删除DPV pUL36 N端的400个氨基酸可减弱其毒性，并能有效抵御强毒株的攻击

《Practical Laboratory Medicine》：Deletion of the N-terminal 400 amino acids of DPV pUL36 attenuated virulence and conferred effective protection against virulent challenge

　　乔阳 | 于洪新 | 林艾 | 王明书 | 吴颖 | 田斌 | 杨一通 | 贾仁勇 | 朱德康 | 陈顺 | 刘玛峰 | 赵新新 | 张沙秋 | 黄娟 | 姚旭敏 | 孙迪 | 何宇 | 吴振 | 张玲 | 于艳玲 | 程安春
中国四川省成都市四川农业大学兽医学院禽病研究中心

**摘要**
鸭瘟病毒（DPV）在鸭子中引起一种高度传染性疾病，对家禽产业造成重大经济损失。大型膜蛋白pUL36在疱疹病毒中具有保守性，在病毒复制和致病性中起着关键作用。然而，其独特的N端区域在DPV中的功能仍不清楚。本研究利用基于BAC的反向遗传系统生成了一种缺乏pUL36 N端1-400个氨基酸的重组DPV突变体（Δ400），并在体外和体内评估了其生物学特性。N端区域的缺失并未影响病毒在鸭胚成纤维细胞中的复制，突变体Δ400的病毒生长动力学与野生型病毒相当。然而，将Δ400突变体感染14日龄的雏鸭并未导致死亡，仅出现轻微的临床症状，且主要目标器官的病毒载量和病理病变也有所减少（P < 0.01）。这些结果表明该突变体被显著减弱。重要的是，用Δ400免疫可完全防止致命DPV的攻击，并诱导出比商业疫苗更强的中和抗体反应（P < 0.0001）。接种疫苗的雏鸭未出现不良反应或器官损伤。总体而言，这些发现表明DPV pUL36的N端区域在体内有助于病毒毒力，但在体外复制过程中并非必需。Δ400突变体是一种安全、具有免疫原性的减毒活疫苗候选株，可用于预防和控制鸭瘟。

**引言**
鸭瘟（DP），又称鸭病毒性肠炎（DVE），是一种高度传染性的疾病，对水禽构成重大威胁（Dhama等人，2017）。鸭瘟病毒（DPV）属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、阿尔法疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）和马尔迪病毒属（Mardivirus）（Cheng，2015）。DPV病毒粒子由四个结构成分组成：包膜、膜蛋白、衣壳和基因组DNA（Guo等人，2010）。其基因组为线性双链DNA，包含独特的长链（UL）和短链（US）区域，US区域两侧有逆向重复序列IRS和TRS（Li等人，2009；Liu等人，2011；Wu等人，2012）。疱疹病毒的感染过程包括附着、进入、脱壳、基因组复制、核衣壳组装以及病毒粒子的成熟和释放（Grunewald等人，2003；Heldwein和Krummenacher，2008；Gatherer等人，2021）。疱疹病毒蛋白大致可分为结构蛋白（构成衣壳、膜蛋白和包膜）和非结构蛋白（参与病毒转录、复制、组装和其他调节过程）（Cheng，2015）。膜蛋白是病毒粒子的主要组成部分，在整个病毒生命周期中执行多种重要功能（Varnum等人，2004；Laine等人，2015；Sucharita等人，2023）。pUL36由UL36基因编码，是疱疹病毒中最大的膜蛋白（Luxton等人，2006），对病毒免疫逃避、衣壳运输、二次包膜和衣壳组装至关重要（Fuchs等人，2004；Bottcher等人，2006；Lee等人，2006）。pUL36的N端区域含有一个去泛素化（DUB）酶结构域，其核心催化残基高度保守（Bolstad等人，2011）。该DUB活性可切割K48和K63连接的polyubiquitin链（Lin等人，2020），从而维持pUL36的稳定性并抑制先天免疫反应（Wang等人，2013；Ye等人，2017；Zhang等人，2022）。在病毒运输和神经侵袭过程中，疱疹病毒衣壳依赖于宿主细胞骨架进行细胞内运动（Ploubidou和Way，2001；D?hner等人，2024）。作为与衣壳结合的膜蛋白，pUL36招募运动蛋白并介导微管依赖的逆向转运至细胞核，这对于建立感染和促进病毒扩散至关重要（Lyman和Enquist，2009；Miranda-Saksena等人，2018）。此外，pUL36对于衣壳在核孔的对接、基因组释放以及衣壳组装也是不可或缺的（Abaitua等人，2011；Toropova等人，2011）。目前，鸭瘟疫苗主要包括传统灭活疫苗和减毒疫苗。随着疫苗技术的进步，基因缺失疫苗、核酸疫苗和重组载体疫苗等新兴策略已成为重要研究方向。序列比对显示，DPV pUL36的N端1-400个氨基酸区域在其他疱疹病毒的同源物中不存在。迄今为止，这一独特区域的功能尚未被完全阐明，其对病毒复制和致病性的贡献仍不清楚。假设DPV pUL36独特的N端1-400个氨基酸在病毒复制和致病性中起重要作用。本研究删除了DPV pUL36的N端1-400个氨基酸，以研究其在体外和体内的病毒复制作用，并评估了所得突变株的致病性及其作为减毒活疫苗的潜力。这些发现旨在阐明DPV pUL36 N端区域的功能意义，并提供一种通过删除400个氨基酸区分感染动物和接种疫苗动物的新型DPV疫苗候选株。

**材料与方法**
**伦理声明**
本研究中的所有动物实验均得到了四川农业大学机构动物护理和使用委员会的批准（协议许可号：SYXK 2019-187）。
**细胞和病毒的培养**
鸭胚成纤维细胞（DEFs）在37°C的培养箱（Thermo Fisher Scientific，3111，美国马里埃塔）中培养，培养基为含5% CO2的最小必需培养基（MEM；Gibco，上海，中国），并添加10%胎牛血清（FBS；NEWZERUM，CS500，上海，中国）。DPV CHv株（GenBank编号JQ647509.1）及其突变病毒在DEF细胞中生长。
**突变病毒的生成**
根据先前的描述（Wu等人，2023），使用RED同源重组系统构建了重组感染性克隆DPV-BAC-UL36-Δ400。简而言之，使用引物Δ400-F/R（北京青科生物技术有限公司）通过PCR扩增包含UL36 N端区域（1-400个氨基酸）侧翼序列和pEPKan-S质粒中的卡那霉素（Kan）抗性基因的DNA片段。纯化的PCR产物通过电穿孔转移到携带BAC-CHv-ΔminiF质粒的GS1783大肠杆菌细胞中。随后，通过阿拉伯糖诱导的重组切割掉KanR cassette。通过测序确认阳性重组克隆（北京青科生物技术有限公司），并将其命名为pDPV-BAC-UL36-Δ400。使用相同策略生成了回复突变质粒pDPV-BAC-UL36-R-Δ400（表1）。将感染性克隆质粒pDPV-BAC-UL36-Δ400和pDPV-BAC-UL36-R-Δ400转染到DEF细胞中以回收重组病毒。经过连续传代后，绿色荧光信号消失，获得了纯化的重组病毒Δ400和Δ400-R。

**表1. 重组病毒的引物设计**
| 引物名称 | 序列（5’-3’） |
|-----------|------------|
| Δ400-F | CTCGCTAATTAATCGTATCGGAGAGGTGACTAACTACAATGAGGGATCATAGGGATAACAGG | GTAATCGATTT |
| Δ400-R | CTCGACACGGATTTGCTTACTATTACAATTGGTTGATCCCTCATTGTAGTTAGTCACCTCTCCGATACGATTAGCCAGTGTTACAACCA | |
| | |
| R-△400-F | CTCGCTAATTAATCGTATCGGAGAGGTGACTAACTACAATGGCCGAACAGACGTCTACTR- | |
| | |
| | |
| Δ400-KanR | GCCGACACAGTAGCGCAAACTAACAGGGATCAACTAGGGATAACAGGGTAATCGATTT | |
| | |
| Δ400-KanR-R | AATCGATTACCCTGTTATCCCTGTTAGTTGATCCCTGTTAGTTTGCGCTACTGTGTCGGC△400-JD- | |
| | |
| | |
| | |
| Δ400-JD-R | GATTCTATGCGGCCCGGAAGG | |

**生长曲线**
将DEFs接种到24孔板中，以1或0.01的感染复数（MOI）浓度感染DPV Δ400、Δ400-R或野生型病毒。在感染后指定时间点收集全细胞样本，并使用Reed-Muench方法测定病毒滴度。随后生成病毒生长曲线。

**qRT-PCR分析**
将DEFs接种到24孔板中，以1或0.01的MOI浓度感染DPV Δ400、Δ400-R或野生型病毒。在指定时间点收集全细胞样本，并使用Tiangen生物技术有限公司（DP304-03，北京，中国）的Blood/Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit提取总病毒基因组DNA。通过针对UL30基因的TaqMan定量实时PCR（qRT-PCR；Bio-Rad Laboratories，CFX Connect，新加坡）定量病毒DNA水平（表2）。

**表2. qRT-PCR相关引物和探针**
| 引物名称 | 序列（5’-3’） |
|----------------|----------------_____|
| UL30-F | TTTTCCTCCTCCTCGCTGAGTUL | |
| UL30-R | GGGGTTTGCAGAAGT | |
| UL30-FAM | FAMFAM-CCCTGGGTACAAGCG-MG | |

**关于突变Δ400致病性的动物实验**
为评估体温、体重和存活率，将100只14日龄的雏鸭随机分为10组，每组10只。雏鸭分别肌肉注射DPV Δ400（10^5、10^6或10^7 TCID50/0.5 mL）、Δ400-R（10^5、10^6或10^7 TCID50/0.5 mL）、野生型病毒（10^5、10^6或10^7 TCID50/0.5 mL）或MEM作为空白对照。在感染后指定时间点记录体温、体重和存活率。为了评估病毒复制和组织病理变化，另外60只14日龄的雏鸭分为10组（每组6只），在感染后第3天和第5天收集大脑、脾脏和十二指肠的组织样本以测定病毒载量和进行组织病理检查。

**关于Δ400保护效果的动物实验**
为评估Δ400突变体的保护效果，将10只14日龄的雏鸭随机分为三组（每组10只）。雏鸭肌肉注射Δ400（10^5 TCID50/0.5 mL）、商业疫苗或MEM。免疫后第14天，用100 LD50的野生型病毒病毒株对雏鸭进行攻击。在攻击后10天内监测体温、体重和存活率。为了进行组织病理分析，另外9只14日龄的雏鸭分为三组（每组3只），在感染后第5天收集大脑、脾脏和十二指肠的组织样本进行组织病理检查。

**体内病毒载量定量**
使用Tiangen生物技术有限公司（DP304-03，北京，中国）的Blood/Cell/Tissue Genomic DNA Extraction Kit从匀浆组织样本中提取总DNA。使用UL30基因特异性引物和探针（表2）通过TaqMan定量PCR定量病毒基因组拷贝数。

**组织病理学**
将大脑、脾脏和十二指肠样本固定在10%甲醛中，然后进行分级乙醇脱水和二甲苯透明处理，再进行石蜡包埋。组织切片经苏木精和伊红（H&E）染色，并在光学显微镜下观察（Yijing Tong光学技术有限公司，BX53F2C，广州，中国）。

**中和抗体滴度测定**
为了确定不同免疫剂量是否影响Δ400突变体诱导的中和抗体反应，将15只14日龄的雏鸭分为三组（每组5只）。雏鸭分别肌肉注射Δ400，剂量为10^5、10^6或10^7 TCID50/0.5 mL。在感染后第7天和第14天收集血液样本，并在4°C下过夜孵育以获得血清。使用固定病毒-稀释血清方法测定中和抗体滴度。简而言之，将0.1 mL的两倍系列稀释血清（在56°C下热灭活30分钟）与等体积含有100 TCID50/0.1 mL的DPV混合。按照先前的方法确定中和活性（Ning等人，2022）。根据这些结果，选择10^5 TCID50/0.5 mL的Δ400剂量进行后续攻击和抗体动力学实验。相应地，将14日龄的雏鸭分为三组（每组5只），分别肌肉注射Δ400、商业疫苗或MEM。在感染后第3天、第5天、第7天、第14天和第28天收集血液样本，并测定中和抗体滴度。

**统计分析**
数据以平均值±标准误差（SEM）表示，所有图表均使用GraphPad Prism版本8生成。统计显著性用星号表示：* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。

**结果**
**Δ400突变体在体外的增殖特性**
pUL36及其同源物是疱疹病毒中最大的蛋白质，其中DPV pUL36在其同源物中最大（图1A）。为了研究DPV pUL36 N端400个氨基酸在病毒增殖中的作用，构建了一种缺乏pUL36 N端400个氨基酸的重组突变病毒（Δ400）及其相应的修复菌株（图1B）。

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**图1.**重组病毒的构建及体外突变株Δ400复制特性的评估。(A) DPV pUL36及其同源蛋白的氨基酸序列比对。(B) 重组病毒Δ400和Δ400-R的构建示意图。(C, E) 不同菌株的TCID50测定。(D, F) 不同菌株的基因组拷贝数测定。（* P < 0.05，** P < 0.01，**** P < 0.0001，ns：无显著差异）。如图1所示，在所有时间点上，Δ400突变株在鸭胚成纤维细胞（DEFs）中的生长动力学与野生型病毒在高感染复数（MOI）和低感染复数条件下相当，除了感染后24小时、MOI为0.01时（P > 0.1）。为了进一步评估病毒的增殖情况，通过qPCR量化了病毒基因组的拷贝数。图1显示，在MOI为1时，感染后24小时和36小时，Δ400突变株与野生型病毒之间的基因组拷贝数没有差异。同样，在感染后48小时、MOI为0.01时也没有检测到差异（P > 0.05）。这些结果表明，DPV pUL36的N末端400个氨基酸对病毒在体外的增殖并非必需。突变株Δ400在体内的毒力减弱。接种野生型DPV（作为阳性对照）的鸭雏表现出发烧和体重下降，而接种修复株Δ400-R的鸭雏则表现出与野生型组相似的剂量依赖性体重下降（P > 0.1）。相比之下，接种Δ400突变株的鸭雏即使在最高接种剂量下也没有表现出明显的不良临床症状，如体温升高或体重下降。与这些观察结果一致的是，接种野生型DPV的鸭雏在高剂量组中在感染后4-6天内死亡率约为50%。值得注意的是，接种Δ400突变株的鸭雏即使在最高剂量下也没有死亡（图2）。下载：下载高分辨率图片（663KB）下载：下载全尺寸图片图2. Δ400突变株的体内挑战实验。鸭雏分别接种了105 TCID50、106 TCID50和107 TCID50剂量的Δ400、Δ400-R和野生型病毒；在接种后10天内监测它们的体温、体重和存活率。突变株Δ400引起的病毒载量减少和病理损伤为了进一步评估Δ400突变株的体内复制能力和毒力，分析了不同组织中的病毒载量和组织病理学变化。通过针对DPV UL30基因的qPCR量化了病毒基因组的拷贝数。结果显示，Δ400突变株能够定植多个组织，类似于亲本株；然而，在高剂量组中，其在大脑、脾脏和十二指肠中的病毒载量低于野生型病毒（3天：大脑，P < 0.01；脾脏，P < 0.0001；十二指肠，P < 0.0001；5天：大脑，P < 0.0001；脾脏，P < 0.0001；十二指肠，P < 0.0001；图3）。下载：下载高分辨率图片（335KB）下载：下载全尺寸图片图3. 检测Δ400突变株的病毒载量。在感染后第3天和第5天，测定了接种107 TCID50病毒剂量的鸭雏的大脑、脾脏和十二指肠中的DPV UL30基因的拷贝数（** P < 0.01，**** P < 0.0001）。H&E染色的十二指肠、脾脏和大脑组织的组织病理学检查进一步揭示了不同病毒引起的组织损伤程度。野生型DPV感染导致了严重的病理病变，包括十二指肠中的肠绒毛破裂、杯状细胞萎缩和黏膜上皮脱落。在脾脏中，野生型DPV感染引起了广泛的细胞退化、坏死和分解，形成了空泡或网状结构。在大脑中，野生型DPV感染引起了网状基质的显著松弛、大量空泡样区域的形成（提示水肿）、神经元退化和坏死以及小胶质细胞和星形胶质细胞的增殖，这与病毒性脑炎一致。相比之下，接种Δ400突变株的鸭雏在所有检查的组织中表现出的组织病理学病变明显减少。这些发现表明，Δ400突变株保留了在体内的复制能力，但其引起的病理损伤比亲本DPV株减轻（图4）。下载：下载高分辨率图片（3MB）下载：下载全尺寸图片图4. 接种107 TCID50病毒剂量的鸭的十二指肠、脾脏和大脑的组织病理学特征。在感染后第5天收集这些组织进行组织病理学观察。Δ400的保护效果这些结果确认了Δ400突变株在体内的毒力减弱。我们进一步评估了其对致命挑战的保护效果。为了评估剂量依赖性的抗体反应，从接种了105、106或107 TCID50 Δ400突变株的鸭雏身上采集了血清样本。结果显示，这三种剂量都诱导了相似的中和抗体滴度（105 TCID50与106 TCID50，P > 0.1；105 TCID50与107 TCID50，P > 0.1；106 TCID50与107 TCID50，P > 0.1）。因此，选择了更具经济性的低剂量疫苗接种方案（10? TCID50）用于后续实验（图5A）。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片图5. μΔ400突变株的免疫学评估。(A) 鸭雏接种不同TCID50剂量的Δ400突变株，并在免疫后第7天和第14天测定中和抗体滴度。(B) 研究μΔ400突变株免疫保护效果的实验流程图：14天大的鸭雏接种105 TCID50的Δ400，然后在免疫后14天用100 LD50的毒力DPV株进行挑战感染。随后监测鸭雏的体温、体重和存活率，以及组织和器官的病理变化。(C) 挑战后的鸭雏体温监测。模拟组的所有鸭雏在第六天死亡，因此无法对后续时间点进行统计分析。因此，仅在最初的五天内对Δ400突变株组和模拟组之间进行了统计显著性分析。(D) 挑战后的鸭雏体重监测。同样，仅使用最初五天的数据对Δ400突变株组和模拟组进行统计比较。(E) 挑战后的鸭雏存活率监测。(F) 挑战后通过HE染色观察十二指肠和脾脏的病理变化。(** P < 0.01，**** P < 0.0001，ns：无显著差异)。14天大的鸭雏分别接种Δ400突变株（一种市售疫苗）或MEM作为模拟对照。免疫14天后，鸭雏肌肉内接种100 LD50的毒力DPV。在挑战后10天内监测体温和体重的变化以及存活率（图5B）。挑战后，MEM对照组的鸭雏表现出典型的DPV感染临床症状，包括食欲减退、嗜睡、不愿移动、羽毛蓬松和眼部分泌物。相比之下，接种Δ400突变株或市售疫苗的鸭雏保持临床正常。接种Δ400或市售疫苗的鸭雏的体温没有明显变化，并且体重增加明显优于对照组。相反，MEM组的鸭雏体温急剧升高但没有体重增加。此外，MEM组在毒力DPV挑战后死亡率很高，而所有接种Δ400或市售疫苗的鸭雏均存活并完全免于致命挑战（图5C-E）。进一步检查发现，接种Δ400或市售疫苗的鸭雏的器官中没有明显的肉眼可见病变。相比之下，MEM组的鸭雏在十二指肠和脾脏中表现出严重的出血性病变。挑战后5天对十二指肠和脾脏组织的组织病理学分析显示，接种Δ400或市售疫苗的鸭雏没有明显的病理变化。这些发现表明，Δ400突变株不仅安全，而且能够提供有效的保护，防止毒力DPV的挑战，同时不会引起不良反应或器官病变（图5F）。Δ400诱导高水平的中和抗体中和抗体是抗病毒感染体液免疫的关键效应因子。为了研究Δ400免疫鸭中观察到的保护效果是否与中和抗体反应有关，监测了Δ400突变株诱导的中和抗体滴度，并与市售疫苗诱导的滴度进行了比较（图6A）。早在免疫后5天就可以检测到中和抗体。此后抗体滴度持续升高，在整个观察期间，Δ400突变株诱导的中和抗体水平高于市售疫苗诱导的抗体水平（p < 0.0001）。这些结果表明Δ400引发了强烈而有效的体液免疫反应。综上所述，这些发现表明Δ400突变株是安全的、具有免疫原性的，并且能够提供针对毒力DPV挑战的有效保护，突显了其作为有前景疫苗候选物的潜力（图6B）。下载：下载高分辨率图片（179KB）下载：下载全尺寸图片图6. 确定Δ400突变株诱导的中和抗体滴度。(A) Δ400突变株诱导的中和抗体水平的实验流程图。(B) 14天大的鸭雏接种10? TCID50的Δ400突变株。在免疫后第3天和第5天以及第1、2、3和4周采集血液样本进行中和抗体测定。(**** P < 0.0001，ns：无显著差异)。讨论pUL36是一种在所有疱疹病毒中都保守的高分子量蛋白（Fan等人，2015）。该蛋白在病毒生命周期的多个阶段发挥着关键作用（Roberts等人，2009；Schipke等人，2012；Kelly等人，2014）。尽管pUL36及其同源蛋白在疱疹病毒中高度保守——尤其是在去泛素化酶（DUB）结构域中——但已有报道指出pUL36的功能缺陷会在体外对病毒复制产生不同的影响（Lee等人，2009；Huffmaster等人，2015；Mohnke等人，2022；Qi等人，2024）。值得注意的是，由于N末端额外多了400个氨基酸，DPV pUL36比其他疱疹病毒的同源蛋白更大，而这些氨基酸的功能尚不清楚。在这项研究中，通过删除DPV pUL36的N末端1-400个氨基酸片段构建了Δ400突变株。我们证明，删除这一区域对病毒在DEF细胞中的增殖没有明显影响。这些发现表明，pUL36的这一N末端区域对于病毒在DEF细胞中的复制是可省略的。在疱疹病毒研究中，对pUL30的体内研究主要集中在其在神经侵袭和中枢神经系统感染中的作用（B?ttcher等人，2007；Buch等人，2017；Bodda等人，2020）。然而，pUL30对不同宿主器官中病毒复制的整体影响及其在宿主-病原体相互作用中的贡献仍然不完全清楚。为了研究删除pUL36 N末端1-400个氨基酸对宿主反应的影响，本研究用三种不同剂量接种了Δ400突变株的鸭雏。结果显示，所有接种Δ400突变株的鸭雏都存活下来。此外，接种Δ400突变株的鸭雏表现出体温下降和体重显著增加。这些发现表明，这一氨基酸区域对DPV维持其毒力是必需的功能域，删除这一区域仅引起了轻微的炎症反应，而没有对宿主生长产生不良影响。尽管删除N末端1-400个氨基酸并未显著影响病毒在DEF细胞中的复制或DNA复制，我们进一步研究了体内病毒复制动态是否发生了变化。在这项实验中，在鸭雏安乐死后在指定时间点收集了组织样本。因此，为病毒载量和组织病理学病变的分析增加了每组三只鸭雏。已知DPV具有广泛的细胞趋向性，感染期间肠道、脾脏和大脑是主要靶器官（Proctor，1976；Li等人，2016）。因此，选择这些组织来分析病毒复制和病理变化。病毒基因组拷贝数的量化显示，在感染后3天和5天时，Δ400突变体在所有检测的组织中的病毒载量均低于野生型病毒，尽管病毒DNA水平仍相对较高。通过苏木精和伊红（H&E）染色进行的组织病理学检查表明，Δ400突变体的感染并未在这些器官中引起明显的病理病变。综合这些发现表明，Δ400突变体保留了体内的复制能力，同时表现出显著减弱的致病性。在其他疱疹病毒中，已证明UL36通过调节宿主的泛素化-去泛素化平衡来促进免疫逃避，从而抑制抗病毒效应分子的表达（Mohnke等人，2022；Ren等人，2023）。在体内环境中，宿主免疫系统会启动协调的先天性和适应性免疫反应来控制病毒感染。DPV pUL36的N端1-400个氨基酸的缺失可能会损害病毒的免疫逃避能力，导致病毒在宿主组织中的复制减少，并在病毒传播和宿主存活之间建立平衡状态。

鸭瘟（DP）仍然对全球鸭产业构成重大威胁，疫苗接种仍然是预防该疾病的最有效策略。先前的研究表明，灭活疫苗通常比减毒活疫苗引发的免疫保护作用较弱（Butterfield和Dardiri，1969）。自20世纪60年代商业减毒鸭瘟疫苗引入以来，尚未有新的减毒活疫苗获得批准使用（Yang等人，2025）。近年来，反向遗传学的进步使得重组DPV疫苗候选物的合理设计成为可能。多项研究报道，删除特定的病毒基因可以在保留免疫原性的同时降低DPV的毒力（Ning等人，2022；Wu等人，2022；Cao等人，2025）。然而，这些方法也遇到了一些挑战，例如接种疫苗的宿主会出现短暂发热或在体外培养过程中病毒产量减少（Ruan等人，2022；Wu等人，2023）。在本研究中，我们生成了Δ400突变体，该突变体在雏鸭中是安全的，且未引起任何可观察到的临床症状。重要的是，Δ400突变体在体外能够有效复制，其生长动力学与野生型病毒相当。这些特性突显了Δ400作为有前景的减毒活疫苗候选物的潜力。此外，其在细胞培养中的强复制能力表明，可以以相对较低的成本实现大规模疫苗生产，从而增强了其实际应用性和经济可行性。基于这些优势，我们进一步评估了Δ400对强毒DPV攻击的保护效果。在用强毒DPV株进行攻击后，接种Δ400疫苗的雏鸭得到了完全保护，既没有死亡也没有可检测到的器官病变。Δ400提供的保护水平与市售疫苗相当。值得注意的是，Δ400疫苗诱导的中和抗体水平明显高于市售疫苗。这可能是因为市售疫苗来源于鸡胚胎传代，这意味着其在雏鸭中的适应性不如Δ400突变体。因此，突变体产生的中和抗体水平高于市售疫苗。这些发现进一步支持Δ400作为安全、有效且具有免疫原性的疫苗候选物的潜力。

**结论**
总之，DPV pUL36的N端1-400个氨基酸区域是病毒体内毒力的关键决定因素，但在体外复制中并不是必需的。Δ400突变体能够有效抵御致命攻击，并诱导强烈的中和抗体反应。这些发现为DPV pUL36 N端区域在致病中的作用提供了新的见解，并支持Δ400突变体作为预防和控制鸭瘟的有希望的减毒活疫苗候选物。

**作者贡献**
Qiao Yang：数据整理、方法学、写作（初稿）。
Hongxin Yu：方法学、验证、写作（初稿）。
Lin Ai：方法学、验证。
Mingshu Wang：方法学。
Ying Wu：方法学。
Bin Tian：方法学。
Yitong Yang：验证。
Renyong Jia：验证。
Dekang Zhu：验证。
Shun Chen：验证。
Mafeng Liu：验证。
Xinxin Zhao：验证。
Shaqiu Zhang：验证。
Juan Huang：验证。
Xumin Ou：验证。
Di Sun：验证。
Yu He：可视化。
Zhen Wu：可视化。
Ling Zhang：可视化。
Yanling Yu：资源。
Anchun Cheng：资源。

**利益冲突声明**
作者声明没有可能被视为潜在利益冲突的财务或商业利益。

**作者贡献声明**
Qiao Yang：写作（初稿）、方法学、数据整理。
Hongxin Yu：写作（初稿）、验证、方法学。
Lin Ai：验证、方法学。
Mingshu Wang：方法学。
Ying Wu：方法学。
Bin Tian：方法学。
Yitong Yang：验证。
Renyong Jia：验证。
Dekang Zhu：验证。
Shun Chen：验证。
Mafeng Liu：验证。
Xinxin Zhao：验证。
Shaqiu Zhang：验证。
Juan Huang：验证。
Xumin Ou：验证。
Di Sun：可视化。
Yu He：可视化。
Zhen Wu：可视化。
Ling Zhang：资源。
Yanling Yu：资源。
Anchun Cheng：写作（审稿与编辑）、监督、资金争取。