根据P21+/MCM2?状态进行分层可以识别出不同的…… 开放获取

《Cancer Research Communications》：Stratification by P21+/MCM2? status identifies differ... Open Access

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**摘要**

目前用于预测透明细胞肾细胞癌（ccRCC）复发和指导辅助治疗的临床工具缺乏准确性，尤其是在中等风险疾病中。本研究评估了一种非增殖性肿瘤细胞表型——P21（CDKN1A抑制剂）阳性和MCM2（DNA复制蛋白）阴性（P21+/MCM2?）——是否可以作为强大的生物标志物，以改善预后分层并指导肾切除术后的治疗决策。我们使用多重免疫荧光和基于人工智能的图像分析方法，对来自三个独立ccRCC队列的肾切除标本进行了分析：英国SORCE试验组（n = 382）、韩国组（n = 71）和苏格兰组（n = 88）。通过X-tile软件确定了P21+/MCM2?细胞的最佳临界值为2%。进一步的分析评估了endoglin/CD105的共表达、配对的原发-转移样本（n = 41），以及与辅助药物索拉非尼治疗的关联。在两个中等风险的ccRCC队列中（SORCE，n = 63；韩国，n = 71），P21+/MCM2?细胞比例超过2%的患者复发时间显著延长[HR = 0.17；95%置信区间（CI），0.06–0.54；HR = 0.27；95% CI，0.10–0.72]。该生物标志物的预后价值在高风险（SORCE，HR = 0.43；95% CI，0.19–0.99）和所有风险（苏格兰，HR = 0.37；95% CI，0.14–0.98）队列中都得到了证实。值得注意的是，接受安慰剂治疗且P21+/MCM2?水平高的患者比接受辅助TKI治疗的患者预后更好（HR = 0.29；95% CI，0.16–0.50）。在41对配对样本中，85%的转移灶中P21+/MCM2?的表达量高于原发肿瘤。总之，P21+/MCM2?细胞计数是一种强大的生物标志物，可以细化ccRCC的复发风险分层，并识别可能从辅助酪氨酸激酶抑制剂（TKI）治疗中获益不到的患者。

**意义**

透明细胞肾细胞癌手术后，复发风险和辅助治疗的好处仍然不确定。我们发现了一种独特的P21+/MCM2?肿瘤表型，这种表型具有非增殖性和衰老样特征，并与良好的预后相关。在三个队列中，P21+/MCM2?细胞比例超过2%的患者复发风险降低，但这种益处在接受辅助TKI治疗后消失。

**引言**

肾细胞癌（RCC）是成人中最常见的肾脏癌症，占所有肾脏恶性肿瘤的90%到95%（1）。肾脏癌症占全球所有癌症诊断和死亡的约2%，其发病率通常在发达国家更高（2）。大多数肾脏癌症死亡病例由最常见的亚型——透明细胞肾细胞癌（ccRCC；参考文献3）引起。鉴于血管生成在ccRCC中的关键作用，已经使用诸如CD105这样的标志物来识别RCC内的内皮细胞（4）。在这种情况下，血管生成主要由VHL基因的丢失以及随后的HIF介导的VEGF过度表达驱动，这导致了VEGFR靶向酪氨酸激酶抑制剂（TKI）作为系统治疗药物的开发（5）。21世纪初，索拉非尼、舒尼替尼和帕唑帕尼等药物改变了转移性RCC的治疗，促使人们研究它们作为术后辅助治疗的潜力（6）。SORCE试验是一项针对中等/高风险ccRCC的大型安慰剂对照研究，涉及1,711名患者，发现辅助使用索拉非尼在长达3年的治疗期间并未改善无病生存期（7）。尽管其辅助作用仍存在争议，但下一代TKI药物，包括阿昔替尼和伦瓦替尼，仍被视作转移性RCC的标准治疗选择（8）。在分子水平上，细胞周期的破坏是许多恶性肿瘤，包括RCC的关键组成部分（5）。细胞周期状态通常通过评估细胞形态（如细胞体积增大）以及分子标志物来评估，包括P21和P16（表明细胞周期停滞）；MCM2（表示活跃的增殖）；以及Lamin B1（其丢失与细胞周期退出和核重塑相关）（9）。P21（CDKN1A）是一种周期依赖的激酶抑制剂，可以通过p53介导导致细胞周期停滞或衰老（10）。先前的研究表明p21表达与ccRCC的预后相关，因为局部ccRCC患者中核P21水平升高者的生存率更高；然而，对于转移性ccRCC患者则相反（11）。P16（CDKN2A）通过抑制CDK4/6发挥肿瘤抑制作用，进一步强化G1周期的停滞（12）。此外，Lamin B1作为核层的关键结构蛋白，在停滞或衰老的细胞中常常下调，反映了与细胞周期退出相关的核结构变化（13）。MCM2是DNA复制的许可因子，对于S期增殖是必需的。除了G0期外，细胞在细胞周期的所有阶段都表达MCM2（以及MCM2–7复合体的其他成员；参考文献14）。高等级别的肿瘤、晚期阶段和较差的预后都与恶性肿瘤中MCM2表达升高有关（15）。原位研究表明，在ccRCC中，MCM2指数显著优于Ki-67指数（一个系列中的中位数约为42%，而Ki-67为7%），表明有更高比例的癌细胞具有增殖能力（16）。所有这些发现都表明，在肿瘤生物学中，细胞周期停滞和增殖驱动之间存在着微妙的平衡。当增殖和停滞信号共存于癌细胞中时，可能会产生具有超越单一指标预测价值的综合生物标志物。这为研究双表型细胞（如P21阳性细胞/MCM2阴性细胞（P21+/MCM2?）奠定了基础，这些细胞可能是肿瘤中的静止或衰老部分。由于当前临床病理风险模型和辅助治疗的利弊存在不足，因此迫切需要可靠的生物标志物来指导肾切除术后的决策（17）。通过使用肿瘤分期、级别和其他变量，临床预后模型[如UISS、SSIGN和Leibovich评分（LS）]将患者分为低风险、中等风险和高风险组（18）。尽管如此，仍然难以准确预测复发情况，特别是对于中等或高风险的局部ccRCC。一部分中等风险的癌症表现出侵袭性行为，而其他被认为是高风险的患者从未经历复发（19）。ccRCC的肿瘤微环境由增殖性、静止性和停滞性的细胞组成（20）。我们假设ccRCC中的肿瘤行为可能受到一种由P21+/MCM2?表型定义的静止细胞群体的影响。这一假设源于对苏木精和伊红染色下的大而形态独特的细胞的组织学观察，这些细胞可能代表一种静止或衰老的亚群。我们提出，这些非循环细胞的丰富度可以作为复发风险的生物标志物，并提示某些患者可能不会从辅助TKI治疗中受益。

**材料与方法**

**研究人群**

本研究纳入了三个独立的ccRCC患者队列（表1）。第一个队列（n = 382）来自参与SORCE试验的英国患者（ClinicalTrials.gov标识符：NCT00492258），这是一项多中心、随机、双盲的III期研究，旨在比较肾切除术后1年和3年的辅助索拉非尼与安慰剂的效果（7）。SORCE队列中的患者根据Leibovich评分（LS）被分为中等风险（LS3、LS4和LS5）和高风险（LS6及更高）亚组（21）。中等风险亚组被用作本分析的训练集，而高风险亚组则作为后续测试集，以评估该生物标志物在中等风险人群之外的适用性。表1显示了SORCE、韩国和苏格兰队列中仅患原发疾病患者的临床病理特征。

**引言**

肾细胞癌（RCC）是成人中最常见的肾脏癌症，占所有肾脏恶性肿瘤的90%到95%（1）。肾脏癌症占全球所有癌症诊断和死亡的约2%，其发病率在发达国家通常更高（2）。大多数肾脏癌症死亡是由最普遍的亚型——透明细胞肾细胞癌（ccRCC；参考文献3）引起的。鉴于血管生成在ccRCC中的关键作用，已经使用CD105等标志物来识别RCC内的内皮细胞（4）。在这种背景下，血管生成主要由VHL基因的丢失和随后的HIF介导的VEGF过度表达驱动，这导致开发出了以VEGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（TKI）作为系统治疗药物（5）。21世纪初，索拉非尼、舒尼替尼和帕唑帕尼等药物改变了转移性RCC的治疗方式，从而引发了对其作为术后辅助治疗潜力的研究（6）。SORCE试验是一项涉及1,711名患者的大型安慰剂对照研究，发现辅助使用索拉非尼在长达3年的治疗期间并未改善无病生存期（7）。虽然其辅助作用仍存在争议，但包括阿昔替尼和伦瓦替尼在内的新一代TKI继续成为转移性RCC的标准治疗选择（8）。在分子水平上，细胞周期的破坏是许多恶性肿瘤，包括RCC的关键组成部分（5）。细胞周期状态通常通过评估细胞形态（如细胞体积增大）以及分子标志物来评估，包括P21和P16（表明细胞周期停滞）；MCM2（标记活跃的增殖）；以及Lamin B1（其丢失与细胞周期退出和核重塑相关）（9）。P21（CDKN1A）是一种周期依赖的激酶抑制剂，可以通过p53介导导致细胞周期停滞或衰老（10）。先前的研究表明p21表达与ccRCC的预后相关，因为核P21水平升高的局部ccRCC患者的生存率较高；然而，对于转移性ccRCC患者则相反（11）。P16（CDKN2A）通过抑制CDK4/6发挥肿瘤抑制作用，进一步强化G1周期的停滞（12）。此外，Lamin B1作为核层的关键结构蛋白，在停滞或衰老的细胞中常常下调，反映了与细胞周期退出相关的核结构变化（13）。MCM2是DNA复制的许可因子，对于S期增殖是必需的。除了G0期外，细胞在细胞周期的所有阶段都表达MCM2（以及MCM2–7复合体的其他成员；参考文献14）。高等级的肿瘤、晚期阶段和较差的预后都与恶性肿瘤中MCM2表达升高相关（15）。原位研究表明，在ccRCC中，MCM2指数显著优于Ki-67指数（一个系列中的中位数约为42%，而Ki-67为7%），表明具有增殖能力的癌细胞比例较高（16）。所有这些发现都指向肿瘤生物学中细胞周期停滞和增殖驱动之间的微妙平衡。当增殖和停滞信号在癌细胞中共存时，可能会产生具有预测价值的综合生物标志物。这为研究双表型细胞（如P21阳性细胞/MCM2阴性细胞（P21+/MCM2?）奠定了基础，这些细胞可能是肿瘤中的静止或衰老部分。由于当前临床病理风险模型和辅助治疗的风险/效益存在不足，迫切需要可靠的生物标志物来指导肾切除术后的决策（17）。通过使用肿瘤分期、级别和其他变量，临床预后模型[如UISS、SSIGN和Leibovich评分（LS）]将患者分为低风险、中等风险和高风险组（18）。尽管如此，仍然难以准确预测复发情况，特别是对于中等或高风险的局部ccRCC。一部分中等风险的癌症表现出侵袭性行为，而其他被认为高风险的患者从未经历复发（19）。ccRCC的肿瘤微环境由增殖性、静止性和停滞性的细胞动态混合组成（20）。我们假设ccRCC中的肿瘤行为可能受到由P21+/MCM2?表型定义的静止细胞群体的影响。这一假设基于对苏木精和伊红染色下大而形态独特的细胞的组织学观察，这些细胞可能代表一种静止或衰老的亚群。我们提出，这些非循环细胞的丰富度可以作为复发风险的生物标志物，并提示某些患者可能从辅助TKI治疗中受到伤害。

**材料与方法**

**研究人群**

本研究纳入了三个独立的ccRCC患者队列（表1）。第一个队列（n = 382）来自英国的SORCE试验参与者（ClinicalTrials.gov标识符：NCT00492258），这是一项设计用于比较肾切除术后1年和3年辅助索拉非尼与安慰剂效果的多中心、随机、双盲III期研究（7）。SORCE队列中的患者根据Leibovich评分被分为中等风险（LS3、LS4和LS5）和高风险（LS6及更高）亚组（21）。中等风险亚组被用作本分析的训练集，而高风险亚组则作为后续测试集，以评估该生物标志物在中等风险人群之外的适用性。表1显示了SORCE、韩国和苏格兰队列中仅患原发疾病患者的临床病理特征。

**第二个队列**作为地理位置上独立的验证组（n = 71），包括在韩国首尔国立大学医院接受手术治疗的LS中等风险ccRCC患者。该队列是在机构伦理批准（IRB编号：H-1908-133-1057）下收集的。第三个队列（n = 88）包括在苏格兰爱丁堡接受肾切除术治疗的ccRCC患者。 Formalin固定的石蜡包埋（FFPE）肿瘤标本来自爱丁堡的病理学档案。所有组织样本都是在任何系统治疗开始之前收集的。这项回顾性研究的临床数据和生物样本的获取得到了NHS Lothian的Bioresource的伦理批准（IRAS参考编号：15/ES/0094）。

**所有抗体都针对明场免疫过氧化物酶和多重免疫荧光（mIF）进行了优化**，使用了包含120个正常和癌组织（RCC、乳腺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌、扁桃体癌、脾癌等）的组织微阵列（TMA）。优化是通过测试一系列抗体稀释度和抗原回收条件来确定的，以确定最佳染色性能。选择的条件基于信号强度、最小背景染色以及预期细胞定位的保持。包括阳性 and 阴性对照组织以确认抗体的特异性。优化后，研究队列中的所有分析都是在完整的整个组织切片上进行的，以确保全面评估肿瘤内的异质性。

**免疫组化**

切片（3 μm）在二甲苯中重新水化，然后在分级酒精（100%、100%、80%、50%）中浸泡，并用水冲洗。热诱导的抗原回收是在自动高压锅中进行的（5分钟，99°C，0.01 mol/L柠檬酸缓冲液，pH 6.0）。内源性过氧化物酶活性用3%过氧化氢（5分钟）阻断，随后用0.1% TBST冲洗5分钟。应用无血清封闭溶液（Agilent，X090930-2）10分钟。一级抗体P21（Abcam #ab109520，1:200）、Lamin B1（Novus #NBP1-42594，1:1,000）、P16（Roche #06695248001，预稀释）和MCM2（Cell Signaling #4007，1:250）在DAKO稀释液中稀释。TMA和肾切片与EnVision辣根过氧化物酶（HRP）结合的抗小鼠或抗兔次级抗体孵育，然后用DAB显色剂（Agilent，K346711-2）显色10分钟，最后封片在DPX（Sigma-Aldrich）中。各切片用Hoechst 33342（Thermo Fisher Scientific #H3570，1:100）进行复染，并使用Prolong Gold抗褪色剂（Thermo Fisher Scientific #P36930）封片。切片扫描

使用Zeiss Axio Scan Z1切片扫描仪捕捉全滑片图像，该扫描仪支持四个荧光通道：DAPI（461 nm）、FITC（519 nm）、Cy3（570 nm）和CY5（670 nm）。为了保持一致性，所有队列的切片都采用相同的扫描参数进行扫描。生物图像分析

荧光全滑片图像使用Indica HALO平台（v3.4.2986.151）和HALO AI（Indica Labs，https://www.indicalab.com/halo-ai）进行分析。基于多个队列样本中手动标注的细胞核和背景区域，我们训练了一个自定义的细胞核分割分类器，以优化细胞核检测并减少FFPE自体荧光的错误分割。分割准确性通过视觉检查进行确认。在多重染色切片上，使用匹配的H&E染色切片作为参考，手动标注肿瘤区域。使用HighPlex FL模块对肿瘤区域内的标记物进行定量分析，通过荧光阈值（FITC、Cy3和Cy5）对单个细胞进行表型分析。在分析训练队列（SORCE中等风险队列）时确定了每个标记物的荧光强度阈值，使用阳性对照组织定义与真实细胞核染色相对应的信号范围，并将其与背景荧光区分开来。然后根据这些预定义的阈值将单个细胞分类为标记物阳性或阴性，P21+/MCM2?细胞定义为P21呈阳性且MCM2信号缺失的细胞。最初的阳性染色评估由三位作者（H. Abdullah、I.H. Um和D.J. Harrison）独立完成，并就分类标准达成一致。为了确保不同染色批次和队列之间的可重复性，在每次多重染色过程中都包含了含有已知阳性组织的TMA对照样本。这些对照样本用于监控染色性能和信号一致性。当出现批次间的轻微荧光强度变化时，会根据对照组织的信号分布保守地调整阈值，以保持生物学分类的准确性。所有的阈值设置和调整都独立于临床结果数据，并将相同的分类框架应用于验证和测试队列。

细胞根据共表达模式被分类为不同的表型亚群，即P21+/MCM2?和CD105+/P21+/MCM2?。每个计数结果表示为单个患者样本的百分比，方法是将该计数除以切片上存在的总细胞数量。为了确定基于P21+/MCM2?表达对患者进行分层的最佳阈值，我们使用了X-Tile（23）这一生物信息学工具，该工具专为基于结果的生物标志物评估而设计。该软件分析所有可能的临界点，并选择能够最佳地将患者划分为预后不同组的阈值。根据英国SORCE训练队列的复发时间数据，X-Tile确定2%为最具统计意义的临界点。然后使用该值将患者分为低（<2%）和高（≥2%）P21+/MCM2?组。在验证和测试队列中应用了选定的阈值，以确保结果的一致性和预测的可重复性。所有队列的Kaplan–Meier生存分析以及双侧P值都是使用R软件（24）生成的。危险比（HR）和95%置信区间（CI）是通过在SPSS（IBM SPSS Statistics，版本28.0.1.1）中进行的Cox比例风险回归分析计算得出的。

CCRC中的细胞周期停滞的IHC和多重分析

在对同一患者的连续CCRC组织切片进行IHC时，使用了已建立的细胞周期调节标记物来区分增殖状态和非增殖状态。如图1所示，在整个肿瘤切片中都观察到了P21和P16（细胞周期停滞的关键标记物）强烈核表达的细胞。相比之下，MCM2则只在特定亚群的细胞中被检测到，这与持续的细胞周期活动一致。LAMIN B1（LMNB1）在整个肿瘤中表现出异质的核阳性，表明切片中细胞核膜完整性和细胞周期状态存在差异。图1。

在肿瘤区域内，mIF显示了基于P21和MCM2表达组合的独特细胞表型。活跃分裂的细胞通过MCM2阳性而被识别（MCM2+/P21?），而非分裂的细胞则表达P21但不表达MCM2（P21+/MCM2?）。第三类较小的亚群同时表达这两种标记物（P21+/MCM+）。CD105被选为活性内皮的标志物（25）。尽管如此，其表达可能不仅限于内皮细胞，还可能包括肿瘤或基质细胞的某些亚群，这可能反映了不同的微环境作用（4）。一部分endoglin/CD105标记的细胞为P21+/MCM2?（图1）。总之，IHC和mIF都揭示了CCRC组织中分裂细胞和非分裂细胞的共存，包括不分裂的CD105+细胞。P21+/MCM2?细胞的比例可以用于分层中等风险CCRC患者的复发风险。

为了评估细胞周期停滞肿瘤细胞在中等风险CCRC中的预后相关性，我们量化了P21+/MCM2?细胞的比例，并在两个独立的患者队列中评估了它们与复发时间的关联。训练队列由中等风险CCRC患者组成（n = 63），而验证队列由韩国队列中的中等风险CCRC患者组成（n = 71）。我们使用X-Tile确定2%为SORCE训练队列中最有效的复发风险鉴别阈值。该阈值作为一个二元分类器，有效地将患者分层为高表达组和低表达组。图2显示，在SORCE训练队列中，P21+/MCM2?细胞含量超过2%的患者复发时间显著延长（HR = 0.17；95% CI，0.06–0.54；P < 0.001），与P21+/MCM2?细胞含量低的患者的复发风险相比，复发风险降低了82.8%。这种差异在手术后的前5年内尤为明显，其中高P21+/MCM2?组只有8%的患者复发，而低表达组有50%的患者复发（P < 0.001）。在10年时，高P21+/MCM2?组的复发率仍然显著低于低表达组（12% vs 50%；P < 0.001）。图2。

P21+/MCM2?细胞含量有助于在中等风险CCRC中更好地分层风险。SORCE训练队列（n = 63）的Kaplan–Meier生存分析显示，P21+/MCM2?细胞含量≤2%的患者在142个月内的复发率显著高于P21+/MCM2?细胞含量>2%的患者（P < 0.001）。相比之下，根据原始LS（LS 3–5）的分层显示的趋势在统计学上并不显著（P = 0.21）。箱线图显示了不同LS亚组中P21+/MCM2?细胞百分比的重叠分布。在韩国验证队列（n = 71）中，同样的2%阈值也在195个月内显著区分了预后结果（P = 0.005）。

为了评估P21+/MCM2?细胞含量相对于传统临床风险分层的预后性能，我们比较了基于LS和生物标志物定义的亚组在中等风险SORCE训练队列中的复发时间（图2）。根据原始LS值（LS 3、4和5）对患者进行Kaplan–Meier分析，结果显示分数较高的患者复发倾向增加。此外，Cox比例风险分析表明，原始LS每增加1分，复发风险增加2.4倍（HR = 2.40；95% CI，0.87–6.63；P = 0.21）。在韩国队列中也独立验证了P21+/MCM2?与患者预后的关联，同样的2%阈值同样有效地将患者分层为高风险组和低风险组（HR = 0.27；95% CI，0.10–0.72；P = 0.005）。在该队列中，高P21+/MCM2?细胞含量的患者中有15%在5年内复发，而低表达组中有44%复发（P = 0.001）。这些结果共同表明，较高的P21+/MCM2?细胞比例与中等风险CCRC中较低的复发风险相关。在SORCE训练和韩国验证队列中，大多数患者都属于高P21+/MCM2?组（约75%至81%），而少数低表达组（19%–25%）的复发时间显著较短。为了评估P21+/MCM2?生物标志物的额外预后价值，我们比较了包含和不包含该生物标志物的多个预测模型的区分性能。在SORCE训练队列和韩国验证队列中，加入该生物标志物后模型区分性能均得到改善。例如，当加入生物标志物时，LS的C指数从0.64增加到0.73（SORCE队列）和0.73增加到0.78（韩国队列，补充表S1）。我们还评估了CD105+/P21+/MCM2?细胞在CCRC中的预后价值。如补充图S1所示，使用相同的中等风险LS训练（SORCE）和验证（韩国）队列，我们发现CD105+/P21+/MCM2?和CD105?/P21+/MCM2?细胞百分比之间存在强相关性（SORCE中r = 0.77，韩国中r = 0.99）。根据之前定义的2%阈值进行分层显示，在中等风险SORCE（HR = 0.13；95% CI，0.04–0.41；P < 0.001）和韩国（HR = 0.17；95% CI，0.06–0.48；P < 0.001）队列中，P21+/MCM2?水平较高的患者复发时间有所改善。

为了确定P21+/MCM2?细胞量化的预后价值是否超出了中等风险疾病的范围，我们在两个额外的队列中验证了我们的发现：SORCE试验中的高风险亚组以及苏格兰队列（低风险、中等风险和高风险患者）。使用为训练队列确定的2%阈值，将高风险SORCE亚组（n = 47）的患者分为低P21+/MCM2?组和高P21+/MCM2?组。图3显示，P21+/MCM2?细胞含量超过2%的患者复发时间显著优于P21+/MCM2?细胞含量≤2%的患者（HR = 0.43；95% CI，0.19–0.99；P = 0.039）。在5年内，高P21+/MCM2?组有20%的患者复发，而低P21+/MCM2?组有55%的患者复发（P = 0.023）。在10年时，高表达组的复发率为36%，而低表达组为64%（P = 0.038）。图3。

在苏格兰队列（n = 88）中，如图3所示，2%阈值的预后相关性在所有LS风险水平上都得到了证实：P21+/MCM2?细胞含量高的患者比含量低的患者的预后明显更好（HR = 0.37；95% CI，0.14–0.98；P = 0.037）。在最后7年的随访时间点，高P21+/MCM2?组有12%的患者复发，而低表达组有33%的患者复发。即使在混合的中等风险和高风险苏格兰队列及SORCE高风险组中应用CD105阳性细胞时，也未观察到P21+/MCM2?效果的关联。根据P21+/MCM2?细胞的分层，可以识别出对索拉非尼辅助治疗的不同反应，在ccRCC（肾细胞癌）中尤为明显。

为了研究P21+/MCM2?细胞含量是否影响对辅助治疗的反应，我们对SORCE试验中的患者（n = 382）进行了分析，这些患者被定义为具有中等和高等风险的ccRCC。根据P21+/MCM2?细胞的2%阈值对患者进行分层，并比较了接受索拉非尼治疗与接受安慰剂治疗的患者之间的复发时间。索拉非尼组包括那些按照试验方案接受了1年或3年辅助治疗的患者。如图4所示，在P21+/MCM2?水平较低（≤2%）的患者中，两组之间的复发时间没有差异（HR = 1.51；95% CI, 0.91–2.50；P = 0.11），表明索拉非尼在这一亚组中没有带来益处。然而，在P21+/MCM2?水平较高（>2%）的患者中，接受安慰剂治疗的患者比接受索拉非尼治疗的患者有更长的复发时间（HR = 0.29；95% CI, 0.16–0.50；P < 0.001），这表明索拉非尼治疗消除了高P21+/MCM2?水平所带来的潜在益处。

在转移性ccRCC中，非增殖性P21+/MCM2?细胞的积累

在一个包含41例患者的队列中，原发肿瘤中很少检测到P21+/MCM2?细胞，但在41名患者中的35名（85%）中，转移组织中的P21+/MCM2?细胞比例高于相应的原发肿瘤（Wilcoxon符号秩检验统计量：47，P < 0.001；图5）。图5显示，转移性ccRCC中的P21+/MCM2?细胞百分比较高。多重成像显示转移性肿瘤中的P21+/MCM2?表达比原发肿瘤更高。

讨论

本研究描述了一种在ccRCC中由P21的存在和MCM2的缺失（P21+/MCM2?）定义的细胞表型。尽管P21是已知的RCC（肾细胞癌）G1期停滞的标志物（26），但将其与MCM2（一种独立于p53的增殖许可因子）结合评估可以更精细地分层肿瘤细胞周期状态。对于仅接受手术治疗的患者，P21+/MCM2?水平高于2%与更好的预后相关；然而，如果引入TKI（酪氨酸激酶抑制剂）治疗，这种益处就会丧失。在SORCE队列的中等风险组中，使用原始LS（Log-Rank评分）进行分层提供的预后区分能力有限。由于评分亚组之间的CI（置信区间）重叠和显著的异质性，复发风险仍然难以明确界定。相比之下，P21+/MCM2?细胞含量提供了基于肿瘤细胞状态的明确生物学区别。在SORCE和韩国队列中，P21+/MCM2?细胞水平较低的患者表现出接近50%的复发率——这些率与高风险LS组中的率相当——然而，仅使用LS无法识别出这些个体。这一亚组代表了复发风险较高的群体，他们可能从加强监测、辅助治疗和临床试验中更精确的分层中受益。这些发现强调了P21+/MCM2?捕获了传统临床病理模型所忽视的生物相关信息。它在中等风险患者中细化复发风险以及在高风险和所有风险ccRCC队列中分层结果的能力，突显了其作为稳健且具有临床可行性的生物标志物的潜力。除了细胞静止状态外，这种P21+/MCM2?表型也可能代表细胞衰老，这是一种由氧化损伤、致癌信号或治疗暴露等压力引起的更持久的生长停滞状态（28）。这些细胞可以获得衰老相关的分泌表型（SASP），其特征是释放生长因子、基质重塑酶和促炎细胞因子（29）。通过吸引免疫细胞来清除受损或癌前细胞，SASP可能在特定情况下改善免疫监视并促进肿瘤抑制（30）。在原发肿瘤中P21+/MCM2?细胞比例较高的患者中观察到的更有利的结果可能是由于这些类似衰老的细胞产生的微环境抑制了癌症生长或促进了免疫介导的清除。此外，CD105+/P21+/MCM2?细胞的识别显示了与CD105?/P21+/MCM2?细胞的强相关性以及相同的良好预后关联，这表明这种表型不仅限于上皮肿瘤成分。鉴于CD105作为活化内皮的公认标志物（31），这些细胞可能位于肿瘤微环境的血管或间质成分中。这提出了细胞周期停滞，甚至是细胞衰老，可能发生在非上皮成分如内皮中的可能性，在那里它可能影响血管生成平衡、免疫细胞浸润和肿瘤进展（32）。我们已经证明，切除的原发肿瘤中P21+/MCM2?细胞的存在可以带来更好的预后，但这种效果在辅助TKI治疗后会丧失。由于每例患者的肾切除都是出于治愈目的进行的，因此P21和MCM2作为生物标志物的解释必须表明原发肿瘤中测量到的特征与临床不可见的微转移灶中的特征之间存在关系。在85%的配对原发/转移样本中（按定义是临床可见的，而非微转移灶），转移组织中的P21+/MCM2?细胞频率更高。研究表明索拉非尼可以抑制RCC细胞系中的P21表达（33）并选择性地靶向衰老细胞（34），这表明它可能干扰由SASP因子介导的癌前信号或干扰局部免疫监视。在P21+/MCM2?含量高的患者中，TKI治疗可能导致调节性或抑制性细胞群体的意外清除，从而使微转移灶在临床上显现出来。尽管辅助TKI不再是ccRCC的标准治疗，但发现TKI可能对仅在其2%细胞中表现出该表型特征的患者产生不利影响，这突显了肿瘤微环境在调节治疗反应中的微妙作用。这表明类似的微环境动态可能影响转移环境中的治疗效果和抗药性，需要进一步研究。总之，我们的研究将P21+/MCM2?细胞含量视为一个可能的生物标志物，它可能反映了ccRCC中增殖停滞、衰老和治疗反应之间的动态相互作用。将这一标志物整合到临床实践中，如C指数分析中所显示的模型区分能力的提高，可以支持更精细的预后模型，并避免无效或潜在有害的治疗。

数据可用性

本研究生成的数据在BioImage Archive中公开可用。SORCE队列的访问号为S-BIAD2453（DOI: 10.6019/S-BIAD2453）；韩国ccRCC队列的访问号为S-BIAD2452（DOI: 10.6019/S-BIAD2452）；苏格兰ccRCC队列的访问号为S-BIAD2454（DOI: 10.6019/S-BIAD2454）；转移性队列的访问号为S-BIAD2455（DOI: 10.6019/S-BIAD2455）。所有数据集均根据CC0许可证发布。

作者披露

这是一篇Legacy manuscript。披露信息必须从ICMJE PDF中收集。

作者贡献

H. Abdullah：概念化、数据管理、软件使用、正式分析、验证、研究、可视化、方法论、初稿撰写、审阅和编辑。I.H. Um：数据管理、软件使用、正式分析、验证、研究、方法论、审阅和编辑。G.D. Stewart：数据管理、监督、验证、可视化、审阅和编辑。C.W. Jeong：资源提供、数据管理、审阅和编辑。C. Kwak：资源提供、数据管理、审阅和编辑。K.C. Moon：数据管理、审阅和编辑。A. Laird：数据管理、验证、审阅和编辑。E. Frangou：数据管理、验证、审阅和编辑。T. Eisen：数据管理、验证、审阅和编辑。A. Meade：数据管理、验证、审阅和编辑。D.J. Harrison：概念化、资源提供、数据管理、监督、资金获取、验证、研究、可视化、项目管理、审阅和编辑。

致谢

本工作得到了KATY项目（D.J. Harrison）的支持，该项目获得了欧盟Horizon 2020研究和创新计划的资助，授予协议编号为101017453。H. Abdullah获得了圣安德鲁斯大学的奖学金。注意：本文的补充数据可在Cancer Research Communications Online（https://aacrjournals.org/cancerrescommun/）上获取。