voorde和I. de Smet的巨大贡献，以及Het Zilveren Mandje团队的热心帮助。作者感谢K. Van Loock在抗病原体试验中的帮助，以及H. Huygens的出色技术支持。

资助

Ecuphar Veterinaria SLU（Animalcare Group）。

利益冲突

Marta Salichs和Josep Homedes是Ecuphar Veterinaria SLU（Animalcare Group）的全职员工。Shea Beasley是Animalcare Group的顾问。Hanne Gagroo、Alix Simons、Tim Henkens和Ingmar Claes是YUN NV的全职员工。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可向相应作者合理请求获得。