经过碱性-蒸汽预处理的欧洲梨（Pyrus communis）/甜瓜（Cucumis melo L.）果渣，通过使用耐乙醇微生物来优化生物乙醇的生产

《Process Biochemistry》：Alkali - steam pretreated Pyrus communis / Cucumis melo L. fruit wastes for optimized bioethanol production using ethanol-tolerant microbes

　　

Vidhyadevi Udayakumar | Brinda Lakshmi Anguraj

离子液体研究实验室，化学工程系，A.C. Tech校区，安娜大学，金奈，泰米尔纳德邦，印度 600025

摘要

纤维素生物乙醇的生产受到生物质抗性的阻碍，导致酶的 accessibility 较低，并在同时进行糖化和发酵（SSF）的过程中微生物活性降低。本研究通过结合碱辅助蒸汽爆炸（ASE）预处理和新型微生物分离株的过程，来解决这些限制，以提高糖化和发酵的协同效应以及工艺的稳定性。首次使用两种腐烂的水果废弃物——印度梨（IP）和香瓜（MM）作为纤维素生物乙醇生产的原料。这两种水果分别经过了温和的ASE预处理，去木质化率达到了77.57%和80.12%，这一结果通过SEM、TEM、XRD和FTIR分析得到验证，从而提高了纤维素的可利用性并降低了结构的抗性。从这两种水果废弃物中分离出的两种耐乙醇-葡萄糖的微生物株与面包酵母共培养，以提高发酵的抵抗力。生物乙醇的回收采用离子液体辅助蒸馏方法进行。在响应面方法（RSM）优化条件下，获得了如下结果：底物浓度为22.5 g/L（干重基），pH值为7，温度为37.5°C，发酵时间为72小时，IP的乙醇产率为6.4±12 g/l，MM的乙醇产率为8.8±2.0 g/l，这表明这些未被充分开发的水果残渣在纤维素乙醇生产中具有潜力。生物乙醇的生产性能可以通过改进的Gompertz模型进行有效描述（R2分别为0.9979和0.9987）。

引言

最近，朝着集成化、环保且成本效益高的生物质处理方向发展，以生产先进的生物燃料和生物产品，受到了广泛关注[1]。生物乙醇作为汽油的替代品，是一种可持续的可再生能源，可以减少温室气体排放和对化石燃料的依赖[2]、[3]。从木质纤维素废弃物（LCW）中生产生物乙醇是一种有前景的环保方法，能够解决可再生能源和废物管理的问题[1]、[4]。LCW原料包括作物残余物、秸秆、玉米秸秆、甘蔗渣、水果和蔬菜废弃物以及林业残余物[5]。即使经过后续的消费、储存和工业处理后，大约37%的农业废弃物仍是水果废弃物[6]。利用水果废弃物生产生物乙醇是一种有吸引力的绿色方法，因为它能够将这些大量且廉价的废弃物重新利用，转化为高附加值产品，从而推动循环生物经济的发展[7]、[8]。然而，诸如土地使用纠纷以及针对水果基原料的高效水解技术等障碍阻碍了其广泛应用，因此需要进一步研究来提升生物燃料在未来能源结构中的地位[4]、[9]。

印度是全球第三大香瓜（Cucumis Melo）生产和第九大梨（Pyruspashia）生产国。在印度，主要的果树种植州包括马哈拉施特拉邦、泰米尔纳德邦、卡纳塔克邦、安得拉邦、比哈尔邦、北方邦和古吉拉特邦[10]。根据印度国家园艺委员会2021-2022年的报告，香瓜是一种季节性作物，种植面积为70万公顷，产量为151万吨。2025年的数据显示，泰米尔纳德邦的香瓜种植面积为1.296万公顷。香瓜的果皮和种子是果汁加工厂的主要废弃物来源。大约33.33%的果汁加工厂使用总计20公斤的混合水果废弃物来制作果汁[11]。香瓜废弃物是一种优良的原料，因为它大量存在且含有的碳水化合物易于在发酵过程中被水解。目前，这些废弃物通常被直接丢弃，对环境造成危害[12]。梨也是一种未被充分利用的作物，因其营养价值而被重视。在印度，梨的种植面积覆盖了温带凉爽地区和亚热带地区，年产量为30万吨[13]、[14]。2025年，泰米尔纳德邦的梨种植面积为622公顷，产量为8014.54吨，这意味着每年可能产生约3.5万吨的废弃物[13]、[15]。将这些废弃物作为生物乙醇生产的潜在生物质来源是一种有前景的选择，可以为国家带来显著的经济收益。

水果果皮被视为LCW，因为它们含有纤维素、半纤维素和果胶等聚合物，而木质素的含量较低。这些成分通过强键结合形成稳定的结构，使其成为生产纤维素生物乙醇的潜在有用原料[16]。然而，关于像香瓜和印度梨这样的水果废弃物在乙醇发酵过程中的化学成分研究还很不充分[16]、[17]。此外，将LCW转化为生物乙醇包括以下步骤：生物质糖化以释放简单糖类，然后通过发酵和蒸馏回收产物，因此迫切需要寻找一种高效的一步法工艺。通过微生物发酵，复杂的碳水化合物（主要是纤维素和半纤维素）被转化为乙醇。近年来，由于水果废弃物的丰富性和可再生性，它们被越来越多地用于生物乙醇的生产。多种木质纤维素水果和农业废弃物，如甜瓜[18]、柑橘类[19]、香蕉[20]、菠萝[21]、芒果[22]、香蕉[22]、山药[23]、枣椰树[24]以及混合蔬菜废弃物[16]，都被探索作为低成本的纤维素原料用于生物乙醇生产。这些原料在生化组成上存在很大差异，这显著影响了它们的发酵能力和乙醇产量，尤其是在不同的预处理条件下（如酸水解[17]、[18]、酶水解[20]、[21]、物理处理[22]、[23]、蒸汽爆炸[25]、[26]以及组合预处理）。发酵通常使用高效的微生物（主要是酵母S. cerevisiae[17]、[27]、Metschnikowia sp、cibodasensis sp 和 Wickerhamomyces spp.[21]）、真菌（Aspergillus niger [23]、Trichoderma spp[29]）或细菌菌落（Bacillus spp.、[30]、乳酸菌 [31] 和 Escherichia coli [32]）或细菌和酵母的混合菌落[33]进行，以实现中等到高的糖转化率（通常为12 - 40 g/L），乙醇产量根据原料组成和微生物系统的不同，可达约386 mg/g，乙醇产率在0.39–0.50 g/g之间。总体而言，这些研究强调了基于水果的木质纤维素废弃物在糖释放和乙醇生产方面的广泛变异性，强调了优化预处理-微生物组合的必要性。

此外，Orozco等人的文献提供了对LCW-水果废弃物的详细表征，确定了影响糖化和发酵效率的关键成分。他们的研究结果表明，不同的糖浓度需要开发定制的微生物菌株以最大化乙醇产量[34]。这与Chohan等人的研究结果一致，后者强调了通过SSF对土豆皮废弃物进行价值化的过程优化必要性[35]。此外，比较单独的水解和发酵（SHF）过程与SSF过程的结果表明，SSF在时间效率和总产量方面具有优势。他们的研究表明，使用新型酶混合物和特定酵母菌株可以显著提高从复杂基底（如水果废弃物）中生产生物乙醇的效率[36]。在这项研究中，同时进行糖化和发酵（SSF）利用新型微生物菌株，突出了关键见解、现有的知识空白以及未来的研究方向。尽管SSF取得了进展，但在微生物的有效性和微生物相互作用的复杂性方面仍存在一些瓶颈，需要解决[22]。

基于上述考虑，本研究旨在消除与水果基LCW的SSF相关的障碍，并提出一种利用新型微生物进行环保生物乙醇生产的一步法方法。据我们所知，本研究首次针对性地分析了腐烂的印度梨和香瓜果皮作为乙醇生产原料的潜力。这些水果废弃物经过高效的二阶段序贯预处理（包括ASE预处理）， maximized 了木质素的提取，从而提高了SSF过程的效率，提高了乙醇产量。为了将预处理后的水果废弃物转化为生物乙醇，从这些废弃物中分离出了新的微生物。将这些新分离的微生物与S. cerevisiae共培养，并进行了广泛的SSF研究以生产生物乙醇。此外，为了找到最佳的SSF工艺条件，精确使用了响应面方法（RSM）来确定提高乙醇生产率和产量的工艺条件。还进行了基于改进的Gompertz模型的动力学研究，通过非线性回归分析阐明了生物质利用和葡萄糖及乙醇产量的细胞生长情况。

章节片段

材料

从印度泰米尔纳德邦金奈的当地市场随机购买了过熟腐烂的印度梨（IP）和香瓜（MM）作为发酵原料。所有用于实验的化学试剂和药品均为分析级，未经进一步纯化或处理，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。酵母菌株来自面包酵母粉。图1展示了该过程的概念流程

水果废弃物微生物的分离

首先在YEPG琼脂上培养来自降解的印度梨和香瓜样本的微生物分离株。使用涂布平板法培养出多个独立的菌落，然后通过划线平板法将其分离为纯培养物。经过这一严格的筛选过程，分别从梨和香瓜样本中分离出两个菌株，分别表示为A（图S1.a.所示）和B（图S1.b.所示）。这些分离株具备结合的水解和乙醇发酵能力

结论

本系统地证明了废弃的印度梨和香瓜果皮是生产环保生物乙醇的有前景的木质纤维素原料。碱辅助蒸汽爆炸预处理发挥了关键作用，有效地破坏了木质素-碳水化合物矩阵，印度梨的去木质化率为77.57%，香瓜的去木质化率为80.12%，显著提高了纤维素的可利用性和葡萄糖的释放量。通过使用S. cerevisiae（面包酵母）实现了集成的SSF工艺

CRediT作者贡献声明

Vidhyadevi Udayakumar：撰写——原始草稿、项目管理、方法论、研究设计、资金筹集、数据分析、数据管理、概念构思。ANGURAJ BRINDA LAKSHMI：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资源协调、研究设计、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们在这项工作中没有已知的利益冲突。