将形态生理特征与盐响应基因表达相结合，揭示了蚕豆在面对NaCl胁迫时具有品种特异性的耐受机制

《Scientific Reports》：Integrating morphophysiological traits with salt-responsive gene expression uncovers cultivar-specific tolerance mechanisms in faba beans facing NaCl stress

　　摘要：土壤盐碱化限制了北非和近东地区蚕豆（Vicia faba L.）的产量。在受控温室条件下，对三种埃及蚕豆品种Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5分别施加了0、150和200 mM的NaCl处理。研究了二十项形态学、生理学和生化特征，并对11个盐胁迫响应基因进行了定量RT-PCR分析。双向方差分析（Two-way ANOVA）发现品种、NaCl处理及其相互作用对某些特征（包括根长、叶片K?浓度、净光合作用、气孔导度、胞间CO?浓度以及三种表皮蜡组分）有显著影响，表明这些特征在不同基因型中对盐分的响应存在差异。对于其他特征（如分枝数、根干重、根冠比和叶片氮含量），只有品种因素显著，处理和相互作用均无显著效果。Nubaria 1在200 mM NaCl处理下枝干重减少最小（14%），在所有盐浓度下叶片K?浓度保持稳定（13.3–13.6 g kg?1），且在200 mM NaCl处理下的荚果数最多（每株1.78个）。此外，该品种在两种盐胁迫水平下所有11个基因的诱导倍数最低。Sakha 5在盐胁迫下根长增幅最大（从对照组的3,577 cm增加到200 mM NaCl处理后的8,664 cm，增幅达+142%），在所有基因类别中的诱导倍数最高；但在200 mM NaCl处理下所有重复实验中均未结荚。Giza 716在对照条件下的净光合率最高（10.33 μmol CO? m?2 s?1），在其他特征上表现为中等水平。随着NaCl浓度的增加，所有三个品种的净光合作用均下降，胞间CO?浓度从对照组的327 μmol mol?1上升到200 mM NaCl处理下的378–413 μmol mol?1。所有品种的表皮蜡总量在150 mM NaCl时达到最大值，而在200 mM NaCl处理下Sakha 5和Giza 716的表皮蜡含量下降，尽管Sakha 5的CER1基因表达持续上调。主成分分析（Principal Component Analysis）解释了总变异的70.7%（PC1贡献39.5%，PC2贡献31.2%），且在所有处理水平上品种样本在PC1轴上仍保持分离。叶片K?浓度和盐胁迫下的净光合作用表现出最明显的品种间差异，这些特征被认为是盐耐性筛选项目中早期表型分析的实用指标。

引言：全球灌溉地区的次生盐碱化现象正在加速，据估计约有20%的灌溉土地和33%的耕地受到一定程度的盐害影响1,2。由于灌溉管理不善、地下水位上升和气候干旱，每年约有1000万公顷的良沃农田丧失3。对于大多数耐盐作物而言，这会导致土壤中NaCl含量升高，从而降低水分可用性并使植物暴露于有毒离子中，进而破坏细胞功能并持续降低产量4。随着对富含蛋白质的食品需求增加以及盐碱土壤向重要豆科作物产区的扩展，培育耐盐品种已成为保障粮食安全的关键任务。在冷季豆科作物中，蚕豆（Vicia faba L.）具有特殊的营养和社会经济价值。其种子蛋白质含量通常占干重的26%至35%，且氨基酸组成理想，是北非、近东和南亚农村人口的主要蛋白质来源5,6。蚕豆在新石器时代起源于肥沃新月地带和地中海地区，已有超过八千年的栽培历史7，但仍是基因组研究最不足的豆科作物之一。其约13.4 Gb的大二倍体基因组是已知栽培豆科作物中最大的，这在一定程度上阻碍了分子育种和密集标记的开发8。矛盾的是，目前这种作物的种植扩展主要集中在埃及、埃塞俄比亚和尼罗河三角洲等半干旱和依赖灌溉的地区，这些地区极易受到盐碱化的影响9。缩小农艺需求与基因组能力之间的差距首先需要了解已适应盐碱环境的种质的生理多样性10。

盐胁迫通过两个不同的阶段影响植物健康，这两个阶段在时间和机制上有所不同11。首先是渗透阶段，发生在接触NaCl后的几分钟到几小时内，此时土壤水势降低，导致气孔关闭，从而减少水分流失和光合作用所需的CO?吸收。第二个是离子阶段，持续数天到数周，随着Na?和Cl?离子在参与光合作用的叶片组织中积累到有毒水平11,12。这一阶段会抑制酶活性，产生活性氧并加速细胞老化13,14。在蚕豆中，由于植物对Na?和Cl?的联合毒性特别敏感，这些负面影响更为严重：Tavakkoli等人15的研究表明，这两种离子单独作用都会损害植物生长，使得蚕豆成为最耐盐的豆科作物之一。最易受影响的时期是萌发和幼苗早期生长16，但包括开花、荚果形成和种子充实在内的整个生殖期也都很敏感16。因此，即使是在生长季节中的中等盐度也会导致显著的经济产量损失，而不会表现出明显的毒性症状16。植物通过多层次的反应机制来减轻离子损伤，包括ABA触发的K?外排导致的气孔关闭，从而减少蒸腾和Na? transport17,18。在藜麦中，这一机制还通过降低气孔密度来增强（形成结构屏障以减少水分流失19）。然而，气孔限制会进一步降低CO?的可用性，从而比离子浓度更严重地影响光合作用和生长20。细胞耐盐性依赖于离子稳态，保持适当的细胞质K+/Na+比例以支持酶活性、膜电位和渗透平衡21。Na?的排除涉及根部的Na+/H+反向转运蛋白、细胞质内的NHX交换蛋白以及HKT转运蛋白，这些蛋白负责Na?的循环22。Na?竞争期间的K?保留涉及电压门控通道，不同基因型之间存在差异22。叶片K+/Na+比例可以反映植物的耐盐性23。尽管了解了这些机制，但由于盐耐性的复杂性（受基因型、发育阶段和胁迫水平的影响），将其应用于育种仍具有挑战性24。仅基于视觉特征的筛选方法无法准确反映实际情况，也无法有效区分不同的耐盐策略。田间盐分浓度的变化增加了测试难度，需要在不同地点和季节进行数据收集。耐盐机制通常需要耗费大量能量，可能导致生产力较低的基因型得以存活。成功的表型分析应考虑特征的多变性，并能在多种环境中保持稳健性。目前关于蚕豆的研究较少；大多数研究仅在单一NaCl浓度下探讨单一特征，因此只能提供有限的知识。此外，对蚕豆中HKT和SOS通路分子机制的理解尚不充分，尤其是在埃及的盐碱土壤中。整合不同盐浓度和环境下的生理数据和转录数据对于开发可扩展和有效的选择策略至关重要。

本研究旨在填补这一空白，假设适应不同农艺条件的埃及蚕豆品种在耐盐性及相关机制上存在差异。通过多变量、多特征评估而非单一特征筛选，可以识别出这些品种的独特生理策略。为此，我们将三种NaCl浓度（0、150和200 mM）应用于三个品种（Nubaria 1、Giza 716、Sakha 5），并测量了二十项与形态学、生理学和生化相关的特征，以及参与离子运输、渗透调节、抗氧化防御、转录调控和蜡生物合成的11个盐胁迫响应基因的表达。主要目标是：(i)探讨品种和处理方式如何共同影响盐胁迫下的特征表达；(ii)利用离子、光合作用、根系结构和转录数据确定盐耐性差异的机制；(iii)寻找可用于筛选耐盐基因型的可靠特征。

材料与方法：
选择了三种埃及蚕豆（Vicia faba L.）品种Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5，它们具有不同的农艺背景，并在易受盐碱化影响的地区种植。种子来自埃及吉萨农业研究中心的豆类研究所。种子经0.5%次氯酸钠浸泡5分钟进行表面消毒，然后用无菌蒸馏水冲洗三次。种子播种深度为3厘米，种植在装有灭菌沙子与泥炭混合物（2:1，v/v）的5升塑料盆中（初始电导率<0.2 dS m?1）。盆栽植物置于气候控制的温室中，温度为25/18°C（白天/夜晚），光照时间为16/8小时，并补充光照（冠层光子通量密度为400 μmol m?2 s?1），实验期间相对湿度保持在60–70%。实验采用完全随机设计（3×3因子结构：三个品种和三个NaCl浓度（0、150和200 mM），每个处理组合有三个独立的盆栽重复，共27个实验单元。当幼苗长出四片真叶时（播种后约21天）开始盐处理。为减少渗透冲击，通过每次灌溉增加最终剂量的三分之一逐步达到目标NaCl浓度。在逐步诱导期后，每隔两到三天灌溉一次，维持植物在指定盐处理条件下直至收获，确保基质表面略微排水（渗出液比例10–15%），以防止盐分积累超过目标浓度。通过盆底孔实现自由排水，不进行渗出液循环。使用HI 9813-6便携式电导率计（Hanna Instruments）每周监测基质电导率（EC值在目标范围的±10%以内：0 mM NaCl：<0.5 dS m?1；150 mM NaCl：14.2±1.1 dS m?1；200 mM NaCl：18.8±1.3 dS m?1）。所有测量在播种后60天的荚果形成期进行。

生长和生殖特征测量：播种60天后，记录每株植物的以下参数：使用测高杆测量从地面到顶端分生组织的株高；直接计数主分枝数、开放花朵数和形成的荚果数；将地上和地下组织分离，用自来水冲洗干净，吸水纸吸干，70°C烘烤72小时至恒重，称重以确定地上干重、根干重和根冠比。

根系结构分析：将完整的根系从培养基中分离出来，通过装有0.5毫米筛网的水浴轻轻清洗以防止细根丢失。洗净的根系悬浮在浅水中，使用Epson Expression 12000XL平板扫描仪（Epson America，美国加利福尼亚州长滩）进行数字扫描，扫描分辨率400 dpi。使用WinRHIZO Pro软件（版本2017a；Regent Instruments Inc.，加拿大魁北克；https://regent.qc.ca/assets/winrhizo_software.html）从灰度图像中提取总根长、投影表面积和根体积，设置默认阈值0.05毫米。扫描后的根系转移到预先称重的纸袋中，70°C烘烤72小时后称重。

气体交换测量：在每个植株最年轻的完全展开叶片上，于太阳时间9:30至12:00使用LI-6800开放式红外气体分析仪（LI-COR Biosciences，美国内布拉斯加州林肯）进行气体交换测量。测量条件与温室环境一致：参考CO2浓度为400 μmol mol?1，光合光子通量密度为1000 μmol m?2 s?1（由仪器LED光源提供），叶片温度为25±0.5°C，蒸汽压差为1.5±0.2 kPa。每次测量前先平衡2分钟，当30秒平均窗口内的净光合率（Pn）变异系数低于1%时开始记录。仪器直接记录以下参数：Pn（μmol CO? m?2 s?1）、气孔对水蒸气的导度（gs, mol H2O m?2 s?1）、蒸腾速率（Tr, mmol H2O m?2 s?1）和胞间CO?浓度（Ci, μmol mol?1）。

叶片矿物质营养分析：气体交换测量后立即切除同一叶片，冷冻干燥48小时，然后用球磨机（MM400，Retsch GmbH，德国哈恩）研磨成细粉。通过微库仑滴定法（使用硼酸作为捕获剂和标准化H2SO4）测定0.1克干燥叶片材料中的总氮含量。从0.2克干燥材料中提取了磷和钾的浓度，这些材料经过湿酸消化处理后，使用5:1（体积比）的65% HNO3和70% HClO4混合物在180°C的消化块上进行消化，直到溶液变得清澈。消化后的样品用去离子水（18.2 MΩ cm）稀释至25 mL；磷通过钼酸盐-蓝色比色法在882 nm处进行定量，钾则通过电感耦合等离子体光学发射光谱法（ICP-OES；iCAP 7400，Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）进行测量。所有营养物质的浓度均以干重为基础表示（g kg?1 DW）。

**表皮蜡的提取与定量**

表皮蜡通过简单的溶剂浸透法从新鲜叶片组织中提取。对于每个样本，取1.0克新鲜叶片组织（提取前通过扫描测量上表面面积），将其浸入50毫升玻璃瓶中的20毫升HPLC级氯仿中，轻轻搅拌30秒；这种快速浸透方法可以选择性去除表面蜡层，而不破坏内部脂质。将氯仿提取物转移到预先称重的玻璃瓶中，然后再用额外的10毫升氯仿重复提取一次；然后将提取物合并。在40°C的水浴中，用干燥的氮气气流蒸发溶剂。将干残留物溶解在含有2微克十四烷作为内标物的100微升吡啶中，并在70°C下用100微升N, O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺（BSTFA；Sigma-Aldrich，St Louis，MO，USA）进行衍生化处理60分钟，将含羟基的蜡成分（伯醇、脂肪酸、甾醇）转化为它们的三甲基硅基醚衍生物。

通过气相色谱-质谱（GC-MS）分析蜡的组成，使用的是Agilent 7890B气相色谱仪和5977A单四极杆质量选择检测器（Agilent Technologies，Santa Clara，CA，USA），配备DB-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm内径 × 0.25 μm膜厚）。程序设定的 oven 温度为50°C持续2分钟，然后以每分钟10°C的速率升温至200°C，再以每分钟5°C的速率升温至320°C，最后保持15分钟。以不分流模式进行注射，进样口温度为300°C；载气为氦气，流量为每分钟1.2毫升。化合物的鉴定基于与NIST 2017数据库中的质谱进行比较（匹配阈值≥85%），并同时注射 authentic 标准品以验证代表性的奇数碳链烷烃（C27–C35）和伯醇（C22–C30）。通过相对于内标物的总离子电流色谱图积分来定量烷烃和醇类成分，浓度以每平方厘米叶面积的微克数表示。总蜡含量为烷烃和醇类成分的总和。

**RNA提取、cDNA合成及定量RT-PCR**

用于基因表达分析的叶片样本来自用于气体交换测量的同一最年轻的完全展开的叶片，立即在液氮中快速冷冻，并储存在-80°C直到后续处理。从100毫克研磨后的冷冻组织中提取总RNA，使用的是改良过的十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）提取协议，该协议适用于富含多糖的蚕豆组织：组织在900微升提取缓冲液（2% CTAB、2% 聚维吡咯酮 MW 40,000、100 mM Tris-HCl pH 8.0、25 mM EDTA、2 M NaCl、2% β-巯基乙醇、0.05% 胞苷）中在65°C下处理10分钟，然后使用氯仿和异戊醇（24:1，体积比）进行两次提取。RNA从水相中用0.25体积的10 M LiCl在4°C下过夜沉淀，通过离心（10,000 × g，30分钟，4°C）沉淀，再用70%乙醇洗涤两次。沉淀物重新悬浮在不含RNase的水中。

通过柱上DNase I处理（RNase-Free DNase Set，QIAGEN，Hilden，Germany）去除残留的基因组DNA，按照制造商的协议进行。通过变性琼脂糖凝胶电泳（1% 琼脂糖，1× MOPS缓冲液）评估RNA的完整性；显示28 S和18 S rRNA条带完整且28 S/18 S比率≥1.5的样本用于后续分析。使用NanoDrop One分光光度计（Thermo Fisher Scientific）测定RNA浓度和纯度（A260/A280比率1.95–2.10）。使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）和oligo(dT)18引物，从1微克总RNA合成第一链cDNA，按照制造商的热循环程序（42°C处理60分钟，70°C处理5分钟）进行反应。

定量实时PCR（qRT-PCR）在LightCycler? 480系统（Roche Life Science，Penzberg，Germany）上进行，使用SYBR Green I Master Mix（Roche），最终反应体积为20微升，包含4微升1:10稀释的cDNA、10微升2× SYBR Green Master Mix和0.4微摩尔的每个引物。热循环条件为：95°C处理5分钟（初始变性）；45个循环，每个循环95°C处理10秒、60°C处理20秒、72°C处理20秒；然后以0.1°C的增益从65°C升温至97°C进行熔解曲线分析以确认扩增子的特异性。所有反应重复三次，并在每个板上包括无模板和无逆转录酶对照。表S1提供了十一个目标基因（SOS1、HKT1、PIP2、P5CS、P5CR、CAT、SOD、APX、DREB2、LEA、CER1）和两个参考基因（ACT编码肌动蛋白；UBQ编码泛素）的引物序列、扩增子长度、熔解温度和GenBank访问编号。本研究中使用的所有引物都是直接根据GenBank中存储的已确认的蚕豆（Vicia faba）特异mRNA序列设计的（访问编号列在表S1中），HKT1和DREB2的引物是根据豌豆（Pisum sativum）中的同源序列设计的（序列一致性在扩增子区域达到91%以上，通过BLASTn与蚕豆转录组进行了验证）。通过所有11个目标基因的单峰熔解曲线以及代表PCR产物的凝胶电泳确认了扩增子的特异性，这些产物显示了预期的大小（表S1）。通过将合并的cDNA进行五点十倍系列稀释来验证每个基因的引物效率；所有效率都在95–105%范围内（R2≥0.99）。使用geNorm（版本3.5）确认了所有品种-处理组合中的参考基因稳定性，ACT和UBQ的稳定性值（M）均低于0.5。相对表达水平通过2?ΔΔCT方法计算，并以各自品种的对照组的几何平均值进行归一化。

**统计分析**

所有性状数据都进行了双因素方差分析（ANOVA），固定因素为品种（C）和NaCl处理（T）及其交互作用（C×T），使用R版本4.2.1中的aov()函数（R Core Team，2022）。在使用ANOVA之前，分别使用Shapiro–Wilk检验和Levene检验评估了正态性和方差同质性；没有任何变量需要转换。当ANOVA显示显著效果（P<0.05）时，使用Tukey’s honest significant difference（HSD）post-hoc检验进行均值比较，并使用multcompView包生成紧凑字母显示。

使用cor()函数计算了每个NaCl处理水平下所有测量性状之间的Pearson相关系数，并通过具有Bonferroni校正的双尾t检验评估显著性。相关矩阵使用corrplot包以热图形式可视化。使用prcomp()函数对完整的标准化数据集（中心化、单位方差缩放）进行了主成分分析（PCA）；使用factoextra包生成biplots，并按品种绘制了95%浓度椭圆。qRT-PCR的表达数据使用线性混合效应模型进行分析，固定因素为品种和NaCl处理，随机效应为生物重复，通过lme4包实现；使用Tukey’s HSD在α=0.05的水平上评估每个基因内处理均值之间的成对对比。所有图表都是在ggplot2（版本3.4.0）中生成的。除非另有说明，数据以均值±标准误差（SEM）的形式呈现。

**盐胁迫对生长和生殖参数的影响**

盐胁迫逐渐抑制了所有三个品种的的营养生长，尽管减少的程度和模式在不同品种间有显著差异（图1a-d）。在对照条件下，Giza 716是最高的品种（平均高度105.9厘米），其次是Nubaria 1（98.0厘米）和Sakha 5（77.0厘米）。NaCl浓度的增加降低了所有三个品种的植物高度；在200 mM NaCl时，G 716、Nubaria 1和SAKHA 5的高度分别降至84.1厘米、82.2厘米和63.3厘米，分别减少了21%、16%和18%。因此，在严重盐胁迫条件下，Sakha 5经历了最大的绝对高度损失（图1a）。分支数在NaCl处理或品种-处理交互作用下没有显著变化，这与表1中的ANOVA结果一致（图1b）。Sakha 5在所有条件下产生的分支数最多（平均每个植物4.0个），而在200 mM NaCl时分支数分别为3.75个和1.25个。花数在不同品种间有显著差异，并且受到NaCl处理的显著影响，存在显著的C×T交互作用（表1；图1c）。在对照条件下，Nubaria 1每个植物产生的花数最多（平均19.9个），其次是Giza 716（5.3个）和Sakha 5（2.9个）。在200 mM NaCl时，Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5的花数分别降至14.8个、3.7个和2.7个，分别减少了30%、30%和8%。Sakha 5在200 mM NaCl下的相对较低的花数减少反映了其在对照条件下的低基线值，而不是绝对花数损失的不同（图1c）。豆荚数在不同品种间也有显著差异，并且随着NaCl浓度的增加而减少，存在显著的处理效应（表1；图1d）。在对照条件下，Nubaria 1每个植物产生的豆荚数最多（1.65个），其次是Giza 716（0.75个）和Sakha 5（0.50个）。在150 mM NaCl时，Nubaria 1的豆荚数增加到2.57个，而Giza 716和Sakha 5仍然相对较低，分别为1.25个和0.50个。在200 mM NaCl浓度下，所有品种的荚果数量均下降：Nubaria 1每株植物的荚果数量保持在1.78个，Giza 716下降到0.25个，而Sakha 5则没有产生荚果。图1。该图片的替代文本可能是通过人工智能生成的。全尺寸图片。

NaCl处理对三种蚕豆（Vicia faba）品种的（a）植株高度、（b）分枝数量、（c）花的数量以及（d）每株植物的荚果数量的影响。条形图表示平均值±标准误差（SE）。每个面板内条形图上不同的字母表示存在显著差异（Tukey’s HSD，P < 0.05）。

在盐胁迫下，生物量的积累和分配方式有所不同。不同品种的地上部干重有所不同，并且随着NaCl浓度的增加而减少，尽管其减少的程度在不同基因型之间有所差异（图2a）。在对照条件下，Sakha 5产生的地上部生物量最高（4.06克/株），其次是Nubaria 1（3.82克/株）和Giza 716（3.69克/株）。在200 mM NaCl浓度下，Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5的地上部干重分别下降到3.27克/株、2.75克/株和2.72克/株，分别比对照减少了14%、25%和33%。因此，Nubaria 1在对照和200 mM NaCl处理之间的地上部干重比例下降最小。根部的干重在不同品种间也有显著差异（图2b）。在对照条件下，Sakha 5的根系最重（1.51克/株），约为Giza 716（0.47克/株）的3.2倍，是Nubaria 1（0.38克/株）的4.0倍。在200 mM NaCl浓度下，Sakha 5的根干重下降到0.90克/株（减少了40%），而Nubaria 1基本保持不变（0.37克/株，减少了3%），Giza 716略有增加（增加到0.49克/株）。根与地上部的比例在不同品种间也存在显著差异，在所有处理水平上Sakha 5的比例都高于Giza 716或Nubaria 1（图2c）。在对照条件下，这一比例为Sakha 5为0.38，Giza 716为0.13，Nubaria 1为0.10。在200 mM NaCl浓度下，这一比例在Giza 716中增加到0.19，在Sakha 5和Nubaria 1中保持相似（分别为0.33和0.11）。

三种蚕豆品种对盐度的根系结构响应在幅度和方向上都有显著差异（图2d–f）。在对照条件下，Sakha 5拥有最复杂的根系，总根长（3,577厘米）、根表面积（1,169平方厘米）和根体积（24.45立方厘米）分别比Nubaria 1（1,900厘米；322平方厘米；4.35立方厘米）和Giza 716（2,529厘米；409平方厘米；5.37立方厘米）高出2.8至5.6倍。随着NaCl浓度的增加，Sakha 5的根长显著增加：从对照条件的3,577厘米增加到150 mM NaCl条件下的7,315厘米（增加了104%），并在200 mM NaCl条件下增加到8,664厘米（增加了142%）。Nubaria 1的根长在150 mM NaCl条件下仅略有增加（增加到2,605厘米，增加了37%），而在200 mM NaCl条件下基本保持不变（2,519厘米，增加了33%）。Giza 716的根长在所有处理水平上保持稳定（2,350–2,514厘米），NaCl浓度对其没有显著影响。根长与品种和处理水平的交互作用非常显著（P < 0.001；表1），这证实了不同基因型对盐度反应的方向和幅度存在差异。在盐胁迫下，Sakha 5的根表面积和根体积也显著增加（分别为1,220–1,377平方厘米和16.4–17.7立方厘米），而在Nubaria 1和Giza 716中这些参数的变化相对较小且不显著。双因素方差分析表明，根表面积和根体积未受到处理或品种与处理水平交互作用的影响（表1），而根长则表现出显著的交互作用。这表明Sakha 5在盐胁迫下的变化主要是通过延长根长来实现的，而不是通过增加根直径或分枝密度。

在盐胁迫下，不同品种的叶片氮浓度存在显著差异，但NaCl处理或品种与处理水平的交互作用对其没有显著影响（表1；图2g）。在对照条件下，Sakha 5的叶片氮含量最高（13.2克/千克），其次是Giza 716（9.7克/千克）和Nubaria 1（7.6克/千克）。在所有NaCl浓度下，各品种的叶片氮含量都处于相对狭窄的范围内（9.5–15.4克/千克）。

叶片磷浓度受到品种和NaCl处理的显著影响，且两者之间没有显著的交互作用（表1；图2h）。在对照条件下，Sakha 5的叶片磷含量最高（0.025克/千克），其次是Giza 716（0.018克/千克）和Nubaria 1（0.017克/千克）。所有三个品种的叶片磷含量都随着NaCl浓度的增加而下降，在200 mM NaCl条件下降至约0.013–0.025克/千克。品种与处理水平的交互作用不存在，表明不同基因型的下降趋势和幅度相似。

叶片钾浓度受到品种、NaCl处理及其交互作用的显著影响（P < 0.001；表1；图2i）。在对照条件下，Nubaria 1的叶片钾含量最高（13.3克/千克），Sakha 5（13.2克/千克）和Giza 716（12.2克/千克）略低。在200 mM NaCl条件下，三个品种的叶片钾含量呈现不同的变化趋势：Nubaria 1没有下降（仍为13.6克/千克），Giza 716略有下降（降至12.3克/千克），而Sakha 5的下降最为显著（降至11.5克/千克）。因此，三个品种在NaCl不同浓度下的叶片钾含量变化轨迹不同，这也是交互作用显著的原因。

NaCl处理对三种蚕豆品种的（a）地上部干重、（b）根部干重、（c）根与地上部比值、（d）总根长、（e）根表面积、（f）根体积、（g）氮、（h）磷和（i）钾的影响。条形图表示平均值±标准误差（SE）。不同的字母表示存在显著差异（Tukey’s HSD，P < 0.05）。

NaCl处理显著影响了气体交换参数和光合作用响应。在对照条件下，Giza 716的光合速率最高（P? = 10.33 μmol CO? m?2 s?1），其次是Sakha 5（9.13 μmol CO? m?2 s?1）和Nubaria 1（7.40 μmol CO? m?2 s?1）（图3a）。在200 mM NaCl条件下，Giza 716、Sakha 5和Nubaria 1的光合速率分别下降到3.93、3.69和3.30 μmol CO? m?2 s?1，较对照分别减少了62%、60%和55%。所有品种的气孔导度（g?）随着NaCl浓度的增加而下降（图3b）。在200 mM NaCl条件下，Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5的气孔导度分别减少了67%、54%和58%（从0.150 mol H?O m?2 s?1降至0.050 mol H?O m?2 s?1、0.130 mol H?O m?2 s?1和0.120 mol H?O m?2 s?1）。蒸腾速率（Tr）在所有品种和处理水平上也表现出类似的下降趋势（对照条件：Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5分别为0.94、0.81和0.59 mmol H?O m?2 s?1；200 mM NaCl条件：分别为0.35、0.39和0.36 mmol H?O m?2 s?1）（图3c）。所有品种的细胞内CO?浓度（Ci）随着NaCl浓度的增加而增加（图3d）。在对照条件下，Giza 716的细胞内CO?浓度最低（327 μmol mol?1），而Nubaria 1（364 μmol mol?1）和Sakha 5（348 μmol mol?1）较高。在200 mM NaCl条件下，Nubaria 1、Giza 716和Sakha 5的细胞内CO?浓度分别增加到391、413和378 μmol mol?1。因此，在两种胁迫水平下，P?的下降伴随着Ci的增加。

NaCl处理对三种蚕豆品种的叶表面蜡组成和总含量产生了影响。在所有三个品种中，叶表面蜡的组成和总含量都随着NaCl处理而变化，且三种蜡成分的品种与处理水平的交互作用均显著（表1；图4）。在对照条件下，Sakha 5和Giza 716的总蜡含量（分别为6.46 μg cm?2和6.27 μg cm?2）高于Nubaria 1（2.37 μg cm?2）（图4a）。在150 mM NaCl条件下，所有三个品种的总蜡含量均增加，Sakha 5、Giza 716和Nubaria 1分别达到9.85 μg cm?2、8.21 μg cm?2和6.32 μg cm?2。在200 mM NaCl条件下，Sakha 5的总蜡含量从150 mM时的峰值下降到2.91 μg cm?2，Giza 716下降到3.72 μg cm?2，而Nubaria 1的下降幅度较小（从150 mM时的4.74 μg cm?2降至2.91 μg cm?2）。因此，尽管在对照条件下Nubaria 1的总蜡含量最低，但在200 mM NaCl条件下它的总蜡含量仍然是最高的。在150 mM NaCl条件下，Nubaria 1的烷烃含量增加（从0.94 μg cm?2增加到2.31 μg cm?2，增加了146%）和Sakha 5（从1.81 μg cm?2增加到2.17 μg cm?2，增加了20%），而在Giza 716中烷烃含量下降（从1.94 μg cm?2降至1.73 μg cm?2）（图4b）。在200 mM NaCl条件下，所有三个品种的烷烃含量相对于150 mM NaCl条件都有所下降，其中Nubaria 1的烷烃含量仍然最高。在150 mM NaCl条件下，所有品种的蜡醇含量都增加，其中Sakha 5的增加幅度最大（从2.36 μg cm?2增加到4.12 μg cm?2，增加了75%）（图4c）。在200 mM NaCl条件下，Sakha 5和Giza 716的蜡醇含量相对于150 mM NaCl条件都有所下降，而Nubaria 1的烷烃含量保持不变。

皮层蜡的积累作为对盐胁迫的响应：在所有三个品种中，NaCl处理改变了皮层蜡的组成和总含量，且三种蜡成分的品种与处理水平的交互作用均显著（表1；图4）。在对照条件下，Sakha 5和Giza 716的总蜡含量（分别为6.46 μg cm?2和6.27 μg cm?2）高于Nubaria 1（2.37 μg cm?2）（图4a）。在150 mM NaCl条件下，所有三个品种的总蜡含量均增加。在200 mM NaCl条件下，Sakha 5的总蜡含量从150 mM时的峰值下降到2.91 μg cm?2，Giza 716下降到3.72 μg cm?2，而Nubaria 1的下降幅度较小（从150 mM时的4.74 μg cm?2降至2.91 μg cm?2）。因此，尽管在对照条件下Nubaria 1的总蜡含量最低，但在200 mM NaCl条件下它的总蜡含量仍然是最高的。

皮层蜡组分在三种蚕豆品种中的变化：（a）烷烃含量、（b）蜡醇含量和（c）总蜡含量各自通过氯仿浸提法从新鲜叶片组织中提取，并通过气相色谱-质谱法（GC-MS）进行量化。条形图表示平均值±标准误差（SE）。不同的字母表示存在显著差异（Tukey’s HSD，P < 0.05）。

皮层蜡的组成和总含量在不同盐胁迫水平下的相关性分析显示，三种盐浓度下性状关联的结构存在差异，随着NaCl浓度的增加，显著相关性的数量和类型也发生变化（图5）。在对照条件下，植株高度与根部干重（r = ?0.84）和根长（r = ?0.55）呈负相关（图5a）。根的形态特征——根长、根表面积和根体积之间存在强相关性（r = 0.78–0.96）。叶片氮和磷含量呈正相关（r = 0.92），并且两者都与根的形态特征呈正相关。在气体交换测量中，P?与气孔导度（g?）和蒸腾速率（Tr）呈正相关（r = 0.62和r = 0.74），与细胞内CO?浓度（Ci）呈负相关（r = ?0.90）。总蜡含量与根部生物量和营养性状呈正相关。在中等盐度（150 mM NaCl）条件下，一些相关性在幅度或方向上与对照条件有所不同（图5b）。高度与根系结构特征之间的负相关关系持续存在（r = ?0.62至?0.74），而高度与地上部重量之间的相关性接近零（r = ?0.06）。根的形态特征之间仍然强相关（r > 0.87）。P?与气孔导度（g?）之间的正相关性减弱（从对照条件下的0.54减弱到0.54），P?与细胞内CO?浓度（Ci）之间的负相关性显著减弱（从对照条件下的?0.90减弱到?0.12）。在这种处理水平下，总蜡含量与根长（r = 0.85）和营养性状（r = 0.73–0.91）呈正相关。在严重盐度（200 mM NaCl）条件下，根系结构特征之间的相关性比在任何其他处理条件下都更紧密（r > 0.97），并且与磷含量（r = 0.97–0.99）呈正相关（图5c）。叶片钾含量与根的形态特征呈负相关（r = ?0.75至?0.86）。气孔导度和蒸腾速率保持强耦合（r = 0.96），并且两者都与P?呈正相关（r = 0.77–0.90）。总蜡含量与植株高度（r = 0.76）和地上部干重（r = 0.88）呈正相关，并与根的形态特征呈弱相关或负相关。

通过对所有20个测量性状在（a）对照、（b）150 mM NaCl和（c）200 mM NaCl条件下的皮尔逊相关矩阵分析，可以看出在不同盐浓度下性状关联的结构有所不同（图5）。颜色等级表示相关系数（r）从?1（红色）到+1（蓝色）。显著的相关性（P < 0.05）用星号表示。

对整个标准化数据集进行的主成分分析产生了两个成分，这两个成分共同解释了总方差的70.7%（PC1：39.5%；PC2：31.2%）（图6）。品种样本在两个成分上有所分离，Sakha 5、Nubaria 1和Giza 716在生物图上占据不同的区域，并且这种分布在不同处理水平上保持一致。在PC1上，Sakha 5样本的表现最高，其根长、根表面积、根体积和根部干重的载荷值均为正值。努巴里亚1号的样本在PCA1得分上最为负面，这与花的数量和豆荚的数量呈正相关。吉萨716号的样本在PCA1上处于中间水平。在PCA2上，对照样本的得分最为正面，150 mM NaCl样本处于中间水平，而200 mM NaCl样本的得分最为负面。茎秆干重、总蜡质含量和植株高度在PCA2上有正相关负荷，而细胞间二氧化碳浓度则有强烈的负相关负荷。净光合作用和气孔导度在PCA2上也呈正相关负荷。在每个品种内部，95%置信度椭圆沿PCA2方向延伸，表明品种内部的变异主要与处理水平有关。三个品种的椭圆在所有处理水平上保持分离，品种组之间没有重叠。图6中的向量显示了在PCA1和PCA2上负荷最大的十个性状。

PCA分析展示了三个品种和三种NaCl处理条件下全部26个观测值的主成分图。数据在分析前已被标准化（均值=0，标准差=1）。点按品种着色，并根据处理方式不同进行形状区分；95%置信度椭圆由品种绘制。图中显示了对前两个主成分贡献最大的十个性状的负荷向量。

对十一条涉及离子转运、渗透调节、抗氧化防御、转录调控和蜡质生物合成的基因进行了定量RT-PCR分析，结果显示这些基因在不同NaCl处理条件下的诱导程度存在一致的、与品种相关的差异（图7a-k）。在所有基因类别中，萨卡5号的诱导倍数最高，吉萨716号处于中间水平，努巴里亚1号的诱导倍数最低。值得注意的是，这些倍数的变化是相对于每个品种自身的处理内对照基线而言的，因此并不反映绝对转录水平，后者可能在不同基因型间独立于应激诱导而有所不同。SOS1蛋白在所有品种中均随NaCl浓度的增加而逐步上调，在150–200 mM NaCl时萨卡5号的SOS1表达增加了约6–7倍，而努巴里亚1号的增幅不到2倍（图7a）。HKT1蛋白在150 mM NaCl时在萨卡5号中的诱导最高（4.5倍），但在200 mM NaCl时下降；努巴里亚1号在所有处理条件下的变化均不到2倍（图7b）。PIP2蛋白的表现则相反：在努巴里亚1号中表达相对稳定，在吉萨716号中逐渐下降，在萨卡5号中下降最为明显，在200 mM NaCl时降至约0.2倍（图7c）。P5CS和P5CR基因分别编码脯氨酸生物合成的关键步骤，在萨卡5号中上调最为显著（在150–200 mM NaCl时分别上调11–13倍和8–10倍），在吉萨716号中为6–7倍，在努巴里亚1号中几乎不受影响（所有处理条件下的增幅均小于1.5倍）（图7d-e）。CAT、SOD和APX蛋白在所有处理条件下的表达顺序与萨卡5号>吉萨716号>努巴里亚1号一致（图7f-h）。在萨卡5号中，CAT和APX在150 mM NaCl时的诱导倍数约为7–8倍，而在200 mM NaCl时APX仍维持在7倍。SOD在萨卡5号中的增幅也与此类似（7–8倍）。努巴里亚1号在所有处理条件下的这三个基因的变化均不到2倍。

DREB2基因是所有测试基因中诱导倍数最大的：在萨卡5号中在150 mM NaCl时诱导了12–13倍，降至200 mM NaCl时为10倍；在吉萨716号中为4–5倍；而在努巴里亚1号中始终低于1倍（图7i）。LEA基因的表现也类似：在萨卡5号中诱导了10–12倍，吉萨716号中为4–5倍，努巴里亚1号几乎保持基线水平（图7j）。萨卡5号中DREB2与渗透调节、抗氧化和LEA基因的共诱导表明它们对离子应激有协调的转录反应，尽管尚未研究DREB2是否在这种情境下作为这些共诱导基因的调节器。蜡质合成基因CER1在萨卡5号中随着NaCl浓度的增加而逐步上调（在150 mM NaCl时约4倍，在200 mM NaCl时上升至6倍），而在吉萨716号中为2.5–3倍；努巴里亚1号的诱导则较为轻微（图7k）。值得注意的是，尽管在200 mM NaCl条件下总蜡质含量下降，萨卡5号中的CER1诱导仍继续增加，这表明仅凭转录本量无法预测蜡质的积累。这种现象提示在解释该数据集的倍数变化数据时需谨慎：转录诱导并不能可靠地反映代谢输出，生化或转录后限制可能会使基因表达与测量性状脱钩。综合来看，表达数据表明萨卡5号在所有基因类别中表现出最广泛和最大幅度的转录反应，而努巴里亚1号在所有途径上的诱导最小。吉萨716号的表现则处于中间水平。这些转录反应模式的差异与上述品种在生长、离子状态和气体交换方面的差异一致，但从这些数据中无法确定特定转录变化与表型结果之间的因果关系。

图7显示了三个Vicia faba品种在对照、150 mM NaCl和200 mM NaCl条件下十一个盐响应基因的相对表达（相对于各自品种对照组的倍数变化）。基因按功能类别分组：(a)离子转运（SOS1、HKT1、PIP2）；(b)渗透调节（P5CS、P5CR）；(c)抗氧化防御（CAT、SOD、APX）；(d)转录调控和后期应激反应（DREB2、LEA）；(e)蜡质合成（CER1）。条形图代表三次生物学重复实验的平均值±标准误，每个重复实验进行了三次技术测量。参考基因：ACT（肌动蛋白）和UBQ（泛素）。每个面板中的不同字母表示显著差异（Tukey’s HSD，P<0.05）。

讨论
这里研究的三个埃及蚕豆品种不仅在NaCl胁迫下的生长抑制程度不同，其生理和转录反应模式也存在差异，这从根长、叶片K?、气体交换参数和蜡质成分的品种-处理交互作用中可以明显看出。努巴里亚1号在严重盐度条件下的茎生物量、叶片K?、净光合作用和豆荚形成减少最少，并且在所有11个基因上的转录诱导也最低。萨卡5号在所有基因类别中的转录诱导最大，且在胁迫下的根伸长也最大，但在200 mM NaCl条件下发生了完全的豆荚失败。吉萨716号在这两方面均处于中间水平，其在对照条件下的净光合速率最高。这些观察结果与Munns和Tester26的理论框架大体一致，该理论区分了在离子排斥、组织耐受性和渗透调节方面存在差异的基因型，尽管需要进一步的研究来确认每个品种的具体机制。

努巴里亚1号在所有NaCl处理条件下都能将叶片K?浓度维持在13.3–13.6 g kg?1，而萨卡5号在200 mM NaCl时下降至11.5 g kg?1，吉萨716号则表现出适度的下降。这种品种间在胁迫条件下叶片K?保持能力的差异可能与根-土壤界面的离子选择性差异有关，可能涉及HAK/KT家族转运蛋白或翻译后调控的电压门控通道。然而，由于本研究未测量叶片和根部的Na?和Cl?浓度，因此无法确定这些K?差异是由于Na?排异的差异、Na?竞争下的K?保留差异，还是两者兼有。努巴里亚1号中较低的HKT1和SOS1诱导与该品种相对较小的离子扰动一致，但 without离子积累数据就无法从机制上解释这一点。因此，在得出关于努巴里亚1号K?保留的离子转运机制的结论之前，需要直接测量不同品种和盐度条件下的组织离子组成。

萨卡5号的根系从对照条件下的3,577厘米在200 mM NaCl条件下延长至8,664厘米（增加了142%），这是本研究最显著的形态学发现，使该品种与努巴里亚1号和吉萨716号区分开来，后两者根长增加较少或没有增加。其他物种中也报告过盐刺激下的根系延长，并与生长根细胞中生长素重新分布有关，这可能有助于渗透调节从而支持细胞伸长。萨卡5号在相同条件下P5CS和P5CR的共诱导表明脯氨酸可用性增加，这可能有助于渗透调节并支持细胞伸长。目前的数据无法确定这种根系延长是适应性反应以改善资源获取，还是应激驱动的形态变化，因为未评估根部的离子含量和空间Na?分布，且盆栽条件限制了土壤体积和离子梯度。

萨卡5号中SOS1的强烈诱导（在200 mM NaCl时约为7倍）与其对Na?排出的依赖增加一致，这是一个能量需求高的过程，需要持续的H?-ATP酶活性。尽管如此，萨卡5号的叶片K?下降幅度仍大于努巴里亚1号，表明在严重胁迫下SOS1的转录激活不足以维持叶片层面的离子平衡。这可能是由于SOS通路效率的限制、通过其他途径的持续Na?吸收，或在吸收阶段K?的竞争性置换所致。所有品种中净光合作用（P?）的下降伴随着细胞间二氧化碳浓度（Ci）的上升，从对照条件下的327 μmol mol?1升至200 mM NaCl时的378–413 μmol mol?1，同时气孔导度也下降。P?的下降和Ci的上升表明碳固定的减少并非由CO?底物限制引起，而是由于非气孔因素对光合能力的限制，可能与Rubisco活性受损或RuBP再生减少有关。努巴里亚1号的P?下降幅度（55%）相对于其气孔导度下降（67%）较小，而萨卡5号和吉萨716号的光合损失则更为显著。这些差异在多大程度上反映叶绿体离子平衡、Rubisco稳定性或其他叶肉层因素的差异仍有待确定。

所有三个品种在150 mM NaCl时达到最大的表皮蜡质积累，然后在200 mM NaCl时下降；努巴里亚1号的下降幅度较小，并在严重胁迫下保持相对较高的蜡质含量。在萨卡5号中，尽管总蜡质含量下降，CER1的转录水平在200 mM NaCl时仍继续增加，表明在最高离子负荷下转录后或代谢限制限制了蜡质生物合成。一个可能的限制因素是从质体乙酰-CoA池中竞争丙二酰-CoA，这在蜡质延长和中央碳代谢之间共享，当光合作用严重减少时可能会成为限制因素。萨卡5号中蜡醇成分的盐诱导增加最为显著，这与脂肪酰还原酶活性的诱导一致，醇与烷烃比例的变化可能独立于总蜡质含量影响表皮的渗透性。

萨卡5号在200 mM NaCl条件下完全没有形成豆荚，而努巴里亚1号在同一处理条件下每株形成1.78个豆荚，这是最具农学意义的发现之一。多种非唯一因素可能对此有贡献：在200 mM NaCl条件下P?减少60%会显著减少可利用的碳；Na?和Cl?在地上组织（包括花和豆荚组织）中的积累可能影响受精或早期胚胎发育；已知离子胁迫会干扰调节生殖发育的ABA和生长素信号通路。目前的数据无法区分这些可能性，需要针对生殖组织中的离子含量、碳分配和激素状态进行专门研究才能确定主要原因。

PCA分析表明，在所有盐度处理条件下，品种的椭圆在PCA1上保持分离，表明决定品种特征的性状（主要是萨卡5号的根结构和努巴里亚1号的生殖产出）并未因胁迫而融合成共同表型。椭圆沿PCA2随NaCl浓度增加而延长，反映了品种内部因胁迫严重程度而产生的变异。品种间分离的稳定性支持在盐条件下使用根结构和叶片K?作为表型特征，因为它们反映了基因型差异而不仅仅是胁迫引起的可塑性。

本研究的一个关键限制是缺乏叶片和根部Na?和Cl?浓度的数据。审稿人和编辑正确指出了这一主要缺陷。直接量化所有品种-处理组合中叶片和根部组织中Na?和Cl?的积累对于评估此处报告的品种差异是反映了根部层面的Na?排除差异、叶片液泡中的差异性分配，还是两者的结合至关重要。这些测量结果还可以用来计算K?/Na?比值，并有助于对不同品种中观察到的SOS1、HKT1和NHX类转运蛋白的差异性诱导进行机制解释。我们认识到，在缺乏离子含量数据的情况下，本文关于离子稳态的解释必然是基于推断的，应被视为需要在后续实验中通过ICP-OES分析根部和叶片部分中的Na?、K?和Cl?来进行验证的工作假设。没有这些测量数据，关于离子排除、K?/Na?区分以及应力作用下的离子 phase 的解释仍然具有间接性，应作为未来研究的假设。此外，本文报告的倍数变化表达数据是基于品种内部对照进行的诱导比较，并未涵盖品种间基础转录本丰度的差异，而这种差异可能是显著的。为了验证共表达模式所提示的潜在调控关联（特别是在Sakha 5中DREB2与渗透调节基因和抗氧化基因的共诱导），需要进行启动子结合测定、时间进程实验或功能丧失研究。

**结论**
本研究通过一系列形态学、生理学、生化和基因表达测量方法，比较了三种埃及大豆品种在不同NaCl浓度下的表现。结果表明，这些品种在应对离子胁迫的响应模式上存在差异，不仅仅体现在生长抑制的程度上。Nubaria 1在严重盐度（200 mM NaCl）条件下能够最好地维持叶片中的K?水平、净光合作用和豆荚形成，同时所有基因类别的转录诱导水平最低。Sakha 5显示出最大的转录响应、最明显的胁迫诱导的根系伸长以及脯氨酸生物合成、抗氧化和离子转运基因的最强诱导，但在200 mM NaCl条件下其繁殖输出也显著减少，甚至导致豆荚完全失效。Giza 716在大多数指标上表现介于两者之间，并且在对照条件下具有最高的净光合速率。在所有品种中，盐度作用下净光合作用的同时下降和细胞间CO?浓度的升高表明，非气孔限制是碳固定的主要限制因素，而不仅仅是气孔关闭。所有品种的表皮蜡积累在中等盐度水平达到峰值，但在严重胁迫下尽管CER1基因继续被诱导仍会下降，这表明在最高NaCl浓度下代谢或转录后机制限制了蜡的生物合成。主成分分析保持了不同品种在各盐度处理下的区分能力，表明根系结构和繁殖投入是离子胁迫下的稳定遗传性状，因此是可行的表型分析目标。