NMDA受体亚型的差异亲和力是精准神经精神医学的关键推动因素

《Progress in Neuro-Psychopharmacology and Biological Psychiatry》：NMDA receptor subtype differential affinity as a key enabler for precision neuropsychiatry

　　阿琳·弗雷森（Aline Freyssin）| 蕾娜·贝纳布（Reina Benabou）| 汉娜·佐伊·穆勒（Hanna Zoe Müller）| 萨拉·戴维斯（Sarah Davis）| 弗洛朗·佩兰-杜罗（Florent Perin-Dureau）| 蒂姆·丹克（Timm Danker）| 吉勒斯·鲁宾斯坦（Gilles Rubinstenn）
ReST Therapeutics公司，法国巴黎沃吉拉德街73号，邮编75006

摘要
尽管神经精神病学领域近年来取得了进展，但对于许多靶点的转化开发仍然具有挑战性，特别是当这些受体以具有复杂亚单位依赖性药理学特性的家族形式存在，并且存在安全性问题时。NMDA受体（NMDAR）拮抗剂就是这种情况的一个例子。R,S-氯胺酮（R,S-ketamine）就体现了这一问题：尽管它在临床上能迅速产生抗抑郁效果，但其使用受到解离性副作用和潜在的长期认知损害的限制。临床前研究还表明它与神经病理学改变（如奥尔尼病变OLney's lesions）有关。这些限制凸显了需要更深入的机制表征，而不仅仅是简单的受体抑制。

最近，我们研究了RST-01——一种新型氟烷基杂环胺类衍生物，作为早期创伤后应激障碍（PTSD）的潜在治疗方法。在临床前大鼠模型中，RST-01显示出疗效，且没有明显的解离现象，也没有引发奥尔尼病变，而后者是文献中报道的R,S-氯胺酮和美金刚（memantine）所特有的神经毒性标志。为了更好地理解这些安全性差异，我们检查了RST-01、氯胺酮和美金刚在临床前系统中的靶点结合特性。具体来说，我们评估了它们对不同NMDAR亚型的选择性。通过体外电生理学检测，我们测定了人类GluN1/GluN2A-D受体的IC50值，并采用多维分析方法比较了它们的亚单位选择性模式。研究结果表明，RST-01在四种GluN2亚型上的药理特征与其他两种化合物存在显著差异。当用多维空间表示时，RST-01的选择性特征比氯胺酮或美金刚更为明显。这种亚单位特异性的表征为解释临床前模型中观察到的不良反应谱和安全边际提供了机制上的依据，有助于开发出更安全、更具选择性的NMDAR靶向疗法。

引言
N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）是离子通道，由谷氨酸介导开闭，在人类大脑活动中起着关键作用。它们在中枢神经系统内具有多种功能，是大脑兴奋性突触传导的主要介质，有助于突触可塑性（Paoletti等人，2013年）。NMDAR在长时程增强（LTP）过程中尤为重要，这一过程涉及突触的强化和记忆的形成。然而，尽管经过了数十年的研究，由于过度激活和抑制这些受体所伴随的神经毒性效应，NMDAR的功能仍未完全了解。约翰·W·奥尔尼（John W. Olney）在1969年首次指出了这一复杂性，他发现高剂量的NMDA激动剂谷氨酸钠（MSG）会引起急性神经毒性变化，后来被称为奥尔尼病变。在他的开创性研究中，9天大的小鼠在单次皮下注射MSG（0.5–4 mg/g）后1至48小时内被处死。组织学检查显示，所有剂量下都出现了以细胞内水肿和神经元坏死为特征的病变（Olney，1969年）。奥尔尼及其同事后续的研究将这种观察结果扩展到了NMDA拮抗剂上。中等到高剂量的化合物如苯环利定（PCP）、MK-801、R,S-氯胺酮和替莱他明（tiletamine）也被证明会导致神经元空泡化，尤其是在后扣带回和后扣带回皮质（Olney等人，1989年；Olney等人，1991年）。短期暴露后，这些病变通常通过苏木精和伊红染色显示为可逆的；然而，长期或反复使用这些NMDA拮抗剂会导致受影响脑区的不可逆神经元坏死（Olney等人，1989年；Olney等人，1991年）。后续研究将这一现象扩展到了其他NMDA拮抗剂。例如，通常被认为在临床治疗范围内安全的美金刚，在成年大鼠脑中，剂量为20 mg/kg时也会引起轻微的神经毒性变化（Creeley等人，2008年）。

由于“奥尔尼病变”的发现及其对这一领域深远的影响，任何与NMDAR相互作用的新化合物在进入临床开发之前的监管审查都十分严格。特别是美国食品药品监督管理局（FDA）要求进行专门的临床前神经毒性评估，通常在大鼠中进行，以评估是否会引起奥尔尼类型的病变。因此，系统地评估神经元空泡化及相关组织病理学变化已成为NMDA靶向疗法转化开发中的关键步骤，即使该化合物的有效性已在小鼠中得到验证。

除了监管要求外，这种神经毒性评估还提供了关于NMDA拮抗剂安全性谱的重要比较视角，并有助于区分这一类药物中的不同化合物。然而，虽然这些研究提供了关于安全边际的信息，但它们本身并不能阐明差异性神经毒性的机制基础。要解决这些差异，需要更加精细、以精度为导向的靶点结合和受体亚型选择性研究，以便更好地理解驱动疗效和安全性的分子决定因素。

迄今为止，NMDA调节剂转化开发结果不尽如人意的部分原因可能与处理这一靶点复杂性的方法有关。这些问题包括用于电生理实验的必要实验范式无法反映神经元内外的去极化生理状态，以及不同动物物种之间的敏感性差异。NMDA的结构和功能在脊椎动物中普遍保守（Hedegaard等人，2012年），它由两个必需的GluN1亚单位以及两个可变亚单位GluN2（A–D）和GluN3（Paoletti等人，2013年；Hansen等人，2021年）组成。这些结构形成了对钠、钾和钙具有通透性的谷氨酸门控离子通道，从而促进突触后去极化并引发突触结构和功能的活性依赖性变化。例如，R,S-氯胺酮在GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B受体亚型上的IC50值约为GluN1/GluN2C和GluN1/GluN2D亚型的1.5倍（Dravid等人，2007年）。在啮齿动物和人类中测得的这些值处于相似的高亲和力范围内（Hedegaard等人，2012年）。然而，尽管具有这种选择性，R,S-氯胺酮治疗在抑郁症患者中仍比安慰剂更频繁地出现精神分裂样副作用（Short等人，2018年）。在静膜电位和生理[Mg2+]条件下，美金刚对含有GluN1/GluN2C和GluN1/GluN2D的NMDAR的选择性比GluN1/GluN2A和GluN1/GluN2B亚型高出6倍（Kotermanski和Johnson，2009a；Kotermanski和Johnson，2009b）。另一方面，美金刚被认为耐受性较好，已被批准用于治疗中度至重度阿尔茨海默病。它的副作用与R,S-氯胺酮相似，但较轻（Wild等人，2013年）。

最近，我们根据PTSD啮齿动物模型的临床前结果（使用小鼠和大鼠）描述了一种新设计的NMDA拮抗剂的特性。这种化合物RST-01被证明可以在体外、离体和体内特异性地结合NMDA受体（Salabert等人，2015年；Salabert等人，2018年；Beaurain等人，2019年）。RST-01最初以其同位素标记形式使用，具有独特的生物学特性：不仅其在大脑中的分布与NMDAR高度吻合，而且这种共定位在R,S-氯胺酮的竞争下会消失（Salabert等人，2015年）。通过在不同大鼠脑膜悬浮液中抑制[3H]TCP的结合，测定了RST-01和R,S-氯胺酮对NMDA PCP位点的亲和力。RST-01的IC50值在前脑为13 ± 9 μM，在额叶皮层为80.8 ± 15.1 μM，在海马体提取物中为52.9 ± 9.7 μM（Beaurain等人，2023年）。R,S-氯胺酮在皮层膜上的IC50值为38.4 μM，显示出对该位点的更高亲和力（Wong等人，1988年）。在临床前研究中，RST-01有助于恐惧消退学习，在恐惧条件反射模型中，与R,S-氯胺酮（在小鼠中）和美金刚（在大鼠中）相比，它可以减少行为绝望和焦虑（Chen等人，2021b；Chen等人，2021a），并且10 mg/kg的有效剂量下没有观察到嗜睡或解离效应。这些结果表明RST-01有进一步开发为PTSD、焦虑和情绪障碍等神经精神病治疗的潜力。

最近，一项针对RST-01的神经毒性研究表明，在给药后3小时和72小时，大鼠大脑中没有出现组织学变化。与文献中描述的MK-801（阳性对照）以及R-S-氯胺酮和美金刚不同，RST-01在雄性和雌性Crl:WI(Han)大鼠中口服给药10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg时未产生急性神经毒性（Olney等人，1989年；Creeley等人，2008年）。

R,S-氯胺酮、美金刚和RST-01在临床前模型中观察到的显著差异，特别是在神经精神和认知效应以及药代动力学谱方面，促使我们进一步研究它们的特异性。为了解决这些问题，我们实施了一种系统的体外电生理策略，旨在量化化合物对各个GluN2亚型的特异性。通过测量在表达人类受体变体的非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞中的重组GluN1/GluN2 NMDA受体上的IC50值，我们试图超越对NMDA拮抗作用的单一维度视图。这种多维方法为表征受体选择性提供了精细的框架，并提供了关于不同亚单位结合如何解释不同安全性和耐受性谱的机制洞察。

**体内程序**
本研究由Charles River实验室（研究编号32019423）根据美国卫生与公众服务部、食品药品监督管理局的联邦法规第21篇第58部分《非临床实验室研究的良好实验室规范》以及欧盟（OECD良好实验室规范原则）、日本（MHLW）和其他签署OECD相互认可协议的国家的规定进行。

**关于RST-01的急性神经毒性研究，在单次口服给药10 mg/kg、30 mg/kg和100 mg/kg后3小时和72小时，大鼠大脑的组织学观察中没有发现任何影响（图1）**。正如预期的那样，接受MK-801皮下注射的阳性对照组动物在给药后3小时在脑的扣带回和后扣带回皮质出现了神经元空泡化，以及扣带回、后扣带回皮质和/或梨状皮质中的神经元坏死。

**讨论**
在Crl:WI(Han)大鼠中单次口服给予10 mg/kg、30 mg/kg或100 mg/kg的RST-01后，未观察到任何可检测的神经毒性效应。相比之下，如R,S-氯胺酮和美金刚等NMDA拮抗剂在高达20 mg/kg的剂量下就被报道会引起神经毒性效应（Creeley等人，2008年；Olney等人，1989年）。进行这样的研究使我们能够根据在大鼠中确立的有效剂量来计算RST-01的安全边际。

### 作者贡献声明
阿琳·弗雷森（Aline Freyssin）：撰写——原始草稿、正式分析、概念化。
蕾娜·贝纳布（Reina Benabou）：撰写——审稿与编辑、验证。
汉娜·佐伊·穆勒（Hanna Zoe Müller）：方法学、数据管理。
萨拉·戴维斯（Sarah Davis）：验证、资源管理、方法学、正式分析。
弗洛朗·佩兰-杜罗（Florent Perin-Dureau）：验证、监督、资源管理、方法学、调查、正式分析。
吉勒斯·鲁宾斯坦（Gilles Rubinstenn）：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资金筹集。

**伦理声明**
所有实验均按照国家和机构关于动物研究和使用的指导方针进行。神经毒性研究由Charles River实验室（研究编号32019423）根据美国卫生与公众服务部、食品药品监督管理局的联邦法规第21篇第58部分《非临床实验室研究的良好实验室规范》进行，并得到了欧盟（OECD良好实验室规范原则）、日本（MHLW）及其他OECD相互认可国家的认可。

**利益冲突声明**
所有作者声明不存在利益冲突。

**致谢**
我们感谢蒂宾根大学自然与医学科学研究所（NMI）提供了人类重组NMDA的电生理数据。我们感谢巴黎高等师范学院生物学研究所（IBENS）的Chloé Geoffroy和Pierre Paoletti提供了啮齿动物重组NMDA的未发表电生理数据。我们还要感谢Charles River实验室进行了RST-01在大鼠中的急性神经毒性研究。