热休克蛋白与抗氧化剂在过氧化物酶体生物发生过程中的相互作用有助于小麦耐热性的提高

《Scientific Reports》：Crosstalk of heat shock proteins and antioxidants with peroxisome biogenesis supports wheat thermotolerance

　　摘要：全球温度上升导致蛋白质毒性和氧化应激的增加，这限制了春小麦（Triticum aestivum）的产量。然而，蛋白质质量控制、氧化还原平衡以及过氧化物酶体动态在热耐受性过程中的协同调控机制仍不清楚。在这项研究中，我们探讨了热休克蛋白（HSPs）、抗氧化防御系统和过氧化物酶体生物发生在这两种不同耐热性的小麦基因型中的综合作用：Misr2（耐热）和Line4（敏感）。通过对热响应的表征，包括渗透保护物质的积累（总可溶性糖、脯氨酸）、氧化应激标志物（ maltodialdehyde、过氧化氢）、抗氧化酶活性（CAT、SOD、POX）、过氧化物酶体的数量以及应激反应基因的表达，区分了Misr2和Line4的热耐受性和敏感性反应。综合表型-基因关联分析揭示了这些基因型之间协调的调控模块。通过分析八个候选基因（TaHSP70、TaHSP90、TaSOD、TaCAT1、TaPEX11.3、TaPEX11.4、TaFIS1A和TaDRP5B）的表达谱，并结合表型特征，发现了连接抗氧化防御、HSP介导的蛋白质稳态和过氧化物酶体增殖的模块化基因网络。TaHSP70、TaPEX11.4和TaCAT1作为调控枢纽，TaDRP5B和TaSOD作为表型转换节点，而TaPEX11.3、TaFIS1A和TaHSP90则根据具体条件作出响应。这些发现揭示了支持小麦热耐受性的模块化通路之间的相互作用，为在气候变化下培育耐热品种提供了分子靶点。

引言：热应力是全球小麦（Triticum aestivum）产量面临的最严重非生物限制因素之一，而气候变化预计会通过增加热浪的频率、持续时间和强度加剧这一威胁。小麦产量对温度升高的敏感性尤为显著，平均季节温度每升高1°C，产量预计会下降约6%。在田间生长的小麦中，开花和灌浆期间暴露于高温会导致产量减少多达40%。在埃及等干旱和半干旱地区，由于基线温度高以及关键生殖阶段频繁出现热浪，热引起的产量损失进一步加剧，从而限制了国内小麦的产量。因此，尽管进行了持续的栽培努力，埃及目前仍需进口超过一半的小麦需求，这使得小麦成为关键的粮食安全作物（FAOSTAT数据）。因此，减少由热应力造成的产量损失是缩小生产与消费差距的关键前提。应对这一挑战需要识别和培育能在温度升高下保持产量的耐热小麦基因型。

在细胞水平上，热应力通过触发活性氧（ROS）的过量产生来破坏稳态，导致叶绿体等细胞器的氧化损伤。虽然在适度水平下ROS具有重要的信号传导功能，但其过度积累会导致脂质过氧化、叶绿素降解、类囊体膜损伤以及光合作用受损。植物通过激活一系列保护机制来缓解这些影响，包括积累渗透保护物质（如脯氨酸和可溶性糖）、表达热休克蛋白（HSPs）、调整碳分配和可溶性糖代谢、激活与应激相关的信号通路，以及增强抗氧化系统（如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POX）。值得注意的是，热诱导的抗氧化和生化响应在小麦的不同发育阶段（包括开花和灌浆期）存在差异。热休克蛋白（包括HSP70和HSP90）作为分子伴侣，在高温下防止蛋白质错误折叠和聚集。细胞通过温度感知、信号转导以及热休克转录因子与特定DNA元件的结合来严格调控促进热休克蛋白合成的基因表达。尽管这些保护成分（包括抗氧化防御、热休克蛋白和渗透保护物质的积累）在非生物应力条件下的作用已被充分记录，但这些通路之间的调控协调及其潜在的相互作用在田间热应力条件下仍知之甚少。

除了已充分研究的抗氧化酶和热休克蛋白的作用外，最近人们开始关注过氧化物酶体在维持细胞氧化还原平衡中的作用。这些细胞器在ROS的生成和解毒中起着核心作用，特别是过氧化氢（H?O?），使它们成为植物氧化应激反应的关键组成部分。先前的一些研究已经证明，过氧化物酶体的数量可以作为植物对非生物应力反应和耐受性的潜在生物标志物。过氧化物酶体能够根据环境刺激进行增殖，显示出其对波动的氧化还原需求和应激条件下增强的ROS解毒能力的代谢适应性和可塑性。然而，过氧化物酶体生物发生与其他热响应通路（如抗氧化防御和HSP表达）之间的调控协调在很大程度上仍未被探索，尤其是在小麦中，尤其是在田间条件下。

最近的研究进一步强调了基因型特异性机制在热应力耐受性中的重要性。例如，Pratap等人比较了两种耐热和两种不耐热小麦品种的生理响应、产量表现和蛋白质组谱，发现了它们之间在调控网络、应激蛋白数量和热响应信号通路方面的明显差异。因此，我们假设小麦的热耐受性涉及限制细胞损伤和调节活性ROS稳态的协调机制。基于这一前提，我们重点研究了参与过氧化物酶体生物发生、抗氧化活性和热休克蛋白表达的基因之间的潜在相互作用，以揭示热耐受性的调控机制。本研究通过识别耐热和不耐热小麦基因型中不同的分子网络，填补了对基因型特异性热应力响应理解的关键空白。这些发现为未来培育耐热品种提供了有价值的见解。

结果：
**对热应力的响应：**将播种日期推迟57天使其季节最低和最高温度分别上升了1.89°C和3.44°C（见图S1）。与未受胁迫的植物相比，受热胁迫的植物从花药发育开始到取样期间经历了更高的温度。在对照组条件下，Misr2的籽粒产量为770.33 ± 39.44 g/m2，而Line4的籽粒产量为633.45 ± 9.30 g/m2（图1）。热应力使Misr2的籽粒产量降低了49%（389.79 ± 36.22 g/m2），Line4的籽粒产量降低了57%（273.25 ± 7.60 g/m2），证实了Misr2对热胁迫的更强耐受性。

**基因型特异性的生理响应：**与正常播种相比，热应力显著增加了两种基因型的H?O?水平，表明ROS积累增加（图2）。然而， Neither基因型、处理方式及其交互作用对叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素或总色素含量有显著影响（图3A–D），表明两种基因型在热应力下保持了光合色素的稳定性（图2）。

**生化指标的变化：**热应力使两种基因型的总可溶性糖（TSS）和malondialdehyde（MDA）水平升高（图4A,C）。尽管两种基因型在胁迫下的脯氨酸含量没有显著差异，但Misr2相对于其对照组水平积累了更多的脯氨酸（图4B）。Misr2在热应力下的TSS水平也高于Line4（图4A）。这些结果表明TSS和脯氨酸可能有助于Misr2更好的热耐受性。

**抗氧化酶活性：**热应力增加了两种基因型的POX、SOD和CAT活性（图5A–C）。尽管两种基因型在胁迫下没有显著差异，但Misr2的POX和CAT活性相对对照组增加了更多（图5A,C）。同时，Misr2在热应力后的SOD活性显著升高，而Line4在该参数上没有显著变化（图5B）。热应力还显著增加了两种基因型旗叶中的过氧化物酶体数量（图6）。Misr2在对照条件下的过氧化物酶体数量是Line4的两倍以上，并在胁迫条件下保持了最高水平，显示出更强的减轻氧化损伤的能力（图5）。

**相关基因的表达：**热应力使Misr2中的TaHSP70表达增加了约4.5倍，而在Line4中仅略有增加且不显著（图7A）。相反，热应力显著降低了Line4中的TaHSP90表达，而在Misr2中则没有显著变化（图7B）。

**过氧化物酶体生物发生：**热应力在两种基因型中均下调了TaPEX11.3和TaFIS1A的表达（图9A,C）。然而，它显著上调了Misr2中的TaPEX11.4表达（约5.5倍），而在Line4中没有显著变化（图9B）。此外，热应力降低了Misr2中的TaDRP5B表达，但在Line4中则上调了该基因的表达（图9D）。这些转录响应表明，两种小麦基因型在热应力下对蛋白质稳定性、氧化应激防御和细胞器生物发生的调控机制不同。

**蛋白质-蛋白质相互作用网络：**基于STRING数据库预测的八种编码蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络显示出中等信心水平。分析没有检测到小麦或同源物中的热休克蛋白、抗氧化蛋白和过氧化物酶体生物生成蛋白之间存在直接的相互作用。然而，每个功能组内的基因表现出内部共表达关系，TaHSP70与TaSOD共表达（图10）。图10的替代文本可能是利用人工智能生成的。全尺寸图像。使用小麦转录本的蛋白质序列，通过STRING程序（https://string-db.org/）开发的热休克蛋白（HSP70、HSP90-1）、抗氧化蛋白（SOD、CAT）和过氧化物酶体生物生成机制蛋白（PEX11.3、PEX11.4、FIS1A、DRP5B）的预测蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）模型。网络边缘：线条粗细表示数据的置信度，由P值<1.0e-16支持。最低蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的置信度为0.700。蛋白质使用K均值聚类方法被分为红色（过氧化物酶体网络）、蓝色（热休克蛋白网络）和绿色（抗氧化蛋白网络）。

相关性和主成分分析（PCA）明确了小麦基因型特定的热stress响应策略（图11；表S1）。在Misr2中，ROS与MDA（r=0.97）、过氧化物酶体丰度（r=0.95）、抗氧化酶（CAT、SOD、POX；r≥0.96）、脯氨酸和TSS（r=0.99）显著相关。ROS还与TaHSP70（r=0.98）、TaPEX11.4（r=0.99）和TaCAT1（r=0.92）呈正相关，但与TaHSP90、TaSOD、TaPEX11.3、TaFIS1A和TaDRP5B（r≤-0.83）呈负相关。在Line4中，与ROS相关的特征与渗透保护物质（MDA、TSS、脯氨酸）聚类，表明氧化应激标志物和减轻热诱导的细胞损伤的渗透保护反应之间存在协调关联。PCA解释了Misr2中93.1%的变异和Line4中86.1%的变异（图11；表S1）。总可溶性糖和过氧化物酶体丰度作为培育耐热小麦基因型的潜在生物标志物出现。

主成分分析（PCA）基于生理和基因表达数据的生物图，对于（A）耐受基因型（Misr2）和（B）敏感基因型（Line4）。缩写指的是：HSP基因（热休克蛋白基因表达）、SOD基因（超氧化物歧化酶基因表达）、CAT基因（过氧化物酶基因表达）、PEX11.3基因（过氧化物酶11.3基因表达）、PEX11.4基因（过氧化物酶11.4基因表达）、FIS1A基因（线粒体裂解1基因表达）、DRP5B基因（动力蛋白相关蛋白5B基因表达）、Chl a（叶绿素a）、Chl b（叶绿素b）、Car（类胡萝卜素）、TSS（总可溶性糖）、H2O2（过氧化氢）、MDA（丙二醛）、SOD（超氧化物歧化酶活性）、POX（过氧化物酶活性）、GY/m2（谷物产量/m2）。

热耐受小麦基因型Misr2形成了一个高度结构化且极化的基因网络（图12）。相比之下，敏感基因型Line4显示出由中等到弱相关性主导的碎片化结构（图12）。TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4表现出最高的连通性和基因型之间的相关性极性最显著的变化。具体来说，在比较耐热基因型Misr2和敏感基因型Line4时，七个TaCAT1相关的关联中有六个显示出相同的极性（从正到负或相反）。相比之下，TaHSP70和TaPEX11.4分别显示了五个和三个极性反转。此外，TaPEX11.4显示出较弱的关联，有四个关联从强减弱到中等强度，这与其中心位置和多个网络连接一致。

基于主成分分析（PCA）负荷的热休克蛋白（TaHSP70、TaHSP90）、抗氧化酶（TaSOD、TaCAT）和过氧化物酶体生物生成蛋白（TaPEX11.3、TaPEX11.4、TaFIS1A、TaDRP5B）的相关性网络模型。线条样式代表相关性强度：双线=强（r≥0.75），实线=中等（0.25≤r<0.75），虚线=弱（r<0.25）。颜色表示相关性方向（绿色=正，红色=负）。节点颜色代表功能角色：红色=枢纽基因，绿色=表型转换器，橙色=上下文响应者。这些模型展示了耐受（A）和敏感（B）基因型中的潜在调控交互作用。相比之下，TaPEX11.3、TaFIS1A、TaDRP5B、TaHSP90和TaSOD在它们之间保持了稳定的共调控，但在与三个枢纽基因的关联上表现出基因型依赖性变化。具体来说，在耐热基因型Misr2中，TaPEX11.3与TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4显示出强相关性，而在敏感基因型Line4中这些相关性则相反。TaFIS1A、TaDRP5B和TaSOD在与枢纽基因的相关性上表现出基因型依赖性的符号反转。TaHSP90没有反转相关符号，而是在Line4中从与TaPEX11.4的强相关变为中等相关，这与敏感基因型的整体网络碎片化一致。

基因表达分析显示，在耐受基因型中TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4上调，在不耐受基因型中TaPEX11.3、TaFIS1A、TaDRP5B、TaHSP90和TaSOD下调（图7-9）。基因与性状的相关性进一步将这些枢纽基因与表型表现联系起来（图11）。TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4在两种基因型中都与谷物产量、TSS和脯氨酸显示出相似的相关模式，尤其是在Misr2中相关性更强（图11A）。相比之下，TaSOD和TaDRP5B在与所有测量性状的相关性上发生了反转，包括产量（图11），在耐受和敏感基因型之间。

这些协调的表达和相关模式被整合到基因型特定的调控网络模型中，揭示了Misr2中的高度结构化网络和Line4中的碎片化结构。

讨论本研究通过比较田间诱导的热应力下的耐热和敏感基因型，揭示了小麦耐热性的不同调控机制。我们解决了关于热应力信号通路、渗透保护物质和协调的表型-基因型防御如何相互作用的关键知识空白。我们的结果发现了之前未报道的热休克蛋白（TaHSP70、TaHSP90）、抗氧化酶（TaCAT1、TaSOD）和过氧化物酶体生物生成基因（TaPEX11.3、TaPEX11.4、TaFIS1A、TaDRP5B）之间的相互作用，这些相互作用目前尚未在PPI数据库中记录。这个网络相关性的破坏似乎是研究中的小麦基因型Misr2（耐热）和Line 4（敏感）耐热性降低的原因。

图13提供了一个比较性示意图，总结了小麦对热应力的生理、生化和转录变化。两种基因型在热应力下都显示出升高的氧化应激（H?O?）。值得注意的是，耐热基因型Misr2做出了更协调的响应，积累了更多的总可溶性糖和脯氨酸——增强了渗透调节并稳定了蛋白质和膜。两种基因型的抗氧化酶活性（CAT、POX、SOD）都增加了，但在耐热基因型中与过氧化物酶体丰度更为一致。

整合了耐热（Misr2）和敏感（Line4）小麦基因型的热应激响应。（A）机制模型说明了基因型在热应力下的特定响应。示意图突出了活性氧物种（ROS，显示为H?O?）、抗氧化酶（CAT、POX、SOD）、渗透保护物质（MDA、TSS、脯氨酸）、过氧化物酶体生物生成基因（TaPEX11.3、TaPEX11.4、TaFIS1A、TaDRP5B）和热休克蛋白（TaHSP70、TaHSP90）之间的协调调控。耐热基因型表现出更强的转录激活、增强的蛋白质稳定性和更有效的ROS解毒，有助于细胞保护和光合色素的稳定性。（B）热应激的生理和分子响应的比较总结。绿色向上的箭头表示增加或上调；红色向下的箭头表示减少或下调；蓝色双向箭头表示没有显著变化。所有响应都是相对于非压力对照的。定量数据支持该示意图，捕获了基因型之间的性状级差异。图例解释了图中显示的分子元素和调控过程。

基因表达分析显示，在耐热基因型中TaHSP70、TaPEX11.4和TaCAT1显著上调，而在TaSOD、TaPEX11.3、TaFIS1A和TaDRP5B中下调，只有TaHSP90略有上调，反映了ROS解毒和过氧化物酶体增殖的平衡。相比之下，敏感基因型上调了TaCAT1、TaSOD和TaDRP5B。它下调了TaHSP90、TaPEX11.3和TaFIS1A，TaPEX11.4的变化最小，表明激活了抗氧化和与过氧化物酶体分裂相关的应激响应，但与HSP介导的保护机制的协调有限。尽管在热应力下过氧化物酶体丰度增加，但这种响应与抗氧化和渗透保护机制的整合在耐热基因型中不如在耐热基因型中有效。光合色素（Chl a、Chl b和类胡萝卜素）在两种基因型中保持稳定，表明在热应力下光系统稳定。我们的发现与之前的研究一致，后者报告说耐热小麦基因型积累了更高水平的与耐热性相关的生化标志物，如脯氨酸和总可溶性糖，并且与热敏感基因型相比，表现出更大的应激响应基因的相对表达倍数。在他们的研究中，热敏感基因型在晚播条件下的谷物产量下降更为明显。

过氧化物酶体生物生成机制网络对于植物通过调节ROS清除和维持细胞稳态来适应应力至关重要。高通量过氧化物酶体量化技术的进步确定了过氧化物酶体丰度作为非生物应力耐受性的表型生物标志物。在热应力下，两种小麦基因型的过氧化物酶体数量都增加了；然而，耐热基因型保持了更高的绝对丰度，而敏感基因型的相对增加更为显著。这种模式与在氧化负荷增加或细胞应力需求增加时报告的过氧化物酶体增殖一致，而不是构成性的过氧化物酶体维持。

基因型之间的谷物产量相关性显示，在敏感基因型中，过氧化物酶体丰度的增加与生产力呈负相关，表明这是一种应力诱导的补偿性响应，可能将代谢资源从生长和产量形成中转移出去。相比之下，耐热基因型显示出过氧化物酶体丰度与保护性性状（如TSS和脯氨酸）之间的正相关，表明过氧化物酶体动态与渗透保护和氧化应力缓解机制的更协调整合。在非生物应力下，已有报道指出过氧化物酶体增殖、氧化负荷和生长或产量之间的类似关联。

在转录水平上，TaPEX11.4的诱导在两种基因型中都与过氧化物酶体的积累平行，但在敏感基因型中显著下调，表明功能解耦或异构体贡献的时间变化。TaFIS1A是一个细胞器分裂因子，在两种基因型中也在热应力下下调。在大多数性状中，TaFIS1A显示出负相关，但它与谷物产量和Chl b呈正相关，表明可能与色素维护有关，而不是广泛的应力保护。在敏感基因型中，TaFIS1A还与类胡萝卜素呈正相关，表明可能与光保护色素动态有特定的基因型联系，这可能不直接反映过氧化物酶体增殖效率。在非生物应力条件下，已有报道指出PEX基因的类似异构体特异性调控、应力依赖性的细胞器分裂因子调节以及氧化代谢和光合色素维护之间的功能耦合。

耐热小麦基因型似乎依赖于高水平的构成性过氧化物酶体池，并在热应力下有针对性的诱导TaPEX11.4。相比之下，敏感基因型强烈上调了TaDRP5B，这是一种编码叶绿体分裂所需动力蛋白的基因。结合其与类胡萝卜素的负相关，这种模式更符合叶绿体重塑和光保护调节，而不是增强的过氧化物酶体分裂。

抗氧化酶网络热应力增加了两种基因型中的H?O?和MDA水平，表明氧化应激增加。H?O?既具有损害作用，也具有氧化还原信号分子的作用，而MDA代表与氧化损伤和潜在的次级调节效应相关的脂质过氧化羰基化合物。耐热基因型积累了更高的TSS和脯氨酸，这两者都与过氧化物酶体丰度呈正相关，表明增强了渗透调节和ROS管理。抗氧化酶（SOD、CAT、POX）在两种基因型中都活跃于ROS清除，但它们的调节方式不同。尽管TaSOD的转录水平较低，耐热基因型表现出更高的SOD活性，这表明通过mRNA稳定性或蛋白质周转进行了转录后调控。CAT活性在基因型间保持稳定，反映了其在评估的小麦生长阶段的构成性作用。同时，POX有助于微调细胞内的H?O?水平，从而间接影响ROS介导的信号过程。

基因-性状关联进一步突出了小麦在热适应响应中的基因型特异性策略。两种基因型都在热应力下上调了TaCAT1，确认了其在ROS解毒中的核心作用。在敏感基因型中，TaCAT1和TaSOD的表达与谷物产量和光合色素呈负相关，但与氧化损伤标志物（H?O?、MDA）和渗透调节物质呈正相关，表明了一种通常与氧化负担增加相关的反应性、损伤驱动的抗氧化响应。在耐热基因型中，TaCAT1与大多数性状保持正相关，而TaSOD表现出相反的模式，与所有测量性状呈负相关，除了产量。这种转录丰度与酶活性之间的解耦支持了转录后调控机制在维持耐热性中的贡献，这在热和其他非生物应力下已有广泛报道。

热休克蛋白网络热休克蛋白保护细胞结构并调节应力信号。在植物中，HSP70家族成员主要作为细胞保护性伴侣，在热应力下维持蛋白质稳态，而HSP90则更多地与应力信号组分的调节相关，包括热休克转录因子和激酶级联反应。在耐热基因型中，TaHSP70的表达升高与TaHSP90的表达降低相结合，表明在开花阶段向增强的蛋白质保护功能转变。在两种基因型中，TaHSP70与H?O?均表现出正相关，这与ROS介导的HSP表达激活一致，这是一种明确建立的机制，将氧化信号传导与热休克反应联系起来51。光合色素，包括叶绿素和类胡萝卜素，在两种基因型的热胁迫下保持稳定，这可能反映了长期适应田间条件的结果，而不是急性应激反应52,53。类胡萝卜素作为关键的抗氧化剂，在光合作用过程中保护光合机制，并消散多余的激发能量54,55。值得注意的是，尽管类胡萝卜素含量没有变化，但谷物产量与类胡萝卜素的相关性在两种基因型之间存在显著差异：在耐热基因型中呈正相关，在敏感基因型中呈负相关。这种对比表明，类胡萝卜素相关的光保护能力与热胁迫下的生产力的关系存在基因型特异性差异，而不是类胡萝卜素含量本身的变化。

在耐热基因型中，网络层面的相关性显示类胡萝卜素与TaHSP70之间存在正相关，表明在应激响应网络中色素和伴侣蛋白相关性状协调调节。相比之下，在敏感基因型中，这种关联呈负相关，表明类胡萝卜素状态与热胁迫下HSP70表达之间的关系存在基因型特异性差异。已知TaHSP70和类胡萝卜素都能通过稳定蛋白质并防止氧化损伤来缓解细胞应激48,49,55。TaDRP5B的表达在两种基因型中都与类胡萝卜素呈负相关，这可能反映了与应激反应相关的叶绿体动态变化，而不是对色素稳定性的直接影响38,39。

三个分子网络——过氧化物酶体生物发生、抗氧化防御和热休克蛋白——在热胁迫下表现出不同但相互关联的调节。在耐热基因型中，过氧化物酶体的丰度与TaCAT1和TaHSP70呈正相关，但与TaSOD和TaHSP90呈负相关，这与从应激感知向平衡ROS解毒和蛋白质稳态维护的协调转变一致。类胡萝卜素和TaHSP70形成了一个合作模块，而过氧化物酶体和TaCAT1则锚定了抗氧化剂-细胞器的界面。在敏感基因型中，网络整合较弱且协调性较低：过氧化物酶体的增殖伴随着更高水平的氧化损伤标记物，而TaCAT1和TaSOD的共调节与氧化应激指标的关系比与产量稳定性的关系更密切。类胡萝卜素与应激相关性状之间的关联也与耐热基因型观察到的不同，这表明光保护组分与伴侣蛋白响应之间的耦合发生了变化。

网络间的相关性极性变化，特别是对于TaSOD、TaDRP5B和类胡萝卜素，突出了基因型特异性的应激响应模块重构。总体而言，这一整合的表型-基因型框架表明，小麦的耐热性不仅取决于各个保护网络的能力，还取决于它们在特定热胁迫条件下动态协调的能力。

本研究揭示了小麦基因型特异性热胁迫响应背后的独特转录协调模式，其特征是具有动态中心基因和上下文敏感的外围模块的模块化网络架构。基于相关性的网络分析确定了TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4作为中心枢纽基因，在耐热和耐热敏感小麦基因型之间的基因-基因相互作用中表现出广泛的极性变化。这些基因在耐热背景下也上调，支持它们在基因型特异性应激调节中的作用。相比之下，TaPEX11.3、TaFIS1A、TaDRP5B、TaHSP90和TaSOD在基因型间保持了一致的内部共调节，但与枢纽基因的相关性相反。这些连接性的变化表明，在热胁迫下抗氧化和过氧化物酶体途径之间的调节对齐发生了改变。

一个关键的观察结果是基因到表型相关性的差异。虽然TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4在两种基因型中都与关键表型性状保持一致的相关方向，但其在耐热基因型中的关联更强，尤其是TaHSP70。相比之下，TaSOD和TaDRP5B在所有评估的性状中都表现出完全相反的相关性，包括谷物产量。因此，这两个基因可能是潜在的表型级切换节点，它们对应激表现的贡献可能根据基因型背景而变化，这与基于网络的应激响应可塑性和上下文依赖的基因功能模型一致56,57。相比之下，TaPEX11.3、TaFIS1A和TaHSP90表现出更有限的极性变化和较弱或保守的性状相关性，表明它们在更广泛的应激响应网络中的作用可能更依赖于上下文。这些发现共同支持了热胁迫下转录调节的模块化观点，其中基因型特异性的枢纽基因连接性和外围基因-性状关系的重构有助于表型在不同应激适应中的差异。据我们所知，这是第一个将转录和表型水平上的相关性极性转换与小麦耐热性联系起来的报告，为未来的功能验证和耐逆作物改良策略提供了概念框架。

结论

本研究整合了生理性状、基因表达谱和谷物产量数据，以阐明两种对比小麦基因型耐热性背后的机制。耐热基因型Misr2在与抗氧化剂、过氧化物酶体和HSPs相关的响应方面表现出更好的协调性。Misr2积累了比Line4更多的总可溶性糖（TSS）和TaPEX11.4及TaHSP70的转录，这反映了其对热胁迫的更大代谢和蛋白质稳态保护。所有基因型的热胁迫植物中MDA水平都有所增加，而脯氨酸的反应则取决于基因型，而不是在所有基因型中都相同。在热胁迫下的Misr2和Line4中，TaCAT1也有所诱导，表明该酶在抗氧化系统中的组成作用，而不是基因型相关的表达。两种基因型之间TaCAT1的表达没有显著差异，表明耐热性可以是调节系统的功能，而不是酶本身的表达。

Misr2中TaHSP70和TaHSP90表达模式之间的差异与伴侣蛋白介导的蛋白质保护和应激相关信号组分调节的修改之间的功能分化一致，这不需要基于单一点采样的时间关系。TaSOD转录本表达与SOD活性之间的差异强化了转录后调节作为耐热性适应的观点。基因-性状网络分析表明，耐热性具有模块结构，其中TaHSP70、TaCAT1和TaPEX11.4是枢纽基因，表现出基因型依赖的相关性极性反转，而TaSOD和TaDRP5B代表表型切换节点。与产量相关性状和TaPEX11.4、TaHSP70、TaCAT1及过氧化物酶体密度之间的正相关表明它们可以作为识别耐热小麦品系的生物标志物，就网络行为而言。尽管需要进一步的研究在其他小麦遗传系和环境中验证这些结果，但这里提供了一种结合生理和遗传性状的功能方法，以在较高温度下改良小麦。

材料与方法

使用了两种对比的春播面包小麦（Triticum aestivum L.）基因型：Misr2（SKAUZ/BAV92），一种耐热品种，以及Line4（KINGBIRD#1//INQALAB91*2/TUKURU），一种热敏感品系。Misr2种子来自埃及吉萨的农业研究中心，而Line4种子从墨西哥的CIMMYT进口。这两种基因型是从20个小小麦基因型中通过两个连续季节的评估试验选出的，使用的是晚播程序3。该研究在两种播种条件（预期播种日期11月28日和晚播日期1月24日）下重新评估了这两个基因型。通过将播种日期推迟57天来施加热胁迫，这是一种广泛用于诱导小麦终端热胁迫的田间方法2,58。采样在开花期进行。图S1显示了两种条件下平均的季节性最低和最高温度以及采样时的温度。在采样当天，常规播种和晚播的最高温度分别为约26.6°C和33.5°C。这两种基因型都在埃及吉萨的开罗大学研究农场的1.0×1.0米地块中种植，行间距为25厘米，土壤类型为粘壤土，其物理化学性质如下：砂（33.1%）、粉砂（34.6%）、粘土（32.3%）、pH值（7.49）和电导率（E.C.，1.58 dS/m）。在整个小麦生长期间根据需要进行了表面补充灌溉。所有农业实践都遵循标准的小麦种植规程。埃及气象局（EMA）在2019/2020生长季节期间定期记录了最高和最低温度。

采样协议

从两种基因型的内部行在开花后第7天（DAA）收集旗叶，每种基因型和处理重复三次。样本立即在液氮中冷冻并储存在-80°C，直至进一步使用。采样在下午1:00进行，此时太阳辐射垂直于表面，以最小化温度变化。在季节结束时，收获了所有植物，并测量了两种基因型和处理的每平方米谷物产量。

表型和生化参数

H2O2的内源性含量按照Velikova等人的方法59测量。小麦叶片中的叶绿素a（Chl a）和b（Chl b）以及类胡萝卜素（CAR）根据Lichtenthaler和Buschmann的方法60计算。脯氨酸含量使用Bates等人描述的ninhydrin方法61确定。总可溶性糖（TSS）使用DuBois等人描述的葡萄糖校准曲线62进行量化。丙二醛（MDA）含量，作为脂质过氧化的代理指标，根据Chen和Wang的协议63进行评估。

酶活性测量

超氧化物歧化酶（SOD，EC 1.12.1.1）和过氧化氢酶（CAT，EC 1.11.1.6）从叶片组织中提取，其活性使用Cary Series UV–Vis分光光度计（Agilent Technologies）根据Chen和Wang的方法63进行量化。过氧化物酶（POX，EC 1.11.1.7）的活性根据Kumar和Khan的方法64进行量化。

测量过氧化物酶体丰度

从每种基因型和处理的每个生物重复样本中提取总蛋白质含量。对于每个生物重复样本，过氧化物酶体丰度在三个技术重复中进行了测定。使用荧光探针N-BODIPY检测蛋白质提取物中的过氧化物酶体丰度。提取和量化按照Fahy等人描述的协议29进行，使用CLARIOstar分光荧光仪，激发和发射波长分别设置为490和530纳米。

使用定量实时PCR（qRT-PCR）的基因表达分析

使用GeneJET? Plant RNA Purification Mini Kit（ThermoFisher）从小麦叶片中提取总RNA，按照制造商的说明进行。使用NanoDrop? One/OneC Microvolume UV–Vis分光光度计（Thermo Fisher）评估RNA的质量和数量，并将浓度调整到50 ng/μL。使用High-Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems）合成第一链cDNA。使用PowerUp? SYBR? Green Master Mix（Thermo Fisher）在20 μL反应中进行定量PCR（qPCR），每个样本有三个生物学和三个技术重复。

目标基因的引物，包括小麦管家基因Actin-765（GenBank accession XM_044594643.1），使用Primer-BLAST软件（NCBI）设计，该软件整合了Primer3（版本2.5.0）进行引物设计，并使用BLAST和全局比对算法筛选针对小麦基因组和转录组数据库的引物对（表1）。这一过程通过避免与非目标基因转录本潜在的同源性来确保特异性。设计的引物使用Invitrogen合成服务（Town, Country）合成。

表1 列出了用于定量实时PCR（qRT-PCR）的目标基因和特定引物。

qPCR热循环条件遵循Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统上PowerUp? SYBR? Green Master Mix的制造商建议。该协议包括四个阶段：初始尿嘧啶-DNA糖基化酶（UDG）激活步骤在50°C下进行2分钟，然后是Dual-Lock? DNA聚合酶激活在95°C下进行2分钟。接下来是40个循环：在95°C下变性3秒，在60°C下退火/延伸30秒。在扩增循环结束时进行了熔解曲线分析，以验证PCR产物的特异性。

基因表达水平通过使用2^(?ΔΔCt)方法计算折叠变化±标准差（SD）来量化，如Livak和Schmittgen66所述。

通过JMP Pro（v8.0；SAS Institute，Cary，NC，USA）进行了双因素方差分析（ANOVA），以估计最小二乘均值（LS均值），该分析调整了方差结构和潜在的数据不平衡。然后使用Tukey的诚实显著差异（HSD）测试进行事后比较，以确定基因型X处理组合之间的统计显著差异。

为了识别性状-基因表达模式，通过将九个表型性状与八个热响应基因的表达谱整合进行了主成分分析（PCA）。这种多变量方法实现了降维，促进了基因型/处理的聚类，并揭示了Misr2和Line4中协调的应激响应模式。所有生理特征和基因表达数据的均值及标准差均使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）绘制。

**网络构建方法**
通过计算八个目标基因的表达值之间的成对皮尔逊相关系数，构建了基因型特异性的基因共表达网络：热休克蛋白70（TaHSP70）、热休克蛋白90（TaHSP90）、超氧化物歧化酶（TaSOD）、过氧化氢酶1（TaCAT1）、裂解蛋白1A（TaFIS1A）、动力蛋白相关蛋白5B（TaDRP5B）、过氧化物酶体生物发生因子11.3（TaPEX11.3）和过氧化物酶体生物发生因子11.4（TaPEX11.4）。此后，整篇手稿中将统一使用这些基因符号。相关系数被分类为不同的强度等级，以便于视觉上的清晰展示（见图12，详细信息请参见图例）。这些分类用于构建基因型特异性的共表达网络，从而能够对热应激下的转录协调进行视觉和定量比较。

**蛋白质-蛋白质相互作用预测**
使用STRING数据库（版本12.0；https://string-db.org）对所研究基因编码的蛋白质进行蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）预测。选择Triticum aestivum作为目标生物。分析内容包括实验数据、整理过的数据库、基因共表达、基因邻域、基因融合以及文本挖掘等相互作用来源。筛选相互作用时采用了中等最低置信度标准（≥0.400）。将得到的PPI网络可视化，以识别潜在的功能模块和关键相互作用蛋白。还在STRING数据库内进行了基因本体（GO）和KEGG pathway富集分析，以探究这些相互作用的生物学意义。