生诃子（Chebulae Fructus Immaturus）与经杏仁油处理后的产品之间的肝毒性比较

《Pharmacological Research - Modern Chinese Medicine》：Comparison of the Hepatotoxicities of Raw Chebulae Fructus Immaturus and its Almond Oil-Processed Product

　　魏晨 | Gvlzapar Tohniyaz | 秦马 | Israp Abai
新疆军区骨骼健康与中医研究重点实验室，中国 835000

**摘要**
almonds oil processing（杏仁油加工）是一种传统技术，用于降低中医草药Chebulae Fructus Immaturus（CFI，Xiqinguo）的毒性并增强其功效。这种草药具有清热、缓解喉咙痛和止泻的作用。然而，加工过程中引起的化学和毒理学变化以及其解毒和功效增强的机制仍不清楚。因此，本研究旨在评估杏仁油加工前后CFI的毒性变化及其可能的作用机制。

**方法**
首先，按照传统方法，用0.3倍量的杏仁油在160°C下炒制10批CFI，时间为20分钟。通过正负离子模式的LC-MS分析来分析化学变化，并建立了HPLC方法来定量最显著变化的成分。随后，对小鼠进行了重复剂量口服毒性测试，剂量为132 mg/kg，并进行了生理、血液学、生化及组织学分析，同时进行了多变量统计分析。

**结果与讨论**
在负离子模式下共鉴定出37种成分，主要为有机酸。定量HPLC分析显示，加工后的CFI（ACFI）中的没食子酸含量升高，而 Punicalagins 含量降低。毒理学研究表明，CFI会导致体重下降、中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞数量减少，并引起轻度肝细胞损伤，同时 Alanine aminotransferase（ALT）和 Aspartate aminotransferase（AST）水平升高。组织病理学检查显示肝脏损伤，表现为嗜酸性细胞质、细胞核浓缩以及Collagen I、CD3和CD8的表达增加，提示轻度肝细胞坏死。相反，ACFI减少了氧化应激、炎症和细胞凋亡，这一点通过Western blot和计算机模拟分析得到证实。这些发现表明，杏仁油加工可以减轻CFI的肝毒性，可能是通过调节CYP2E1相关途径实现的。

**1. 引言**
在中医中，草药通常通过浸泡、包埋和炒制等方法进行加工，以提高其治疗效果并降低毒性。其中，杏仁油炒制被认为是一种非常有效的方法，尤其可以减轻某些草药的肝毒性。先前的研究表明，每天摄入1 g/kg的杏仁油持续15周可以减轻血脂异常大鼠的脂质氧化并显著降低肝损伤[1]。另一项研究表明，与对照组大鼠相比，经过杏仁油处理（3或6 mL/kg）21天后，在CCl4诱导下，杏仁油处理组的大鼠ALT和AST水平显著降低，肝损伤减少，血清高密度脂蛋白（HDL）水平升高[2]。此外，临床研究还表明，杏仁油补充剂对心血管代谢紊乱患者的体重、血脂谱、炎症和抗氧化性能有益[3]。然而，草药加工过程中会发生复杂的化学变化，可能会影响其疗效和安全性。例如，Chebulae Fructus Immaturus（CFI）主要用于治疗喉咙痛、咽炎、扁桃体炎和痢疾[4]，而杏仁油加工后的CFI（ACFI）则常用于治疗中枢神经系统疾病（CNS），如抑郁症[5]、记忆力减退[6]和阿尔茨海默病（AD）[7]。因此，有必要评估加工后的草药变化，以确保其安全性。

Terminalia chebula Retz. 是属于Combretaceae科的亚洲草药，在多民族中医体系中都有应用，包括维吾尔族和藏族的医疗实践中。Terminalia chebula的成熟果实（Fructus Chebulae）被认为可以调节肠道和神经功能。其成熟果实（Fructus Chebulae，Hezi）和未成熟果实（CFI，Xiqinguo，Chebulae Fructus Immaturus）在亚洲民间医学中有着不同的用途。这些传统中的原始草药含有单宁等活性成分，具有收敛、止血、抗菌等作用[8]。然而，CFI和CF中的可水解单宁可能会增加肝脏损伤的风险[9]，长期使用时常记录到临床肝毒性[10]。例如，1985年的研究表明CF具有显著的肝肾毒性[11]。后续研究发现，给大鼠腹腔注射CF或CF乙酸酯提取物后，血清尿素、葡萄糖和AST水平显著升高，提示肝脏和肾脏功能受到轻微干扰[9]。最近的一项毒性研究表明，3’-O-methyl-4-O-(n’’-O-galloyl-β-D-xylopyranosyl) ellagic acid（n=2, 3或4）和4-O-(3’’,4’’-O-digalloyl-α-L-rhamnosyl) ellagic acid是Chebulae Fructus的主要肝毒性成分，它们可能通过抑制PPAR信号通路和影响脂质代谢而发挥毒性作用[12]。根据《国家草药大全》（维吾尔语版，1999年），蜂蜜或杏仁油可以减轻CFI的毒性，杏仁油加工后的CFI可用于治疗焦虑和抑郁症。一些研究支持这些发现，因为T. chebula提取物中含有Ellagic acid，对H2O2诱导和Aβ25-35对PC12细胞的毒性具有保护作用，因此可能是治疗神经退行性疾病的潜在候选物[13]。此外，CF的甲醇提取物因含有7-methyl gallic acid而被证明能抑制AChE和BChE，并具有抗氧化和清除活性氧的作用[14]。这种多方面的神经保护效果可能对AD及相关神经退行性疾病的治疗有益。

然而，迄今为止，只有少数研究关注CFI和ACFI之间的肝毒性差异。鉴于传统草药的广泛应用，基本的毒理学研究对于为其临床应用提供科学数据至关重要。基于上述研究，在初步实验中我们发现CFI会损伤肝脏，但对其肝毒性机制知之甚少。本研究利用Western blotting（WB）和免疫组化（IHC）染色技术，研究了CFI和ACFI处理引起的蛋白质表达变化，最终确定了与CFI毒性调节机制相关的潜在信号通路，为CFI的毒性提供了新的见解。

**2. 材料与方法**
从中国三个主要生产区（云南省、广西壮族自治区和广东省）收集了20批CFI。按照以下方法制备了10批ACFI：用0.3倍量的杏仁油在140°C～160°C下炒制20分钟。所有样本空气干燥48小时，碾碎后过筛（80目）得到均匀粉末。样本的详细信息（包括来源和批号）见表S1。抗Bax、Bcl、Caspase 3、Caspase 9、iNOS、P65和p-P65的抗体以及抗caspase-3的单克隆抗体和抗caspase-9的多克隆抗体从Servicebio Biotechnology Co., Ltd.（中国武汉）购买。Punicalagin α、Punicalagin β、没食子酸、chebulic acid、chebulagic acid和ellagic acid的标准品从国家食品药品监督管理局购买。

**2.2. 色谱分离**
将粉末样品（200 mg）用10 mL 50%甲醇在超声浴（180 W，53 kHz）中提取50分钟。提取液在12,200 g下离心10分钟，通过0.22 μm注射器过滤器过滤后，使用UPLC进行分析。色谱分离采用ACQUITY UPLC HSS T3 C18柱（2.1 mm × 100 mm，1.8 μm；Waters，美国），并通过UPLC系统（Thermo Fisher，美国）进行。流动相由洗脱液A（0.1% (v/v) 苦酸水溶液）和洗脱液B（乙腈）组成，流速为0.3 mL/min。优化的梯度洗脱程序见表S2。自动进样器和UPLC柱室的温度为35°C，进样量为10 μL。

**2.3. 质谱（MS）**
使用Q Exactive Plus Orbitrap质谱仪（Thermo Fisher，美国）进行UPLC–Q–MS分析。扫描范围为100至1200 m/z（全MS–ddMS2模式）。正离子模式（MS1）和负离子模式（MS2）的条件如下：毛细管电压3.2 kV；源温度320°C；辅助气体加热器温度350°C；辅助气体流量40 L/h；辅助气体流量15 L/h；分辨率分别为70000（MS1）和17500（MS2）；自动增益控制（AGC）目标1e6；TopN为5。在MSe模式下，数据采集通过在单次LC分析过程中快速切换低碰撞能量（CE）和高碰撞能量（CE）来实现。低能量功能设置为6 V，高能量功能的CE设置为20–60 eV。

**2.4. 高效液相色谱（HPLC）**
建立并验证了HPLC-UV方法，用于绝对定量加工后变化最显著的成分。将每个样品研磨成粉末，用50 mL 35%乙腈在超声条件下（53 kHz，40 kW）提取30分钟，上清液通过0.22 μm膜过滤器过滤。HPLC条件如下：柱子为Agilent 5TC-C18（250 mm × 4.6 mm i.d.，5 μm；Agilent Technologies，美国加州圣克拉拉）；流动相为0.1% (v/v) 磷酸（A）和乙腈（B）；流速为1.0 mL/min；柱温为35°C；进样量为5 μL；检测波长为270 nm。梯度洗脱程序如下：5% A（0分钟），20% A（25分钟），35% A（55分钟），然后返回5% A。

**2.5. 重复剂量口服毒性评估**
新疆医科大学动物中心提供了30只Balb/c小鼠（7周龄，体重18±2 g；证书编号SCXK (XJ) 2019-0002）。小鼠在恒定温度和湿度的12小时光照/黑暗周期房间中饲养，可自由摄取标准实验室食物和水。动物实验遵循《实验动物护理和使用指南》进行。饲养和环境条件符合新疆军区骨骼健康与中医研究重点实验室的动物伦理委员会规定（批准编号：20230208XJ）。实验中，Balb/c小鼠随机分为3组（每组10只）：对照组（NC）、CFI组和ACFI组。CFI组和ACFI组每天接受132 mg/kg的剂量，持续14天，对照组接受相同体积的生理盐水。132 mg/kg的剂量是根据初步的最大耐受剂量（MTD）研究确定的。最大每日腹腔给药量为1 mL。逐步向1 mL生理盐水中加入CFI或ACFI粉末，直至达到最大可悬浮浓度。最终剂量132 mg/kg代表在这些条件下的最高安全给药量。在14天的观察期间，任何剂量组（包括132 mg/kg组）均未观察到死亡、显著体重下降或明显的毒性症状。主要器官的组织病理学检查未发现与处理相关的异常，血液学参数也在正常范围内。125.4 mg/kg和132 mg/kg组的小肠出现色素沉着，这可能是由于CFI中含有高浓度单宁所致，被认为是适应性变化而非毒性作用，因为没有伴随组织病理学改变。这些结果表明132 mg/kg是小鼠的最大耐受剂量，与富含单宁的草药制剂的安全性报告一致。MTD研究的详细结果见表1。整个研究期间每天记录小鼠的体重。第2周末处死小鼠，取其肝脏进行检查；同时将血液和肝脏组织储存在-80°C下，用于酶联免疫吸附测定（ELISA）、苏木精-伊红（HE）染色、IHC染色和Western blot。***结果：未成熟 Terminalia chebula（CFI）的最大耐受剂量测试 ***
**组** | **测试药物** | **剂量（mg/Kg）** | **体积（mL）** | **MEC** | **死亡率（%）** | **观察结果**
| -------- | -------------- | -------------- | ------------------ | ------------------------ | ------------------ | ---------- | ------------ | ------------ | ---------------------- | ---------- | --------- | ------------ | ---------------------------- | ---------- | ------------------------ | ---------------------- | ------------ | -------------------------- | ---------------------- | ------------------------ | ------------ | ---------------------------- | ---------- | ------------------------ | ------------------------ | ------------ | ---------------------------- | ------------------------ | ------------ | ---------------------------- | ---------- | ------------------------ | ------------ | ---------------------------- | ---------- | ------------------------ | ------------ | ---------------------------- | ---------- | ------------------------ | ------------
| 1 | CFI | 1.9 | 0.8 | 100 | 正常血液学 | 2 | CFI | 20.9 | 0.8 | 1100 | 正常血液学 | 3 | CFI | 62.7 | 0.8 | 33100 | 正常血液学 | 4 | CFI | 125.4 | 0.8 | 66100 | 肠道色素沉着；血液学正常 | 5 | CFI | 132 | 0.8 | 69.5 | 100 | 肠道色素沉着；血液学正常 | 6 | 生理盐水/0.8/100 | 正常 |
**注：** 在1.9–132 mg/kg剂量组中，没有动物死亡。132 mg/kg剂量对应于可以给予小鼠的未成熟Terminalia chebula果（CFI, Xiqinguo）的最大日剂量。

**2.6. ELISA**
血清是通过以2500 rpm离心凝固的血液样本10分钟分离得到的。根据制造商的协议，使用商用ELISA试剂盒（Solarbio, 中国）测量肝功能参数AST和ALT的血清水平。

**2.7. Western Blot分析**
从30~50 μg的动物组织中提取蛋白质，使用添加了1 mmol/L蛋白酶-磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液。每种蛋白质样品取20微克，直接通过10% SDS-PAGE分离，然后将蛋白质转移到PVDF膜上（Millipore, Billerica, Germany）。膜用5%（w/v）脱脂牛奶封闭2小时，然后与一级抗体（β-Actin（1:1000稀释）、Bax（1:2000稀释）、Bcl-2（1:1000稀释）、Caspase 3（1:1000稀释）、iNos（1:1000稀释）、P65（1:2000稀释）和p-P65（1:2000稀释）在4°C下孵育过夜并摇晃。与抗小鼠和抗兔IgG过氧化物酶Secondary抗体孵育1小时后，使用增强化学发光（ECL）进行蛋白质检测，并使用ImageJ软件（1.8.0）进行定量。

**2.8. 组织病理学和免疫组化**
肝脏样本在4%甲醛中固定24小时，然后脱水、包埋在石蜡中，切成5 μm厚的切片，并用HE染色。此外，使用Super Sensitive Polymer-HRP IHC检测系统（Sever Biotechnology, 中国）根据制造商的协议检测肝脏组织切片中的Collagen I、CD3和CD8表达。组织化学评分（H-评分）由Aipathwell?系统（Yin et al. 2023; Zhao et al. 2022）解释，并按以下公式计算：H-评分（∑(pi × i)）=（低强度细胞的百分比×1）+（中等强度细胞的百分比×2）+（高强度细胞的百分比×3），其中pi是阳性细胞的百分比，i（阳性细胞等级）如下确定：阴性（无着色），0分；弱阳性/浅黄色，1分；中等阳性/棕色-黄色，2分；强阳性/棕褐色，3分。

**2.9. 统计分析**
数据以平均值±标准误差（SEM）表示，并使用Excel进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），随后进行Tukey事后检验以评估统计显著性。统计分析使用PASQ Statistics（SPSS 19.0）进行，P < 0.05被认为具有统计显著性。

**3. 结果**

**3.1. 超高效液相色谱-四极杆串联质谱（UPLC-Q-MS/MS）分析及CFI和ACFI化学成分的鉴定**
使用优化的色谱和MS条件，在负离子模式下，通过将获得的光谱与已建立的MzCloud在线数据库和中国中药天然产物的自建mzVault数据库进行匹配，鉴定了CFI和ACFI的37种成分或初步表征了这些成分。CFI和ACFI在负离子模式下的典型总离子色谱图（TICs）显示在图1中。保留时间、分子式、离子类型、检测质量、质量误差以及与鉴定峰相关的碎片离子在表2中总结。在CFI中鉴定的成分主要分为几种类型的有机酸，包括酚酸、酚酯、三萜酸和黄酮苷。

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**图1.**（A）CFI和（B）ACFI在ESI+模式下的典型TICs。
**表2.** 通过UPLC/Q-TOF-MS/MS鉴定化合物的化学结构。

| 化合物名称 | 分子式 | 检测质量（m/z） | 保留时间，TR（min） | 质量误差（ppm） | 相对含量（CFI，%） | 相对含量（ACFI，%） |
| ---------- | ---------- | ------------ | ------------ | ------------ | ---------------- | ------------------- |
| Ellagic acid | C14 H6 O8 | 302.0 | 0.6 | 21.37 | -0.78 | 30.88 | 40.93 |
| Chebulinic acid | C41 H32 O2 | 795 | 6.11 | 232 | 1.59 | -0.83 | 11.96 | 14.45 |
| Quinic acid | C7 H12 O6 | 192.0 | 321.39 | -0.49 | 11.35 | 12.06 |
| Shikimic acid | C7 H10 O5 | 174.0 | 262.12 | -1.07 | 9.64 | 6.73 |
| Gallic acid | C7 H6 O5 | 170.0 | 214 | 6.13 | -0.64 | 8.81 | 10.42 |
| Pyrogallol | C6 H6 O3 | 126.0 | 157.29 | -1.24 | 3.87 | 8.05 |
| Glabrolide | C30 H44 O4 | 68.32 | 382 | 29.23 | -0.32 | 3.43 | 5.12 |
| Geraniin | C41 H28 O2 | 795 | 2.08 | 121 | 9.59 | -0.54 | 2.59 |
| 5-Hydroxymethylfurfural | C6 H6 O3 | 126.0 | 171 | 2.77 | 0.36 | 2.10 | 6.72 |
| 5-alpha-cholestanyl 3-O-(alpha-l-fucopyranosyl)-beta-d-galactopyranoside | C39H68 O10 | 696.4 | 842 | 7.23 | -1.07 | 1.71 | 10.04 |
| Punicalin | C34 H22 O2 | 278 | 2.05 | 961 | 8.29 | -0.81 | 1.64 |
| Corilagin | C27 H22 O18 | 634.08 | 041 | 18.57 | -0.33 | 1.60 | 2.30 |
| 2-Pyrrolidinecarboxylic acid | C5 H9 N O2 | 115.06 | 341.42 | 0.37 | 1.56 | 0.15 |
| Quillaic acid | C30 H46 O5 | 486.33 | 432 | 3.68 | -0.45 | 1.54 | 0.31 |
| Protocatechualdehyde | C7 H6 O3 | 138.03 | 172.13 | -0.11 | 1.30 | 0.33 |
| Trigonelline HCl | C7 H7 N O2 | 137.04 | 771.43 | 0.48 | 1.04 | 1.07 |
| L-Leucine | C6 H13 N O2 | 131.09 | 474.13 | 0.64 | 0.85 | 0.15 |
| p-Coumaric acid | C9 H8 O3 | 164.04 | 744.96 | 0.20 | 0.76 | 0.25 |
| Protocatechuic acid | C7 H6 O4 | 154.02 | 641 | 5.66 | -0.08 | 0.71 |
| Brevifolincarboxylic acid | C13 H8 O8 | 292.02 | 193.18 | -0.24 | 0.40 | 0.18 |
| 1,2,3,4,6-Pentagalloylglucose | C41 H32 O2 | 694 | 0.11 | 812 | 2.85 | -0.04 | 0.36 |
| Rosamultin | C36 H58 O10 | 650.40 | 292 | 7.23 | -0.18 | 0.26 | 0.30 |
| 3,3’,4’-tri-O-methylellagic acid | C16 H10 O5 | 278.22 | 454 | 5.56 | -0.29 | 0.21 | 0.20 |
| Ethyl gallate | C9 H10 O5 | 198.05 | 272 | 0.74 | -0.90 | 0.21 | 0.51 |
| Xanthotoxol | C11 H6 O4 | 202.02 | 663.17 | -0.05 | 0.17 | 0.16 |
| Homoorientin | C21 H20 O11 | 448.10 | 052 | 20.33 | -0.18 | 0.16 | 0.15 |
| Medicagenic acid | C30 H46 O6 | 502.32 | 933 | 1.55 | -0.35 | 0.14 | 0.02 |
| Isorhamnetin-3-O-nehesperidine | C28 H32 O16 | 624.16 | 912 | 22.01 | 0.07 | 0.12 | 0.16 |
| Isovitexin | C21 H20 O10 | 432.10 | 562 | 1.26 | -0.18 | 0.12 | 0.10 |
| Asiatic acid | C30 H48 O5 | 488.35 | 012 | 772.23 | -0.19 | 0.11 | 1.49 |
| Uridine | C9 H12 N2 O6 | 244.06 | 945.14 | -0.54 | 0.07 | 0.06 |
| Isorhamnetin | C16 H12 O7 | 316.05 | 832.20 | -0.09 | 0.06 | 0.08 |
| Maslinic acid | C30 H48 O4 | 472.35 | 564 | 0.15 | 0.67 | 0.06 |
| 15-methoxy-2′,4′-dimethyl-[1,1′-biphenyl]-2-carboxylic acid | C16 H16 O3 | 256.11 | 142 | 9.23 | -0.83 | 0.04 | 0.06 |
| Rutin | C27 H30 O16 | 610.15 | 342 | 1.09 | 0.04 | 0.04 |
| 4-Methyl-6,7-dihydroxycoumarin | C10 H8 O4 | 192.04 | 221 | 6.65 | -0.52 | 0.04 | 0.00 |
| Ursolic acid | C30 H48 O3 | 456.36 | 034 | 6.26 | -0.02 | 0.04 | 0.05 |
| Adenine | C5 H5 N5 | 135.05 | 432.59 | -1.07 | 0.03 | 0.00 |
| Germacrone | C15 H22 O2 | 18.16 | 712 | 29.22 | -0.05 | 0.02 | 0.00 |
| Acetyl-11-keto-β-boswellic acid | C32 H48 O5 | 512 | 350 | 836.39 | 1.13 | 0.01 | 0.00 |
| Indigo | C16 H10 N2 O2 | 226 | 262.07 | 392 | 5.34 | -1.09 | 0.01 | 0.00 |
| 3,3’-o-dimethylellagic acid | C16 H10 O8 | 330.25 | 183 | 5.42 | -7.78 | 0.01 | 0.00 |
| Polygalic acid | C29 H44 O6 | 976.62 | 992 | 9.95 | -0.07 | 0.00 | 0.00 |

**表3.** 在急性毒性研究中，小鼠口服132 mg/kg·d CFI和ACFI后的肝脏病变评分。☆☆ P < 0.01 vs. 对照组；## P < 0.01 vs. CFI组。
| 病变 | 阳性面积，% | 平均密度 | 面积密度 | H-Score | Collagen I-对照 | 10.39 | 0.09 ± 0.00 | 0.00 | 9 | 14.55 ± 1.07 | 1 | 4.55 | 11 |
| | ------------------ | ------------ | ---------------- | ------------ | ------------------ | ------------ | ------------------ | ---------------- | ---------------- | ------------------ | ------------------ | ------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ | ------------------ |
| | Collagen I-ACFI | 34.99 | 0.08 ± 0.01 | 0.02 | 7 | 352.90 ± 3.38 | ☆☆ | 3 | 11 | 352.90 ± 3.38 | ☆☆ |
| | Collagen I-ACFI | 11.30 | 0.09 ± 0.01 | 0.01 | 3 | 153.2 ± 1.57 | ## | 1 | 153.2 ± 1.57 | ## |
| | CD3-对照 | 5.73 | 0.21 ± 0.03 | 0.01 | 1 | 使用多种正交终点方法——包括组织病理学、用于检测免疫细胞浸润的免疫组化、血清生物化学以及蛋白质表达分析——增强了我们研究结果的内部有效性。5. 讨论 制药过程是中药（TCM）制备中的关键步骤，其目的既在于提升治疗效果，也在于降低临床风险。关于草药加工的最早文献可追溯至5世纪，具体内容记录在 Lei 大师的著作《Leigong Paozhi Lun》（LGPZL，公元588年）中。该著作详细描述了通过经典方法（如翻炒、炖煮、煅烧和浸泡）制备的320种草药[15]。例如，翻炒过程中将清洗并切分的草药与辅料一起放入锅中，在达到特定条件之前不断搅拌。其中一个例子是使用羊油加工淫羊藿，据报道这可以显著增强该草药治疗阳虚综合征（KYDS）的效果[16]。油煎淫羊藿传统上用于治疗阳痿和不孕症，这一点也在《Leigong Paozhi Lun》中有提及[16]。另一个例子是万年青的加工，这种草药在众多知名配方中广泛使用，油炸这一步骤可以减少其引发过敏反应的可能性[17]。加工的主要目标是转化有毒的草药成分，因为这些成分通常具有独特的物理或化学性质。因此，评估加工后草药的变化对于确保其安全性和治疗效果至关重要。

CFI（Chebula fruit）是一种多功能植物，具有广泛的药用特性，包括其对抑郁症、认知衰退和过早发白的疗效。在古代中医文献中，CFI 与诃子（Chebula fruit，CF）和印度醋栗（Phyllanthus emblica，amla）一起被称为“三大圣果”，并被描述为无毒的。然而，最近的研究表明 CFI 存在潜在毒性。例如，有研究表明，接受 CFI 提取物处理的大鼠表现出明显的肝脏和中枢静脉异常[Omran 等，2020][18,19]。在一项为期28天的重复剂量口服毒性试验中，接受1克/千克 CFI 处理的 Wistar 白化大鼠出现了轻微的肝脏损伤，推测可水解单宁是毒性成分[9]。我们的研究结果与这些报告一致，因为连续7天每天给予野生 CFI 粉（132毫克/千克）会导致 AST 和 ALT 水平显著升高，这是肝脏损伤的标志。通过 HE 和 IHC 染色对肝组织进行的组织学检查证实了这些发现。加工可能会改变 CFI 的化学组成、药理活性和安全性特征，从而影响其临床应用。CFI 的主要活性成分是单宁，包括诃子酸、鞣花酸、柯拉林酸、奎拉酸和没食子酸[20]。分子对接研究表明，三取代或四取代的鞣花酸是 CFI 中的主要肝毒性成分[12]。然而，相关证据存在争议。虽然有研究指出鞣花酸具有抗纤维化和保护肝脏的作用[19,21]，但具体的有毒单宁化合物尚未明确。与之前的研究不同，我们的 LC-MS 和重复剂量口服毒性试验结果表明，鞣花酸环开裂（C14H10O10）和没食子酸脱氧（C6H14O）是主要的毒性途径。某些苯甲酸衍生物（例如 C14H10O10）以及没食子酸及其衍生物（例如表没食子儿茶素没食子酸酯，EGCG，结构类似于 C6H14O）已被证实会干扰脂质代谢，导致肝脏损伤[22,23]。值得注意的是，在这项研究中，经过加工的 CFI （CFA 制剂）显示出不同的毒性成分，这为研究加工和兼容性对中药疗效和毒性的影响提供了新的模型，这种模型基于传统的临床实践。

加工引起的药理变化也可能解释草药毒性的差异，为 CFI 加工和兼容性研究提供了依据。包括 CFI 在内的中药引起的肝毒性已被证明能激活细胞中的多种生存信号通路，如涉及 Nrf2、NFκB、PPAR、ROS、iNOS 和 Bcl 的通路，最终导致肝细胞凋亡。Ai 等人（2023）的转录组分析显示，CF 的毒性与脂质代谢相关通路密切相关，尤其是抑制 PPAR 信号通路[12]。药代动力学研究表明，CF 主要抑制 CYP450 酶 CYP2E1 和 CYP2C19 的活性，而对 CYP1A2、CYP2C9、CYP3A4 或 CYP2D6 没有显著影响。在同时使用由 CYP2C19 和 CYP2E1 代谢的药物时需要谨慎，因为可能发生草药-药物相互作用[24]。CYP2E1 会产生活性代谢物，导致氧化应激、线粒体功能障碍和细胞死亡。根据《国际免疫药理学》的一项研究，低剂量的白桦脂酸（BA）或白桦醇（BT）对 CYP2E1 活性或 SREBP-1c 表达的影响很小。然而，这些化合物通过调节 TLR4 和 STAT3/iNOS 信号通路，降低了乙醇刺激的肝星形细胞（HSCs）中 α-SMA 和胶原蛋白-I 的表达[25]。许多研究将肝脏损伤与细胞凋亡、再生和一氧化氮合酶的表达联系起来。例如，过量服用对乙酰氨基酚会导致肝细胞 iNOS 和 CYP2E1 mRNA 表达升高，从而增加一氧化氮合成并引发氧化应激性的肝脏损伤[26]。肝脏中的一氧化氮过量与炎症反应和内毒素性休克有关。此外，由各种肝毒性因素（如病毒感染、酒精滥用或外源物质中毒）引发的细胞凋亡和调控性坏死涉及 BCL-2 蛋白家族的激活，该家族调控线粒体外膜通透性（MOMP）[27]。先前的研究强烈支持 CYP2E1/iNOS 信号通路在肝脏损伤机制中的作用。这些计算机模拟结果需要进一步的实验验证。

在我们的研究中，接受过量 CFI 处理的小鼠肝组织表现出明显的组织学异常，这与之前关于 CF 毒性的报告一致。这些异常包括肝细胞变性、管腔宽度增加、出血灶以及由 CD3+T 和 CD8+T 标记物识别的炎症细胞浸润。杏仁油减轻了 CFI 诱导的氧化应激、细胞凋亡和炎症反应，表现为血清 ALP 和 AST 水平的改善以及关键蛋白（iNOS、p65、Caspase 3、Caspase 9、Bax 和 Bcl2）的表达调控。计算机模拟分析表明， Punicalagin 和其他 CFI 及 ACFI 的活性成分对 CYP2E1 具有良好的亲和力，提示可能存在抑制作用。这些发现为 CFI 的临床应用提供了宝贵的见解，并有助于中药的发展。影响酶活性并导致肝毒性的主要成分很可能是单宁。

**作者贡献声明：**
- Chen Wei：撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草稿、资金获取、数据管理、概念构思。
- Gvlzapar Tohniyaz：实验研究。
- Ma Qin：资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。
- Israp Abai：撰写 - 审阅与编辑、撰写 - 原始草稿、指导、概念构思。