筛选提升和保持抗菌效果的策略：优化黑 soldier fly （黑 soldier fly）幼虫对禽类肠道病原体的灭活与干燥处理方法

《Poultry Science》：Screening of Strategies for Enhancing and Preserving Antibacterial Efficacy: Optimizing Inactivation and Desiccation of Black Soldier Fly Larvae Against Avian Enteric Pathogens

　　建伟浩|李立秀|杨圆圆|李楚军|刘双
中国晋中市晋中大学生物科学与技术系

**摘要**
鸡粪被广泛用于饲养黑水虻幼虫（BSFL）。关于鸡粪中携带的病原体（大肠杆菌和沙门氏菌）及其对黑水虻幼虫抗菌肽表达的影响，目前仍缺乏足够的了解。本研究将黑水虻幼虫暴露于单一或混合感染大肠杆菌（E. coli）和沙门氏菌（S. p）的环境中，探讨了这些病原体的影响。与对照组相比，所有感染病原体的组别幼虫的体重和体长均有显著增加。每组进一步分为三种处理方式：未受刺激、高温刺激（Hs）和微波刺激（Ws）。在刺激后6小时，测定了防御素和天蚕素的表达量以及抗菌活性。在未受刺激的情况下，16个感染组中有11组的基因表达变化小于未感染对照组；而在16个组中，有7组能够抑制沙门氏菌的生长。高温和微波刺激均显著上调了防御素和天蚕素的表达量。所有受刺激的样本均能强烈抑制沙门氏菌的生长；其中大多数样本也对大肠杆菌具有抗菌活性（16组Ws处理组，14组Hs处理组）。接收者操作特征（ROC）分析显示，防御素的ΔCt值（样本Ct值减去参考Ct值）与对大肠杆菌的抑制直径呈负相关（r = ?0.4381），可用于有效区分对这两种病原体的抗菌效果。最终确定的临界值为2.43。在干燥前对幼虫进行1%淀粉-5%蔗糖-0.1%吐温-80处理可以最佳地保留其对抗沙门氏菌的活性，其中Sp2E4-Ws处理组的最大抑制直径为2.65毫米。本研究为黑水虻幼虫产生抗菌蛋白提供了理论和技术指导。

**引言**
禽类肠道病原体，尤其是致病性大肠杆菌（E. coli）和沙门氏菌（S. p），对全球家禽产业和公共卫生构成持久的威胁（Saini等人，2026年）。这些病原体会破坏家禽的肠道健康，降低生产效率并造成经济损失。作为食源性威胁，它们通过家禽产品传播给人类，引发胃肠道和全身性疾病（Sharma等人，2025年；Ruiz等人，2025年）。在畜牧业中，抗生素的使用受到严格限制，因此新型天然抗菌剂对于可持续的动物生产至关重要。在这些天然抗菌剂中，昆虫来源的抗菌肽（AMPs）具有广谱抗菌活性、低抗生素抗性风险和优异的生物相容性（Xia等人，2021年；Bucataru等人，2014年）。作为典型的昆虫资源，黑水虻幼虫（BSFL，Hermetia illucens L.，双翅目：Stratiomyidae科）在抑制禽类肠道病原体方面具有巨大潜力（Xia等人，2021年；Szcepanik等人，2024年）。

黑水虻幼虫是具有显著有机废物转化能力的腐生昆虫。鸡粪是黑水虻生物处理的主要底物，可以被其转化为高价值的蛋白质生物量（Zhao等人，2023年；Liu等人，2022年）。更重要的是，黑水虻幼虫能够内源性产生多种抗菌肽，其中以防御素和天蚕素为主。这两种核心肽对致病性大肠杆菌和沙门氏菌具有强烈的抑制作用（Luo等人，2024年）。然而，仍有一些关键科学问题尚未得到充分解答。例如，不同浓度的来自鸡粪的大肠杆菌和沙门氏菌是否会影响黑水虻幼虫的生长、抗菌肽的合成及其抗菌能力，尤其是在同时感染多种病原体的情况下。明确这些问题至关重要，因为单一和混合病原体暴露的剂量依赖性数据可以为定向生产具有营养和功能的黑水虻蛋白提供指导。

此外，黑水虻幼虫中的抗菌肽表达可以通过多种刺激引发，包括细菌注射、身体穿刺和表面热损伤。Nakagawa等人（2023年）评估了黑水虻幼虫对这些刺激的抗菌肽合成反应，并确认热损伤是一种有效的诱导策略。与注射和穿刺相比，热损伤更安全且操作更简单。作者建立了一种标准化的热损伤方案：将针头在煤气炉上加热3秒，然后与幼虫胸部接触1秒以引起表皮损伤。尽管该方法操作简单，但仍存在一些未解决的问题，例如如何将其整合到具有明确定量温度参数的大规模黑水虻生产中，以及标准化温度控制是否能够维持其诱导抗菌肽的效果。此外，将热损伤机制扩展到微波灭活的可行性也需要进一步探索。

干燥过程中抗菌活性的丧失是工业生产中的一个主要瓶颈。高温干燥会直接破坏抗菌肽的构象并引发降解。严重脱水还会促进肽的聚集。此外，由于黑水虻幼虫的堆积导致温度分布不均，会进一步加速活性丧失。淀粉、蔗糖和吐温-80可以通过其独特的理化性质为抗菌肽的稳定性和保留提供潜在解决方案（Zhu等人，2017年；Chang等人，2005年；Li等人，2024年；Starciuc等人，2020年）。目前尚不清楚在干燥前将黑水虻幼虫浸泡在不同的冷冻保护剂溶液中是否能够保留其抗菌肽。

为了探索解决黑水虻抗菌制剂开发中关键瓶颈的潜在方法，本研究建立了一个综合性研究框架，包含三个核心目标：首先，研究黑水虻幼虫在无菌培养条件下对单一和混合感染大肠杆菌及沙门氏菌的反应及其抗菌肽基因表达的变化；其次，基于热损伤机制建立了一种新的两步灭活策略，以替代常规的单步处理，并采用微波处理实现全面的热损伤效果；最后，探索了一种经济有效的保护配方，以在低温干燥过程中维持黑水虻幼虫的抗菌活性。这些策略共同构建了一个综合技术体系，增强了黑水虻幼虫对禽类肠道病原体的抗菌效果，并实现了从诱导到工业制备的全过程调控。

**材料与方法**
**细菌制备和昆虫饲养**
黑水虻（BSF）卵购自中国广州五粮生物技术有限公司。大肠杆菌（革兰氏阴性，CVCC: 1569）和沙门氏菌（革兰氏阴性，CVCC: 533）分别接种到10 mL的Luria-Bertani（LB）培养基（1%色氨酸，0.5%酵母提取物，0.5% NaCl）中，37°C下 shaking培养24小时。每种细菌培养物取1 mL转接到新鲜的LB培养基中，继续培养至600 nm处的光密度（OD）达到1.0，然后用于实验处理。

黑水虻卵孵化后，幼虫在Gainesville（GV）饲料（50%小麦麸皮，30%苜蓿粉，20%玉米粉，干物质比例）中饲养，每克饲料添加2 mL水，饲养至4天大。4天大的幼虫依次用75%乙醇进行表面消毒，用无菌生理盐水彻底冲洗后风干，然后分配到16个实验组中，每组三个重复。所有实验均在层流柜中进行，整个实验过程中幼虫均在此环境下饲养；通过空调将室温维持在25°C以防止外来微生物污染。每个重复包括1千克经过高压灭菌的GV饲料，加入0.5克经过消毒的4天大黑水虻幼虫。实验分组和亚处理设计见表1。每个组包含三个重复样本。实验期间，每两天从每个重复样本中随机抽取10只幼虫进行称重和体长测量（从6天龄开始），然后放回容器中。

**表1. 实验分组和处理设计**
| 组别 | 细菌添加量（CFU/g饲料） | 亚处理 | 未受刺激/刺激后的14天大黑水虻幼虫处理 |
| --- | --- | --- | --- |
| CK | 无细菌添加 | CK | CK-Us / CK-Hs / CK-Ws |
| Sp2 | S. p 102 | Sp2-Us / Sp2-Hs / Sp2-Ws | |
| Sp4 | S. p 10? | Sp4-Us / Sp4-Hs / Sp4-Ws | |
| Sp6 | S. p 10? | Sp6-Us / Sp6-Hs / Sp6-Ws | |
| E4 | E. coli 10? | E4-Us / E4-Hs / E4-Ws | |
| E6 | E. coli 10? | E6-Us / E6-Hs / E6-Ws | |
| E8 | E. coli 10? | E8-Us / E8-Hs / E8-Ws | |
| Sp2E4 | S. p 102 + E. coli 10? | Sp2E4-Us / Sp2E4-Hs / Sp2E4-Ws | |
| Sp2E6 | S. p 102 + E. coli 10? | Sp2E6-Us / Sp2E6-Hs / Sp2E6-Ws | |
| Sp2E8 | S. p 102 + E. coli 10? | Sp2E8-Us / Sp2E8-Hs / Sp2E8-Ws | |
| Sp4E4 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp4E4-Us / Sp4E4-Hs / Sp4E4-Ws | |
| Sp4E6 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp4E6-Us / Sp4E6-Hs / Sp4E6-Ws | |
| Sp4E8 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp4E8-Us / Sp4E8-Hs / Sp4E8-Ws | |
| Sp6E4 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp6E4-Us / Sp6E4-Hs / Sp6E4-Ws | |
| Sp6E6 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp6E6-Us / Sp6E6-Hs / Sp6E6-Ws | |
| Sp6E8 | S. p 10? + E. coli 10? | Sp6E8-Us / Sp6E8-Hs / Sp6E8-Ws | |

**注：**
CK 表示对照组；Sp 表示沙门氏菌；E 表示大肠杆菌；Us 表示未受刺激；Hs 表示高温刺激；Ws 表示微波刺激；数字后缀表示细菌浓度（CFU/g饲料）。饲料由干物质和无菌水组成。所需的细菌体积根据饲料质量计算；细菌悬液先用无菌水稀释后与干物质充分混合。每个饲料组均经历三种平行处理条件。

**昆虫未受刺激和刺激处理**
14天大的幼虫被分成三组：一组在无饲料的无菌条件下保持6小时作为未受刺激组（Us组）。未受刺激的幼虫通过在120°C的热风炉中暴露1分钟进行干热处理，以快速灭活并减少蛋白质降解（表1）。为了确定既能最小化幼虫死亡率又能引起目标损伤的最佳热处理和微波处理时间，进行了独立预实验（见图S1），结果表明短期高温（120°C，5秒）和微波辐射（4 W/g，3秒）处理能够保持较高的幼虫存活率。

**高温刺激处理**
为了诱导幼虫表皮的热损伤，将烤箱预热至120°C。将密封的圆形铝盒（直径5厘米）放入烤箱中，直到盒内温度稳定在120°C。从每组14天大的幼虫中选取三分之一放入预热后的盒中，暴露于120°C下5秒。处理后，幼虫立即收集并在25 ± 1°C的无菌环境中孵育6小时（Hs组）。

**微波刺激处理**
为了诱导幼虫内部组织的热损伤（而非表皮），根据幼虫的平均体重将微波功率校准为4 W/g。从每组14天大的幼虫中选取三分之一放入无菌培养皿中，暴露于校准后的微波辐射下3秒。处理后，幼虫立即取出并在25 ± 1°C的环境中孵育6小时（Ws组）。

**血淋巴和脂肪体收集**
从Hs组、Ws组和Us组中收集幼虫的血淋巴和脂肪体。首先用70%乙醇对幼虫进行表面消毒，然后用剪刀或无菌毛细管在第八和第九腹节之间穿刺取样。血淋巴收集到加入L-抗坏血酸的冰冷却管中，4°C下离心12,000×g 10分钟，上清液储存在-80°C待用（Nakagawa等人，2023年；Scieuzo等人，2023年）。同时收集白色脂肪体。每个血淋巴样本（来自50只幼虫）用于抗菌活性测定，每个亚处理重复三次。每个脂肪体样本（来自50只幼虫）用于总RNA提取和RT-qPCR分析，每个亚处理重复三次。

**防御素和天蚕素基因的表达分析**
**RNA提取和cDNA合成**
按照Vazyme（南京，中国）提供的FastPure Complex Tissue/Cell Total RNA Isolation Kit说明书提取总RNA。先将脂肪体研磨成细粉，加入600 μL预混Buffer SRL，涡旋混匀。12,000 rpm（13,400×g）离心3–5分钟后，取上清液与0.5×体积的绝对乙醇混合，然后加载到FastPure RNA Columns VI上，12,000 rpm离心30秒并丢弃流出的液体。再用700 μL Buffer RWA和500 μL Buffer RWB清洗柱子，分别离心12,000 rpm 30秒和2分钟。1分钟后，用20 μL无RNase ddH?O洗脱RNA至新的1.5 mL无RNase管中，12,000 rpm离心1分钟。使用NanoOne分光光度计（Yooning，杭州，中国）评估总RNA的质量和浓度。为了合成cDNA，使用HiScript III 1st Strand cDNA合成试剂盒（Vazyme，南京，中国）在20 μL的反应体积中，按照试剂盒说明书的步骤，从总RNA中逆转录了0.8–1 μg的RNA。所得的cDNA被用作定量实时PCR（qPCR）的模板。定量实时PCR（qPCR）使用LightCycler实时PCR系统（罗氏，瑞士）分析了抗菌肽基因defensin和cecropin的表达水平。defensin和cecropin的引物是基于转录组预测的AMP序列设计的（Candian等人，2023年）：

Defensin（正向：5′-TCGTCCCATGGCAATACAAT-3′；反向：5′-TAGTGGAGCAGCATTATCGGG-3′），
Cecropin（正向：5′-GGTCAAAGCGAAGCTGGTT-3′；反向：5′-TGCCAGAACATTGGCTCCTT-3′）。
Actin作为参考基因（正向：5′-TTCGAGCAGGAAATGGCCAC-3′；反向：5′-TTGGAAGAGAGCCTCTGGAC-3′；Candian等人，2023年）。qPCR在96孔板（BBI，上海，中国）中进行，使用SYBR Green qPCR PreMix（Solarbio，中国）。所有样本都重复三次。扩增程序包括在95°C下进行10分钟的初始变性，然后是40个循环，每个循环包括95°C 15秒、58.5°C 15秒和72°C 15秒。通过熔解曲线分析（58.5–95°C，每0.5°C读取一次荧光值）来确认引物的特异性。相对基因表达通过2^-ΔΔCt方法计算，并以相对于对应对照组的倍数变化表示。

不同刺激对幼虫肽 fractions抗菌活性的影响
从血淋巴中提取AMP
为了将假定的AMP与高分子量蛋白质分离，血浆用甲醇-醋酸-水混合物（90:1:9，v/v）进行有机溶剂沉淀（Scieuzo等人，2023年）。样品与溶剂以1:9（v/v）的比例混合，并在4°C下以16,000 rcf离心45分钟。上层清液（含有分子量<30 kDa的化合物）通过氮气蒸发去除有机溶剂，然后重新悬浮在无菌水中至原始血浆体积。为了去除共提取的脂质，加入等体积的己烷（Merck Millipore，伯灵顿，MA，美国）。混合物涡旋后，在4°C下以16,000 rcf离心20分钟。上层脂质相被丢弃，剩余的水相提取物在4°C下保存以供进一步使用。

肽的定量
所有样本中的肽浓度使用总蛋白测定试剂盒（Nanjingjiancheng，南京，中国）进行测定。使用系列稀释的牛血清白蛋白标准品生成校准曲线。在595 nm处使用infinite 200 pro分光光度计（Tecan，瑞士）记录吸光度。

血淋巴提取物用于抑制圈测定
血淋巴提取物的体外抗菌活性通过在LB-agar平板上进行抑制圈测定来评估，对该方法进行了轻微修改（Scieuzo等人，2023年）。大肠杆菌和S. p的单个菌落分别接种到10 mL的LB肉汤中，并在37°C下不断摇动过夜。使用无菌棉签将细菌培养物均匀涂布在LB-Agar平板上。吸附后，将5 μL的血淋巴肽提取物滴加到平板上；5 μL无菌水作为阴性对照。所有测试重复三次，并在37°C下过夜以测量抑制圈直径。

不同溶液对抗菌保护活性的影响
准备了四种溶液，每种溶液体积为1 L，用于后续处理：1%淀粉、5%蔗糖、1%淀粉+5%蔗糖和1%淀粉+5%蔗糖+0.1% Tween 80。所有试剂均为分析级，除了Tween 80为食品级。根据之前血淋巴测定的抗菌结果，从-80°C保存的微波刺激组的幼虫中选择了三种具有显著抗菌活性的样本，然后进行浸渍和干燥。解冻至室温后，每个样本平均分成五等份。各自等份用纱布包裹，并分别浸泡在去离子水中、1%淀粉中、5%蔗糖中、1%淀粉+5%蔗糖中或1%淀粉+5%蔗糖+0.1% Tween 80中45分钟以防止浮起。浸泡后，将三个样本的所有15个等份悬挂在纱布袋中沥干15分钟，然后在60°C下烘烤直至水分含量降至10%以下。

从干燥的幼虫中提取AMP
在提取AMP之前，使用研钵和研杵将干燥的BSF幼虫研磨成细粉。粉末与提取溶液（10%醋酸和0.01 mol/L Na2EDTA）以1:10（w/v）混合。混合物以3500 rpm离心25分钟，收集上清液并在-50°C下冷冻干燥。干燥的残渣作为粗AMP提取物，在-20°C下保存。每个等份在三个独立的生物重复实验中进行AMP提取。

幼虫提取物用于抑制圈测定
蛋白质浓度通过BCA测定法进行定量，如前所述。抑制圈测定在优化条件下进行，对之前描述的方法进行了轻微修改：LB-agar平板，细菌浓度为10^6 CFU/mL，培养时间为12小时。使用无菌棉签将细菌悬浮液均匀涂布在平板上。在四个无菌Oxford杯（不锈钢圆柱形：外径7.8 mm，内径6.0 mm，高度10 mm）上各加入100 μL的粗AMP提取物（0.2 g/mL）。平板在30°C下培养12小时后测量抑制圈直径。每个生物重复实验的幼虫提取物在三个单独的agar平板上进行三次测定。

统计分析
统计分析在GraphPad Prism软件（GraphPad Software Inc.，加利福尼亚州圣地亚哥）中进行。采用单因素ANOVA后跟最小显著差异（LSD）多重比较测试来检测处理之间的显著差异。Spearman相关性分析用于评估抗菌肽基因表达与抑制圈直径之间的关系。Mann–Whitney U检验用于比较阳性与阴性抗菌组之间的差异。接收者操作特征（ROC）曲线分析用于评估抗菌肽基因在区分阳性与阴性抗菌结果方面的诊断能力。Youden指数用于确定最佳临界值和相应的诊断效率。

**结果**
大肠杆菌和S. p感染对幼虫体重和长度的影响
不同感染之间没有显著的处理效果（F 15, 80 = 0.1135；P > 0.9999）。值得注意的是，单一感染和共感染组的最大BSFL体重（0.078 ± 0.007 g至0.116 ± 0.005 g）都高于未感染的对照组（CK：0.066 ± 0.003 g；表2）。在所有实验组中，Sp2E6组的幼虫体重最高，达到0.116 ± 0.005 g（表2）。

表2. 大肠杆菌和S. p感染的幼虫体重

**试验开始后的天数**
单个幼虫体重（g）
P值
CK
Sp2
Sp4
Sp6
E4
E6
E8
Sp2E4
Sp2E6
Sp2E8
Sp4
E4
Sp4
E6
Sp4
E8
Sp6
E4
Sp6
E6
Sp6
E8
处理
20.006±0.001
0.006±0.000
0.006±0.000
0.006±0.000
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.006±0.001
0.0030±0.003
0.038±0.001
0.028±0.002
0.027±0.009
0.033±0.009
0.031±0.004
0.037±0.004
0.030±0.004
0.030±0.004
0.042±0.008
0.029±0.002
0.030±0.004
0.037±0.007
0.033±0.003
0.030±0.002
0.031±0.001
0.023±0.002
0.033±0.000
0.048±0.003
0.042±0.002
0.035±0.004
0.040±0.003
0.037±0.003
0.033±0.003
0.030±0.002
0.031±0.001
0.023±0.002
6
0.033±0.000
0.048±0.003
0.042±0.002
0.035±0.004
0.040±0.003
0.037±0.003
0.033±0.005
0.038±0.003
0.046±0.001
0.037±0.002
0.038±0.003
0.037±0.006
0.031±0.002
0.035±0.001
0.033±0.004
0.006±0.001
0.037±0.005
0.035±0.001
0.033±0.004
0.038±0.003

**幼虫长度的生长模式**
幼虫长度的生长模式与体重一致。不同实验组之间没有显著差异（F 15, 64 = 0.1875；P = 0.9996）。从第4天开始，未感染对照组（CK）的幼虫长度生长速度显著慢于所有其他处理组（表3）。总体而言，未感染对照组（CK）的最大幼虫长度（1.268 ± 0.061 cm）始终低于所有单一和共感染处理组，其范围从1.277 ± 0.037 cm到1.725 ± 0.067 cm。在所有接种组中，Sp2E6处理的幼虫长度最高，为1.725 ± 0.067 cm（表3）。

表3. 大肠杆菌和S. p感染的幼虫长度

**试验开始后的天数**
单个幼虫长度（cm）
P值
CK
Sp2
Sp4
Sp6
E4
E6
E8
Sp2E4
Sp2E6
Sp2E8
Sp4
E4
Sp4
E6
Sp4
E8
Sp6
E4
Sp6
E6
Sp6
E8
处理
20.475±0.032
0.486±0.082
0.442±0.106
0.473±0.014
0.414±0.021
0.502±0.031
0.475±0.008
0.531±0.018
0.581±0.056
0.513±0.007
0.450±0.018
0.499±0.013
0.526±0.012
0.451±0.072
0.441±0.069
0.416±0.040 = 0.9996
4
0.953±0.095
0.936±0.096
0.944±0.147
0.951±0.062
0.960±0.052
0.919±0.006
0.902±0.013
0.860±0.081
0.994±0.012
0.900±0.023
0.879±0.085
1.001±0.024
0.900±0.012
0.879±0.070
0.851±0.070
0.783±0.067
6
1.040±0.069
1.270±0.091
0.945±0.056
1.317±0.081
1.342±0.055
1.317±0.081
1.214±0.025
1.123±0.025
1.123±0.038
1.214±0.014
1.171±0.020
0.972±0.027
1.113±0.040
1.215±0.049
1.173±0.022
0.932±0.041
1.278±0.056
1.497±0.058
1.242±0.088
1.336±0.067
1.517±0.074
1.391±0.072
1.625±0.055
1.425±0.069
1.454±0.040
1.611±0.017
1.451±0.009
1.296±0.060
1.533±0.090
1.451±0.053
1.374±0.090
1.092±0.058
1.061±0.061
1.465±0.068
1.390±0.041
1.269±0.064
1.370±0.041
1.269±0.056
1.417±0.081

**大肠杆菌和S. p感染对幼虫defensin和cecropin基因表达的影响**
在未受刺激的群体中，使用2-ΔΔCt方法量化了BSFL中defensin基因的表达，所有感染组与CK相比均显示出统计学上的显著差异（F 15, 32 = 39.79；P < 0.0001；表4）。CK — Us被设为基线，def数值为平均值；不同字母的条形图之间存在显著差异（P < 0.05）。在所有可评估的组中，Ws一致性地上调了防御素的表达，且其变化幅度小于Hs（变异系数：42.3%对比78.1%）。代表性组显示了明显的Ws介导的诱导作用：Sp2-Ws和Sp6-Ws分别使防御素表达增加了约11倍和116倍，均显著高于相应的Us组（P<0.05和P<0.01；图1）。这里相对较大的标准差可能反映了生物学上的个体差异，但平均值仍显著高于对照组，支持Ws诱导的防御素激活在各种压力强度下的一致性（E4-Ws：65.9±77.6；E6-Ws：3.78±3.48；E8-Ws：2.19±1.14；图1）。相比之下，Hs引发的防御素反应变化较大。只有25%的Hs组（12组中的3组）相对于Us对照组显示出显著的上调，倍数变化范围从1.2到36.9倍。最强的诱导作用出现在Sp4E4-Hs组（>36倍），然而Hs整体的调控模式远不如Ws组一致（图1）。对于cecropin，Ws也表现出比Hs更强的诱导作用，尽管这种差异不如防御素那么明显。相对于Us，75%（12组中的9组）在Ws处理下防御素表达显著上调，中位倍数变化为41.2倍（图1）。相比之下，只有25%的Hs组显示出显著的诱导作用，中位倍数变化为8.3倍（图1）。这些数据证实，虽然Hs在某些情况下也能诱导防御素的产生，但Ws在所有实验条件下都是一直更可靠、更有效的刺激因素。

关于细菌活性的不同刺激对BSFL（细菌悬浮液滤液）的影响：当暴露于大肠杆菌（E. coli）时，Hs和Ws都有效诱导了抗菌活性，而在Us组中未检测到抑菌圈（图2）。Ws表现出更强的整体效果：83%（12组中的10组）在Ws处理下的抑菌圈直径大于Hs处理（图2和表6）。就稳定性而言，Hs的P值为0.0003（平均抑菌圈直径范围：0.25–1.1厘米），表明组间存在高度异质性，而微波处理的P值为0.0051（平均抑菌圈直径范围：0.58–1.43厘米），反映了相对较好的稳定性（表6）。相比之下，经过刺激的BSFL提取物显示出对大肠杆菌（E. coli）和沙门氏菌（S. p）的强抗菌活性（图2、3；表6）。与无脊椎动物一样，昆虫主要依靠强大的先天免疫系统来抵御病原体。该系统通过模式识别受体（PRRs）识别病原体相关分子模式（PAMPs），从而激活下游信号通路，并随后诱导AMP的表达（Perveen等人，2023年）。非特异性刺激，如热刺激，可能会引发应激反应，这与免疫通路相互作用，进而提高AMP的表达水平。例如，Nakagawa等人（2023年）的研究表明，热损伤可以刺激多种AMP的表达，而不会激活酚氧化酶或黑色素化级联反应。相比之下，微波刺激的机制尚不清楚。我们推测，微波诱导的介电加热会触发细胞膜的脂质相变，并促进细胞内Ca2?的流入，这可能协同增强IMD通路并进一步放大AMP的产生（CHO等人，2024年）。同时，针对这两种病原体的抗菌研究表明，无论是否受到刺激，沙门氏菌（S. p）对BSFL衍生的抗菌肽的敏感性始终高于大肠杆菌（E. coli）。在未受刺激的情况下，部分BSFL样品对沙门氏菌具有抑制作用，但对大肠杆菌没有抑制作用。经过热或微波刺激后，对沙门氏菌的抑制圈平均直径显著增大（沙门氏菌的抑制圈平均直径范围为0.72-1.34厘米，而大肠杆菌的抑制圈平均直径范围为0.25-1.43厘米）。这些观察结果可能源于这两种病原体细胞壁的固有结构差异。沙门氏菌的O-抗原（从脂多糖（LPS）向外延伸的多糖链）的长度各不相同，导致其外膜通透性相对较高（Santori等人，2025年）。值得注意的是，HiDef3对沙门氏菌LPS的核心寡糖具有高结合亲和力，解离常数（Kd）约为82 nM。这种强亲和力使HiDef3能够更有效地锚定在沙门氏菌的外膜上，从而发挥强大的抗菌作用（Nakagawa等人，2023年）。防御素/ Cecropin转录与抗菌表型之间的相关性分析显示，防御素的ΔCt值能够可靠地区分对抗大肠杆菌和沙门氏菌的阳性与阴性结果（图4），并且与大肠杆菌的抑制圈直径呈显著线性相关（r = ?0.4381）。相比之下，Cecropin的ΔCt值与对这两种病原体的抗菌活性关联不大（图S3）。此外，Cecropin显示出较高的ΔCt临界值，但在实际定量检测中其Ct值过高，难以实用。ΔCt值广泛应用于相对定量分析以进行诊断区分。例如，Benke等人（2023年）利用miR-24-miR-200b的ΔCt值来识别胰腺囊性病变的恶性潜力。尽管绝对定量更为准确，但由于防御素异构体种类繁多，其在生产监测中的应用较少；因此本研究未采用这种方法。总体而言，这些发现——包括对阳性与阴性抑制样本的可靠区分、通过ROC曲线分析验证的可靠诊断性能，以及在高最佳临界值2.43时较高的Youden指数（大肠杆菌为0.7222，沙门氏菌为0.7778）——表明防御素的ΔCt是一个非常有前途的检测指标，可用于评估BSFL在工业生产中的抗菌能力。在本研究中，Ws比Hs表现出更好的稳定性和均匀性。实际上，Hs的性能容易受到幼虫聚集和个体间热分布不均的影响，导致其刺激一致性较差。这种差异也在我们的实验观察中得到了体现，包括Hs处理下的基因表达数据集不完整以及抑制圈直径不稳定。因此，选择了三种Ws处理的样品进行干燥前的保护剂浸泡。与纯水相比，在含有1%淀粉、5%蔗糖和0.1%吐温80的溶液中浸泡可以最大化粗幼虫蛋白提取物对沙门氏菌的抗菌活性（图5）。淀粉、蔗糖和吐温80的蛋白质稳定作用机制已得到充分研究（Zhu等人，2017年；Chang等人，2005年；Li等人，2024年；Starciuc等人，2020年）。淀粉作为一种封装基质，通过物理屏障和分子间相互作用保护AMPs，同时减少BSFL的附着（Zhu等人，2017年）。蔗糖是一种经济高效的冷冻保护剂和玻璃化基质。根据水分置换假设，蔗糖在干燥和储存过程中稳定抗菌肽的结构，防止其变性（Chang等人，2005年；Li等人，2024年）。作为表面活性剂，吐温80通过抑制聚集、提高溶解度和增强界面稳定性来保护抗菌肽（Patel等人，2023年）。对于具有丰富几丁质外骨骼的BSFL，食品级0.1%吐温80——一种公认的安全浓度——通过降低固液界面张力起到关键保护作用。此外，这种浸泡过程在失活后和干燥前进行；其简单且低成本的配方使其非常适合大规模工业生产。

结论

本研究针对BSFL的工业生产过程进行了优化。鉴于鸡粪在大规模BSFL养殖中的广泛应用，我们评估了幼虫对两种常见禽类肠道病原体的免疫反应。两种不同的刺激处理显著增强了防御素和Cecropin基因的转录及其相应的抑制活性。我们首次验证了微波刺激的实际效力，并观察到Ws处理样品的抗菌活性相对更稳定。我们还基于防御素表达和抗菌抑制试验建立了可靠的检测框架，并验证了食品级吐温80在干燥过程中的保护作用。这些在失活和干燥过程中的综合改进为工业规模BSFL加工提供了系统和实用的指导。然而，本研究也存在一些局限性。首先，物理刺激处理是在实验室条件下进行的，其工业可行性需要进一步的大规模验证。其次，仅研究了防御素和Cecropin，而其他免疫效应因子和信号通路尚未被充分研究。第三，微波诱导的AMP上调的精确分子机制尚待实验验证。此外，抗菌谱仅限于大肠杆菌和沙门氏菌，其在农业应用中的体内效力和生物安全性仍有待探索。尽管存在这些局限性，本研究为工业BSFL的功能化蛋白生产提供了实用的、操作上可行的参考和方向，这可能为后续的验证和可持续发展奠定初步基础。