与年龄相关的miR-30e-3p上调通过靶向DPY30，促使 laying hens（产蛋鸡）的卵巢卵泡颗粒细胞发生衰老

《Poultry Science》：Age-associated miR-30e-3p upregulation drives ovarian follicular granulosa cell senescence by targeting DPY30 in laying hens

　　袁航伟 | 王奕萱 | 廖彩梅 | 崔灿 | 张瑶 | 李传建 | 孙从娇 | 朱青 | 殷华东
中国四川省成都市611130，四川农业大学动物科学技术学院，猪禽繁育产业国家重点实验室

**摘要**
产蛋鸡的卵巢老化显著导致了后期产蛋性能的下降，这一过程伴随着miRNA-mRNA相互作用网络的广泛重塑，而这些网络是转录后调控的关键因素。在本研究中，我们探讨了先前被发现在产蛋鸡卵巢老化过程中显著上调的miR-30e-3p在卵泡膜细胞（GC）衰老中的作用。为了识别其下游效应因子，我们进行了mRNA转录组测序并筛选了下调基因。在潜在目标中，组蛋白甲基转移酶复合体的调节亚基dpy-30（DPY30）通过萤光素酶报告基因和表达分析被验证为miR-30e-3p的直接靶标。功能实验表明，miR-30e-3p显著抑制了GC的增殖并诱导了细胞周期停滞，而DPY30则表现出相反的效果。此外，抑制miR-30e-3p或过表达DPY30可以减轻D-半乳糖（D-gal）诱导的GC衰老。从机制上看，miR-30e-3p至少部分通过下调DPY30来促进细胞衰老。总体而言，我们的发现表明miR-30e-3p通过靶向DPY30在鸡卵巢卵泡中促进GC衰老，并提示miR-30e-3p和DPY30可能作为提高繁殖寿命和缓解家禽卵巢老化相关疾病的潜在生物标志物。

**引言**
产蛋鸡产业是全球重要的优质蛋白质来源，主要通过产蛋来实现。然而，与年龄相关的卵巢功能衰退显著降低了产蛋量并缩短了产蛋周期，从而降低了商业鸡群的经济可持续性（Amevor等，2021；Zhan等，2024）。因此，延长产蛋鸡的生产寿命并最大化每只鸡的终生产蛋量是家禽产业的关键目标（Hou等，2024）。因此，全面了解驱动卵巢老化的分子机制对于制定维持繁殖性能的策略至关重要（Park等，2021）。随着高通量测序技术的快速发展，miRNA和mRNA分析已成为解析卵巢老化调控网络的强大工具（Kim和You，2022；Rogers等，2025）。在我们之前的研究中，miRNA测序发现miR-30e-3p是唯一在整个产蛋鸡卵巢老化过程中持续显著上调的miRNA（350-700天），表明其可能是关键的调控因子（Wei等，2026）。据报道，miR-30e-3p可以抑制细胞增殖、迁移和侵袭，从而抑制头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的进展（Minemura等，2022）。此外，miR-30e-3p可能通过靶向PTEN来调节衰老及相关疾病，如阿尔茨海默病（AD）（Henriques等，2020）。然而，其在鸟类卵巢老化中的作用仍不明确。为了阐明其下游效应因子，我们进行了mRNA转录组测序，系统地识别了在卵巢老化过程中持续差异表达的转录本。mRNA测序已被广泛用于提供卵巢老化期间动态基因表达变化的全面概览，有助于识别参与激素生物合成、氧化应激和细胞周期调控的关键途径（Ma等，2020a）。在我们的RNA-seq数据集中，通过整合miRNA和mRNA表达谱，我们确定DPY30是miR-30e-30的唯一高置信度候选靶标基因。已知DPY30是组蛋白H3第4位赖氨酸（H3K4）甲基转移酶复合体的核心调节亚基，可促进H3K4甲基化，从而调节多种生物系统中的基因表达和细胞增殖（Dixit等，2022；Shah等，2019；Yang等，2016）。基于这一发现，我们构建了一个miRNA-mRNA调控网络，并确定了控制卵巢老化的核心节点。通过整合多组学数据，我们构建了一个假定的miR-30e-3p/DPY30调控轴，并假设miR-30e-3p可能通过靶向抑制DPY30来加速GC衰老。这一框架不仅增强了我们对卵巢老化的机制理解，还确定了miR-30e-3p和DPY30作为延缓繁殖衰老和延长产蛋鸡生产寿命的潜在干预靶点。

**材料与方法**
**动物伦理声明**
实验模型采用Jingfen No.6产蛋鸡，该品种具有高产蛋量、延长的产蛋高峰期以及长达700天的饲养周期，用于研究生理卵巢老化。这些鸡由北京华都峪口禽业有限公司提供，并在四川农业大学禽类育种场饲养。根据Jingfen No.6产蛋鸡饲养和管理手册（2022版）进行管理，光照时间为16小时光照和8小时黑暗，提供自由采食的日粮和清洁水。商业产蛋鸡基础饲料的组成详见表S1。所有动物实验严格遵循四川农业大学实验动物伦理委员会批准的相应指南和规定（批准号2022102006-3）。

**样本收集**
在整个饲养期间，持续监测实验鸡群的产蛋性能变化。根据产蛋性能随机选择个体鸡进行取样，未对鸡群进行额外分组。在350天、500天和700天时，按照之前的描述进行RNA测序（RNA-seq）的样本收集和时间点处理（Zhao等，2025a）。记录每只鸡的每周累计产蛋量，并计算整个鸡群的总体产蛋率。在每个选定的时间点，随机选择3只鸡进行组织取样。在安乐死前从翼静脉采集血液用于血清分析。死后立即打开腹腔并完整取出卵巢。从层状卵泡中分离出卵泡膜组织，按照既定协议分离并培养GC以进行后续功能分析（Zhao等，2025b），然后立即置于液氮中冷冻以进行RNA分离。此外，还收集了卵巢间质组织，并将其嵌入OCT化合物中进行冷冻切片和后续的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色。

**SA-β-gal染色**
使用Leica CM1860冷冻切片机（Leica Biosystems，德国韦茨拉尔）对OCT嵌入的卵巢组织进行冷冻切片和SA-β-gal染色。新鲜卵巢组织先用4%甲醛固定，通过蔗糖梯度脱水，然后嵌入OCT化合物，切片厚度为8-12 μm。染色前，切片短暂固定，用PBS冲洗，然后覆盖含有X-Gal、pH 6.0的柠檬酸/磷酸钠缓冲液和铁氰化物的新鲜制备的染色液。切片在37°C的潮湿环境中暗处孵育12-24小时。孵育后，用PBS终止染色反应，然后用显微镜（Olympus，日本东京）观察。对于GC的SA-β-gal染色，根据制造商的方案使用SA-β-gal染色试剂盒（Beyotime，上海）评估细胞衰老情况。

**RNA提取、逆转录和定量PCR（qPCR）**
为了研究基因表达，首先使用Tritozol试剂（Invitrogen，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德）从卵巢卵泡的层状组织或培养的GC中提取总RNA。随后使用DeNovix分光光度计（DeNovix，美国特拉华州威明顿）测量分离RNA的纯度和浓度。对于下游应用，合成互补DNA（cDNA）。具体来说，对于mRNA定量，使用PrimeScript? RT试剂盒（Perfect Real Time，TaKaRa，日本大津）处理总RNA。同时，使用Mir-X miRNA First-Strand Synthesis Kit（TaKaRa）专门生成miR-30e-3p分析的cDNA。然后在CFX Connect?实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国赫拉克勒斯）上进行定量PCR扩增，使用SYBR Green Master Mix（TaKaRa）。数据使用2-ΔΔCt方法进行分析，mRNA的相对表达水平相对于β-actin进行标准化，miRNA相对于U6进行标准化。本研究中使用的所有引物序列详见表S2。

**RNA-seq数据的生物信息学分析**
为了研究产蛋鸡卵巢老化的转录组变化，对每个年龄组的三个卵巢卵泡的层状组织进行了mRNA测序。质量验证后，使用oligo (dT) 磁珠富集poly(A)+转录本，随后进行片段化、双链cDNA合成、末端修复、接头连接和PCR富集以构建测序文库。在Illumina NovaSeq 6000平台（Illumina，美国加利福尼亚州圣地亚哥）上进行配对末端测序（150 bp）。使用fastp进行质量控制和接头修剪。清洁读段使用HISAT2（v2.0.5）与鸡参考基因组（GRCg7b）对齐。使用StringTie进行转录本组装和丰度估计，基因表达水平以每百万映射读段中的片段数（FPKM）表示。应用主成分分析（PCA）评估不同年龄组之间的全球转录组变异。使用DESeq2（1.20.0）进行年龄组间的差异表达分析，满足|log?FC| > 1和调整后的P值（padj）< 0.05的基因被视为显著差异表达。使用clusterProfiler R包（3.8.1）对差异表达基因（DEGs）进行基因本体（GO）功能富集和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析。为了进一步识别miR-30e-30的潜在靶标，将TargetScanHuman（8.0）、miRDB（v6.0）和DIANA-microT-CDS（v5）预测的靶基因与RNA-seq数据集中的下调基因进行交集，其中DPY30被确定为唯一的高置信度候选靶mRNA。

**RNA寡核苷酸合成和质粒构建**
miR-30e-3p模拟物、miR-30e-3p抑制剂、针对DPY30的小干扰RNA（siRNAs）及其相应的阴性对照由GenePharma（中国上海）设计并合成。将DPY30的编码序列克隆到pcDNA3.1(+)载体（Invitrogen）中以构建过表达质粒。所有寡核苷酸和质粒序列详见表S3。

**流式细胞周期分析**
将GC分离出来，分别与miR-30e-30模拟物、抑制剂、DPY30 siRNA或DPY30过表达质粒共转染48小时。然后细胞在4°C下用70%乙醇固定过夜。用PBS洗涤后，用含有RNase A的Propidium Iodide（PI）溶液染色，并在流式细胞仪（BD Biosciences，美国新泽西）上进行分析。使用ModFit LT软件确定细胞周期分布。

**5-乙炔基-2’-脱氧尿苷（EdU）检测**
根据制造商的说明，使用Cell-Light EdU C10310 Kit（RiboBio，中国广州）评估细胞增殖。GC与EdU试剂共培养3小时后，再用Apollo?染色溶液孵育。细胞核用Hoechst 33342复染。使用荧光显微镜（Olympus）捕捉图像，并使用ImageJ软件计算EdU阳性细胞的比例。

**Western Blot分析**
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液从GC中提取蛋白质。使用BCA蛋白检测试剂盒（Beyotime）测定蛋白质浓度。蛋白质通过SDS-PAGE分离并转移到PVDF膜上（Millipore）。膜在4°C下与针对MDM2、p53、p16和β-tubulin的一抗孵育过夜（详见表S4）。孵育后，使用ECL检测系统（Beyotime）可视化蛋白条带，并使用ImageJ软件进行定量。

**细胞计数-Kit 8检测**
通过CCK-8试剂盒（Beyotime）测量D-gal处理GC的最佳浓度。所有操作均按照制造商的方案进行。

**双萤光素酶报告基因检测**
将含有野生型（WT）或突变型（MT）miR-30e-30结合位点的DPY30 3’-非翻译区（3’ UTR）克隆到pEZX-FR02双萤光素酶报告基因载体（FulenGen，中国广州）中。GC与报告基因载体和miR-30e-30模拟物或阴性对照共转染。48小时后，使用双萤光素酶报告基因检测系统（Beyotime）测量萤光素酶活性。

**统计分析**
所有实验至少包含三个独立的生物学重复实验，数据以平均值±标准误差（SEM）表示。使用SPSS软件（版本19.0）进行统计分析。两组间的比较使用非配对双尾Student's t检验。对于多组比较，先进行单因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey的诚实显著差异（HSD）事后检验进行调整。P值< 0.05被认为是统计学上显著的。所有数据均使用GraphPad Prism（版本10）生成。结果：产蛋鸡卵巢衰老表型的特征分析
在350至700天期间，Jingfen No.6产蛋鸡的卵巢逐渐衰老，通过整合纵向测量的产蛋性能、血清激素谱、氧化应激标志物以及组织学衰老评估来表征这一过程。50周时产蛋率仍保持在90%以上，但在72周后迅速下降，到100周时降至61.24%，同时每周累计产蛋量也显著减少（P<0.05，图1A, B）。血清中的雌二醇和孕酮水平逐渐下降，表明卵巢内分泌功能减弱（P<0.05，图1C, D）。进一步分析显示，血清中丙二醛（MDA）含量随年龄增长而增加，同时关键抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-px和过氧化氢酶CAT）的活性下降，反映出氧化应激加剧（P<0.05，图1E-H）。卵巢切片的SA-β-gal染色直接证据证实了整个期间衰老的逐渐加重（P<0.05，图1I）。总体而言，这些结果表明，在350至700天期间，产蛋鸡的卵巢衰老表现为繁殖性能下降、性激素减少、氧化应激增加以及细胞衰老累积。

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图1. 产蛋周期中卵巢衰老表型的评估。(A) 19至100周产蛋期的每周产蛋率。(B) 三个产蛋阶段（48-50周、70-72周和98-100周）平均每周产蛋量比较。(C, D) 三个产蛋阶段（350天、500天和700天）的血清雌二醇和孕酮水平，n=9。(E) 三个产蛋阶段（350天、500天和700天）的血清MDA水平，n=9。(F-H) 不同产蛋阶段（350天、500天和700天）产蛋鸡血清中抗氧化系统（SOD、GSH-px、CAT）的活性。蓝色箭头表示正常细胞，红色箭头表示衰老的卵巢间质细胞，n=9。(I) 不同产蛋阶段（350天、500天和700天）卵巢间质中SA-β-gal阳性染色的相对比例，n=3，比例尺=100 μm。数据以平均值±标准误差表示。a-c P<0.05。

产蛋鸡卵巢衰老相关差异表达基因（DEGs）的表达谱分析
主成分分析（PCA）显示，从350天到700天，转录组谱逐渐分离，反映了卵巢在此期间的持续生理衰老（图2A）。火山图分析揭示了三个产蛋阶段之间的DEGs分布模式（图2B-D）。从350天到700天，细胞衰老相关基因的表达动态分析显示负调控因子（如BECN1、ATG3和SIRT）下调，而标记基因（如TP53、CDKN2A和NF-κB）上调（图2E）。共有146个基因在三个组间的所有配对比较中显著差异表达（图2F）。其中，1个DEG持续上调（P<0.01，图2G），27个DEG持续下调，随机选取了10个下调的mRNA进行展示（P<0.01，图2H）。

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图2. 350至700天龄产蛋鸡卵巢衰老的mRNA测序分析。(A) 三组RNA-seq数据的PCA。(B-D) 三组间DEGs的配对比较分析。(E) 350至700天间衰老相关标志基因的表达动态分析。(F) 350天、500天和700天mRNA的差异共表达分析（P<0.01）。(G) 在350至700天期间持续上调的mRNA（P<0.01）。(H) 在350至700天期间持续下调的代表性mRNA（P<0.01）。数据以平均值±标准误差表示。

产蛋鸡卵巢衰老相关DEGs的功能富集分析
GO富集分析揭示了与卵巢衰老密切相关的过程，包括类固醇生物合成和代谢、核糖体相关功能以及蛋白质翻译和修饰（图3A）。此外，KEGG富集分析表明，在产蛋鸡卵巢衰老过程中，细胞衰老、细胞周期和细胞外基质（ECM）信号通路被广泛激活（图3B）。这些结果在转录组水平上反映了不同阶段卵巢衰老的逐步动态变化，其中350天和700天之间的差异最为明显，涉及的生物学过程范围也更广。

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图3. DEGs的功能富集。(A) DEGs的GO富集分析。(C) DEGs的KEGG分析。

通过整合miRNA和mRNA测序识别与产蛋鸡卵巢衰老高度相关的miR-30e-3p/DPY30轴
在我们之前的研究中，对产蛋鸡卵巢衰老期间的miRNA进行了全面分析，发现多个miRNA在350至700天期间持续差异表达（Wei等人，2026年）。其中，miR-30e-3p是唯一在所有三个组中均显著且持续上调的miRNA，突显了其在卵巢衰老中的潜在重要性（P<0.01，图4A, B）。为了进一步研究miR-30e-3p的功能，本研究成功构建了miR-30e-3p模拟物和抑制剂，在体外培养的鸡卵泡颗粒细胞（GCs）中调节其表达水平（P<0.01，图4C）。随后，使用Targetscan、miRDB和DIANA预测miR-30e-3p的目标mRNAs，并与RNA-seq鉴定出的在三个组中持续下调的mRNAs一起进行筛选。然而，没有mRNA符合筛选标准（图S1）。因此，本研究将筛选范围缩小到700天组和350天组之间下调的DEGs，并鉴定出DPY30为在此条件下的唯一候选靶基因（P<0.01，图4D, E）。此外，通过双萤光素酶报告基因实验直接验证了miR-30e-3p在DPY30 3’ UTR上的结合位点（P<0.01，图4F, G）。最终，miR-30e-3p显著负调控DPY30的表达，miR-30e-30过表达时DPY30 mRNA水平下调，敲低时上调（P<0.05，图4H）。据此，本研究构建了DPY30过表达载体和小干扰RNA，其中siRNA3表现出最高的效率（P<0.01，图4I, J）。这些发现表明miR-30e-3p/DPY30轴与产蛋鸡的卵巢衰老密切相关，为后续的功能研究奠定了基础。

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图4. miRNA和mRNA测序的综合分析显示miR-30e-3p靶向DPY30。(A) miR-30e-3p是唯一从350天到700天持续上调的miRNA。(B) 350-700天期间miR-30e-3p的平均TPM值，n=3。(C) miR-30e-30模拟物或抑制剂的转染效率，n=9。(D) miR-30e-30靶mRNAs的整合预测。(E) 350-700天期间DPY30的平均TPM值，n=3。(F) 双萤光素酶报告基因实验表明miR-30e-3p直接结合DPY30，n=3。(G) 野生型或突变型DPY30萤光素酶报告基因的图示。(H) miR-30e-30模拟物或抑制剂调控的DPY30相对水平，n=9。(I, J) 在GCs中DPY30过表达或敲低的转染效率，n=9。数据以平均值±标准误差表示。*P<0.05, ??P<0.01, ns P>0.05。

miR-30e-3p抑制鸡颗粒细胞（GCs）的增殖并促进其衰老
鉴于细胞周期停滞是细胞衰老的标志（Ogrodnik, 2021），我们首先评估了miR-30e-3p对鸡颗粒细胞增殖的影响。结果显示，miR-30e-30过表达显著抑制了与细胞增殖相关的mRNAs（CCND1、CDK2、PCNA）的水平，而miR-30e-30抑制则显著增强了它们的表达（P<0.05，图5A, B）。流式细胞周期分析表明，miR-30e-30在GCs中的过表达导致细胞周期停滞在G0/G1阶段（P<0.05，图5C, D），而miR-30e-30敲低则促进细胞周期进入S+G2/M阶段，从而促进增殖（P<0.05，图5E, F）。此外，miR-30e-30模拟物显著减少了EdU阳性细胞的比例（P<0.01，图5G），而miR-30e-30抑制剂则产生了相反的效果（P<0.01，图5H）。这些结果共同表明miR-30e-30抑制了GCs的增殖。

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图5. miR-30e-3p在鸡颗粒细胞中诱导细胞周期停滞和衰老。miR-30e-30过表达（A）或干扰（B）对增殖相关基因（CCND1、CDK2和PCNA）的相对mRNA水平的影响，n=9。(C, D) miR-30e-30过表达导致颗粒细胞周期停滞，n=3。(E, F) miR-30e-30敲低促进细胞周期进展，n=3。miR-30e-30过表达（G）或抑制（H）后GCs的EdU阳性比例，n=3。miR-30e-30过表达（I）或干扰（J）后衰老相关基因（p16、p21和p53）的相对mRNA水平，n=9。(K) miR-30e-30过表达或抑制后GCs的相对SA-β-gal染色比例，n=3。(L) miR-30e-30过表达或干扰后衰老相关蛋白（p16、p53和MDM2）的相对水平，n=3。数据以平均值±标准误差表示。*P<0.05, ??P<0.01, ns P>0.05。

接下来，我们评估了miR-30e-30对鸡颗粒细胞衰老的直接影响。miR-30e-30模拟物显著增加了细胞衰老标志基因（p16、p21和p53）的表达水平（P<0.05，图5I），而miR-30e-30抑制剂抑制了它们的表达（P<0.01，图5J）。SA-β-gal染色显示，miR-30e-30模拟物在GCs中显著诱导了衰老表型，而miR-30e-30抑制剂显著降低了SA-β-gal活性（P<0.01，图5K）。此外，对衰老相关蛋白（MDM2、p53和p16）的分析表明，miR-30e-30模拟物显著抑制了MDM2的表达，MDM2是一种调节p53降解的蛋白，同时显著增加了p53和p16的水平；miR-30e-30抑制剂则产生了相反的效果（P<0.05，图5L）。这些结果表明miR-30e-30促进了GCs的衰老。

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图6. DPY30促进鸡颗粒细胞的增殖并抑制其衰老。miR-30过表达（A）或干扰（B）对增殖相关基因（CCND1、CDK2和PCNA）的相对mRNA水平的影响，n=9。(C, D) miR-30过表达导致颗粒细胞周期停滞，n=3。(E, F) miR-30敲低促进细胞周期进展，n=3。miR-30过表达（G）或抑制（H）后GCs的EdU阳性比例，n=3。miR-30过表达（I）或干扰（J）后衰老相关基因（p16、p21和p53）的相对mRNA水平，n=9。(K) miR-30过表达或抑制后GCs的相对SA-β-gal染色比例，n=3。(L) miR-30过表达或干扰后衰老相关蛋白（p16、p53和MDM2）的相对水平，n=3。数据以平均值±标准误差表示。*P<0.05, ??P<0.01, ns P>0.05。

miR-30e-30和DPY30对D-半乳糖（D-gal）诱导的鸡颗粒细胞衰老的影响
先前的研究利用D-半乳糖建立了鸡颗粒细胞的体外衰老模型（Dong等人，2022年），本研究通过参考其诱导条件进一步验证了这一模型。首先，我们检查了不同浓度D-半乳糖对GCs存活率的影响，发现200 mM D-半乳糖处理12小时更有效地抑制了细胞存活率，与先前的研究结果一致（P<0.05，图7A）。所有后续处理均使用此浓度来诱导GCs的衰老。随后，本研究证实D-半乳糖显著增强了SA-β-gal活性（P<0.01，图7B），并显著降低了EdU阳性GCs的比例（P<0.01，图7C）。D-半乳糖处理后MDM2蛋白水平下降，而p53和p16水平显著升高（P<0.05，图7D）。这些结果表明，使用D-半乳糖成功建立了鸡颗粒细胞的体外衰老模型。

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图7.miR-30e-3p和DPY30对D-gal诱导的鸡卵泡颗粒细胞（GCs）衰老的影响。(A) D-gal处理浓度的验证，n=6。(B) D-gal在GCs中诱导SA-β-gal活性，n=3。(C) D-gal降低GCs的细胞增殖能力，n=3。(D) GCs经D-gal处理后与衰老相关蛋白质（p16、p53和MDM2）的相对水平，n=3。(E) miR-30e-3p抑制剂减轻D-gal诱导的GCs衰老表型，n=3。(F) 打击miR-30e-3p可逆转D-gal诱导的颗粒细胞增殖能力下降，n=3。数据以均值±SEM表示。a-c P<0.05，*P<0.05，??P<0.01，ns P>0.05。基于这些发现，本研究进一步探讨了miR-30e-3p和DPY30对D-gal诱导的衰老GCs的影响。在D-gal处理12小时后，将miR-30e-3p抑制剂转染到GCs中。结果显示，D-gal诱导的衰老表型显著得到缓解（P<0.01，图7E），并且miR-30e-3p抑制剂恢复了D-gal对细胞增殖的抑制作用（P<0.01，图7F）。这些发现表明miR-30e-3p抑制剂能够挽救鸡卵泡GCs免受D-gal诱导的衰老。此外，DPY30在D-gal处理后过表达，并且发现其效果与miR-30e-3p抑制剂相似：减轻D-gal诱导的GCs衰老程度（P<0.01，图7G），并恢复被D-gal抑制的增殖活性（P<0.01，图7H）。这些结果表明DPY30的过表达也能改善鸡卵泡GCs的D-gal诱导的衰老。miR-30e-3p依赖于DPY30来抑制增殖并促进鸡卵泡GCs的衰老。

为了评估miR-30e-3p和DPY30在调节鸡卵泡GCs增殖和衰老中的作用，我们同时转染了ov-DPY30和miR-30e-3p模拟物，以及si-DPY30和miR-30e-3p抑制剂，然后评估了GCs的细胞衰老和增殖情况。研究发现，在DPY30过表达抑制SA-β-gal活性的条件下，miR-30e-3p模拟物能够抵消这种抑制作用，并在GCs中诱导更明显的衰老表型（P<0.01，图8A）。相反，miR-30e-3p抑制剂减轻了DPY30敲低引起的衰老表型（P<0.05，图8B）。同时，DPY30过表达对衰老相关蛋白质（MDM2、p53、p16）的调节作用部分被miR-30e-3p模拟物所拮抗（P<0.05，图8C），而DPY30敲低的效果在一定程度上被miR-30e-3p抑制剂所逆转（P<0.05，图8D）。此外，还发现miR-30e-3p和DPY30之间的相互作用也调节了GC的增殖。DPY30过表达对细胞增殖活性的促进作用被miR-30e-3p模拟物显著拮抗（P<0.05，图8E）；相反，DPY30敲低导致的EdU阳性细胞比例减少被miR-30e-3p抑制剂所缓解（P<0.05，图8F）。这些结果表明miR-30e-3p对GC增殖和衰老的调节作用是通过与DPY30的靶向相互作用来实现的。

讨论
在这项研究中，我们系统地阐明了miR-30e-3p在产蛋鸡卵巢卵泡GC衰老中的生物学功能和分子调控机制。在分析的miRNAs中，miR-30e-3p在整个卵巢老化过程中（350-700天）持续且显著上调。通过多数据库靶标预测结合转录组分析，我们将DPY30确定为高可信度候选靶基因。功能实验表明，miR-30e-3p抑制GC增殖并促进细胞衰老，而DPY30则具有相反的作用。双荧光素酶报告基因实验确认miR-30e-3p直接结合DPY30的3’UTR，挽救实验进一步证明miR-30e-3p对GC增殖和衰老的作用在很大程度上依赖于DPY30。此外，在D-gal诱导的GC衰老模型中，抑制miR-30e-3p或过表达DPY30显著缓解了衰老表型。综上所述，这些发现确定了miR-30e-3p/DPY30轴是卵巢GC衰老的关键调控途径。

卵巢老化是一个涉及多种细胞类型和信号通路协调调控的多因素生物过程（Ingole等人，2025年；Zhang等人，2026年）。作为卵巢卵泡的基本结构和功能组成部分，GCs在卵泡发育、类固醇生成和卵母细胞成熟中起关键作用（Wang，2025年）。越来越多的证据表明，GC衰老直接导致卵巢功能下降（Qu等人，2024年）。一致地，在我们的研究中，产蛋鸡的产蛋性能随年龄下降的同时，卵巢组织中的氧化应激水平升高，SA-β-gal阳性细胞数量也随年龄增加。这些观察表明，GC衰老是家禽卵巢功能衰退的根本细胞学基础，可能反映跨物种的卵巢老化共同特征（Wu等人，2025年）。miRNAs是转录后基因表达的核心调节因子，并与细胞衰老密切相关（Ma等人，2020b）。例如，miR-302b已被证明可以恢复衰老细胞的增殖，从而对抗小鼠的衰老（Bi等人，2025年）。在另一个背景下，EZH2介导的miR-139-5p沉默通过激活TOP2A来防止肝细胞癌细胞的衰老（Wang等人，2023年）。在本研究中，我们发现miR-30e-3p是在卵巢老化过程中持续上调的miRNA，表明其在这一过程中的潜在作用。这种miRNA属于miR-30家族（Huang等人，2023年），该家族还包括miR-30a（Hong等人，2024年；Tan等人，2019年）、miR-30b（Xiao等人，2026年；Xiao等人，2022年）和miR-30c（Bae等人，2021年；Zhang等人，2022年）等，并且已广泛参与细胞衰老。我们的结果表明，miR-30e-30过表达抑制GC增殖，诱导G0/G1细胞周期停滞，上调衰老相关标记物，并增强SA-β-gal活性，从而促进衰老表型。这些发现扩展了miR-30e-30的功能范围，并强调了其在卵巢老化中的重要性。我们进一步确定了DPY30是miR-30e-3的直接下游靶标。DPY30是SET1/MLL组蛋白甲基转移酶复合体的核心 component，负责H3K4甲基化，这是一种与转录激活相关的修饰（Lee等人，2021年；Su等人，2023年）。尽管DPY30已被证实参与干细胞自我更新和分化（Shah等人，2020年），但其在细胞衰老中的作用仅被初步阐明。目前的研究表明，在人类原代成纤维细胞中，DPY30敲低通过下调ID蛋白并随后激活p16诱导了强烈的衰老表型（Simboeck等人，2013年）。同样，在造血干细胞中，DPY30缺失导致代谢功能障碍、DNA损伤积累和p21上调，进一步支持其在维持细胞稳态中的重要作用（Yang等人，2019年）。总之，这些研究表明DPY30可以通过调节p16或p21的水平直接调节衰老相关信号通路。在这里，我们观察到在卵巢老化过程中DPY30持续下调，与miR-30e-3p表达呈显著负相关。功能分析表明，DPY30过表达促进GC增殖并减轻衰老，而其敲低则加速衰老表型。机制上，DPY30的作用与miR-30e-30观察到的调节作用相反，从而支持GC衰老中存在miR-30e-3p/DPY30调控级联的存在。

D-gal诱导的衰老模型常用于体外模拟氧化应激相关的细胞衰老（Ghanbari等人，2025年；Malekinejad等人，2025年）。在鸡卵泡GCs中使用这一模型，我们确认抑制miR-30e-3p或过表达DPY30可以有效缓解D-gal诱导的衰老并恢复增殖能力。此外，我们的研究揭示了产蛋鸡卵巢老化过程中miRNA-mRNA调控的时变动态，进一步强调了在复杂生物过程中考虑阶段特异性相互作用的重要性（Kim和You，2022年；Kim等人，2021年）。在要求所有三个时间点持续差异表达的严格筛选标准下，未发现候选靶基因。然而，当考虑阶段特异性差异表达（700天 vs 350天）时，DPY30成为高可信度靶标。这一发现表明，老化过程中的调控网络是时变的，某些关键调控轴可能在特定阶段而不是整个老化过程中起主导作用（Kaushik等人，2025年）。因此，在转录组分析中加入时间分辨率可能对于准确捕捉复杂生物过程中的关键调控分子至关重要（Morphis等人，2022年）。

结论
总之，本研究揭示了miR-30e-3p通过直接抑制DPY30来促进卵巢GC衰老的新分子机制（图9）。这些发现加深了我们对产蛋鸡卵巢老化调控网络的理解，并确定了延缓卵巢功能衰退的潜在分子靶标。鉴于延长产蛋周期的经济和环境重要性，调节miR-30e-3p/DPY30轴可能是一种有前景的策略，以增强繁殖寿命和支持产蛋鸡产业的可持续发展。