《Progress in Retinal and Eye Research》：Tracing the Journey from Histology to Imaging: Exploring the Retina and Choroid in Age-related Macular Degeneration
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年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球范围内导致视力丧失的主要原因，其发展由感光细胞-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体内部的复杂相互作用驱动。理解这些过程需要将活体成像与组织病理学证据相结合，因为二者为疾病机制提供了互补的见解。历史上，一些里程碑式的发现——
年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球范围内导致视力丧失的主要原因，其发展由感光细胞-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体内部的复杂相互作用驱动。理解这些过程需要将活体成像与组织病理学证据相结合，因为二者为疾病机制提供了互补的见解。历史上，一些里程碑式的发现——包括玻璃膜疣的特征、RPE的改变以及光学相干断层扫描（OCT）的引入——导致了AMD诊断和管理的重大范式转变。 多模态成像，特别是OCT和OCT血管成像（OCTA）的最新进展，使得能够以高分辨率、无创方式观察结构和血管变化，促进了临床相关生物标志物的识别。在组织学背景下解读时，这些影像学发现极大地增进了我们对AMD发病机制的理解，揭示了神经变性、外层视网膜功能障碍和血管损伤之间的动态相互作用。 在本综述中，我们综合了AMD的关键影像学特征及其组织病理学对应关系，强调了这种整合方法如何完善了疾病分类、改进了预后评估并为治疗策略提供了信息。我们进一步讨论了新兴的成像技术及其弥合组织水平病理学与临床实践之间差距的潜力。通过将历史性见解与当代进展联系起来，本综述为理解AMD及其管理提供了一个全面的框架。
论文主体内容总结
1.0. 引言
年龄相关性黄斑变性（AMD）是全球老年人群中不可逆的中心视力丧失的主要原因。该疾病以感光细胞-视网膜色素上皮（RPE）-脉络膜复合体的进行性功能障碍为特征，最终导致地图样萎缩（GA）或黄斑新生血管（MNV）。全面理解AMD潜在的结构和血管改变至关重要，不仅能阐明疾病机制，还能识别指导预后和治疗策略的生物标志物。 组织学历史上是AMD知识的基础，提供了视网膜、RPE和脉络膜改变的直接可视化。然而，尸检分析在捕捉纵向变化或代表疾病的完整临床谱系方面存在固有局限。 现代眼部成像技术的发展改变了这一格局，允许以前所未有的分辨率对结构和血管变化进行无创、活体评估。结构光学相干断层扫描（OCT）和OCT血管成像（OCTA）的引入使得临床医生和研究人员能够将组织学观察转化为可重复的成像生物标志物。这些方法不仅验证了先前的组织学发现，还扩展了我们对疾病动力学的理解，包括内层视网膜神经变性、外层视网膜和RPE易损性以及视网膜和脉络膜血管改变之间的相互作用。多模态成像突出了AMD病理学的异质性和地形特异性，加强了对空间分辨分析的需求。然而，视网膜成像也有其局限性，体外组织学和活体成像之间的相关性研究对于增进我们对疾病的理解至关重要。 本综述将通过多个领域（包括神经变性、感光细胞和RPE病理、视网膜和脉络膜血管变化以及病变特异性发现）整合组织学和影像学特征，提供AMD病理生理学的整合视角，并强调研究和临床实践的未来方向，特别是成像生物标志物在指导预后和新兴疗法方面的潜力。为了方便全面理解和针对性查阅，本综述按解剖结构组织，每个部分都整合了AMD的组织学特征和相应的影像学发现。
2.0. 眼的组织学
2.1. 获取眼组织学的技术
眼睛可以通过直接捐赠给研究人员或器官捐赠获得。眼球库收集捐赠者眼球并分发给研究人员。眼睛接收后，可以进行大体照相以评估存在的任何眼病理。然后可将眼睛处理为视网膜和RPE/脉络膜分离的平片，或进行冷冻保存用于横截面分析，还可打孔用于多组学研究。人类供体眼睛的保存方法取决于最终用途。如果需要进行平片分析，可在解剖视网膜前后固定眼睛。通常使用2%或4%多聚甲醛（PFA）固定用于免疫组织化学。对于脉络膜分析，RPE在固定前更容易去除。将RPE/脉络膜在1%乙二胺四乙酸（EDTA）中孵育90分钟，然后用移液器机械移除RPE。脉络膜随后在2-4% PFA中固定。用于超微结构分析（透射电子显微镜TEM）的眼睛最好固定在戊二醛/PFA混合液中。对于横截面分析，眼睛可通过蔗糖梯度冷冻保存或石蜡包埋。最终的固定方法和持续时间不仅取决于最终用途，也取决于眼球库的能力。
2.2. 获取组织学数据的挑战
获取AMD供体眼组织学的最大挑战是组织快速收集和适当固定。这对组织的适当保存是必需的。此外，许多人没有意识到眼睛可以捐赠用于研究。因此，可用眼睛的数量减少。鉴于像AMD这样的疾病的复杂性和年龄相关成分，系统性疾病也可能使人类供体眼的收集和分析复杂化。
3.0. 眼部成像
3.1. 用于研究AMD结构变化的眼部成像进展与局限
结构OCT是一种高分辨率成像方式，可以对视盘（ONH）和视网膜进行精确、客观的评估。它可以准确检测和量化细胞丢失，包括对特定细胞类型（如视网膜神经节细胞RGCs、感光细胞和RPE细胞）损伤的地形分布，使其成为临床和研究环境中的宝贵工具。 在OCT上，视网膜中具有强散射的层（尤其是富含线粒体的层，包括RGCs、感光细胞、RPE、内丛状层IPL和外丛状层OPL）表现为明亮（高反射）的条带。 RGC丢失导致视盘周围和黄斑区的视网膜神经纤维层（RNFL）变薄，以及神经节细胞层（GCL）变薄。一些OCT设备则测量神经节细胞复合体（GCC），它包括GCL和内丛状层（IPL），通常称为GC-IPL。这些测量有局限性：在晚期疾病中，“地板效应”限制了进一步可检测的变薄，结构损伤（尤其是晚期AMD）会增加分割误差，降低测量精度。 结构OCT也评估感光细胞和RPE的完整性。曾经被称为内节/外节连接（IS/OS）的条带——现在称为椭圆体区（EZ）——位于外核层和RPE之间，可能反映了富含线粒体的感光细胞内节。因此，感光细胞和RPE细胞在结构OCT上均表现为高反射条带。这些条带的反射率是细胞完整性的替代生物标志物，反射率降低表明感光细胞或RPE损伤。 使用结构OCT，RPE的状态主要通过基于共识确定的标准化术语进行定性评估。萎缩分类会议（CAM）联盟提出了四个基于OCT的术语来描述视网膜和RPE变性的不同阶段，每个术语都有组织病理学相关性支持：完全RPE和外层视网膜萎缩（cRORA）、不完全RPE和外层视网膜萎缩（iRORA）、完全外层视网膜萎缩（cORA）和不完全外层视网膜萎缩（iORA）。对于cRORA，CAM定义了严格的OCT标准。 RPE萎缩可以通过线性宽度或正面OCT分析来量化，后者可突出显示由RPE缺失引起的高透射缺陷。然而，评估和量化RPE萎缩存在若干局限性，包括分割误差、邻近结构干扰以及成像设备之间的差异。 使用结构OCT，RPE状态也可以通过更先进的方法学进行评估，例如光学衰减系数（OAC）的量化，它提供了独立于OCT系统影响和累积光衰减的局部组织特性信息。这种方法通过改善患病组织和正常组织之间的区分，可用于表征病理变化。然而，一个关键挑战是脉络膜血管的干扰。 感光细胞损伤也可以在OCT上评估，从范围和严重程度两方面，使用的方法大致分为基于反射率和基于分割的方法。基于反射率的方法依赖于EZ反射率与感光细胞损伤程度相关的假设。EZ反射率的降低或中断表现为正面OCT上的低反射区，并与感光细胞损伤相关，可能是细胞丢失前因线粒体活性降低而发生。一个关键优势是来自高密度扫描的正面EZ板能够进行二维地形分析，损伤范围从清晰的断裂到更渐进的反射率丢失。然而，EZ反射率受多种因素影响，包括感光细胞波导、光散射以及技术变量。一个关键限制是受试者内变异性，这可能阻碍比较。为了缓解这一点，研究通常使用玻璃体和RNFL作为低反射率和高反射率参考来标准化反射率。评估感光细胞时另一个需要考虑的重要点是存在玻璃膜疣时分割误差的可能性，玻璃膜疣可能表现出可变的反射率和不同程度的覆盖RPE丢失，从而增加了准确定义边界的难度。 基于分割的方法基于OCT能够精确可视化和测量视网膜层的前提。然而，关于选择用于测量的解剖边界，文献中存在相当大的异质性。这些方法都有局限性，最重要的是在许多AMD病例中，特别是在存在萎缩前变化的情况下，这些边界可能难以或无法描绘。 EZ层也可以使用各种描述性术语进行定性评估；然而，此类方法缺乏标准化和可重复性。主观评估通常仅限于中心子区域，因为对整个黄斑扫描进行全面评估仍然具有挑战性。此外，EZ异常的定性解释不允许对随时间变化的可量化监测，这突显了对客观测量方法的需求。 外核层（ONL）厚度已成为评估感光细胞完整性的有价值的替代生物标志物。重要的是，即使当其他外层视网膜标志物（如EZ）不再可辨别时，ONL厚度通常也能可靠地量化。在存在广泛的下视网膜玻璃膜疣沉积物（SDD）和萎缩前变化时通常如此，尤其是在GA的边界，这是一个评估感光细胞保存情况的临床和研究兴趣区域。然而，即使对于这种评估，仍然存在若干挑战。标准OCT成像可能由于包含了Henle纤维层而高估了真实的ONL厚度，这突显了仔细分割或使用定向OCT来区分这些层的必要性。此外，扫描方向的微小变化会影响测量精度。最后，在某些AMD眼中，特别是在玻璃膜疣附近，描述了明显的ONL增厚现象。这种“矛盾性”增厚被认为是反映早期感光细胞应激，而不是结构恢复或功能改善。在使用ONL厚度时需要考虑的一个重要警告是，作为AMD中视网膜重塑的一部分，Müller细胞核从INL迁移。 视网膜和RPE细胞也可以通过自适应光学（AO）以高分辨率可视化，AO是一种成像技术，它使用波前传感器来检测眼光学像差，并使用可变形镜来补偿它们，从而增强视网膜成像性能。AO已广泛应用于评估感光细胞。 眼底自发荧光（FAF）是评估感光细胞和RPE损伤的另一项有价值的技术。该成像方式用于记录视网膜自发荧光。一种称为脂褐素的荧光团混合物主要负责在眼后段产生最强的自发荧光信号。因此，FAF可作为估计RPE内脂褐素浓度的可靠指标。FAF已被广泛用于地形评估感光细胞和RPE损伤。RPE丢失可能在FAF图像上显示为自发荧光信号降低的区域。相反，RPE保存和感光细胞丢失的区域往往由于黄斑或光色素缺失导致的“窗口缺损”而表现出增强的自发荧光信号。
3.2. 用于研究AMD血管变化的眼部成像进展与局限
在AMD中，眼部血管可能受到显著影响。虽然荧光素血管造影（FA）和吲哚青绿血管造影（ICGA）历史上一直是评估视网膜和脉络膜血管的活体金标准，但光学相干断层扫描血管成像（OCTA）的出现极大地增强了我们可视化和研究这些血管网络的能力。由于其多重优势，OCTA已广泛应用于AMD研究和临床评估。 结构OCT通过不同视网膜位置的连续B扫描获取三维视网膜图像。相比之下，OCTA在固定位置执行多次重复B扫描，并分析由红细胞运动引起的信号变化。该技术能够以改进的深度分辨率对深层血管网络进行详细成像。OCTA可以清晰描绘浅层毛细血管丛（SCP）、中层毛细血管丛（ICP）、深层毛细血管丛（DCP），以及视盘周围RNFL内的放射状视盘周围毛细血管丛。此外，它还提供了脉络膜毛细血管（CC）的综合成像。 鉴于脉络膜在AMD发病机制中的核心作用，OCTA已被广泛用于研究CC层，而在评估外层脉络膜血管方面其使用有限。脉络膜毛细血管OCTA图像通常显示“血流空隙”，这些是小的暗区，可能对应于毛细血管间空隙，散布在代表灌注组织的较亮区域之间。许多研究使用术语“信号空隙”来识别，因为难以区分真正的血流缺失和血流低于去相关阈值的区域。总体而言，CC评估有几个局限性，包括缺乏标准化的脉络膜毛细血管层分割、阈值化和二值化的变异性、OCTA相关伪影以及信号透射缺陷。 成像伪影是OCTA评估中的一个显著限制。最常见的是人工OCTA信号和分割误差。信号强度降低（通常与AMD患者不稳定的固视有关）会降低信噪比，增加图像噪声并产生人工血流信号。分割误差发生在正面OCTA图像通过基于反射率或纹理定义视网膜或脉络膜结构内的两个边界生成时。在像AMD这样的病理条件下，这些参数可能发生改变，使准确的边界检测复杂化。 此外，通常与AMD相关的病变，如玻璃膜疣和低色素或高色素区域，会产生阴影伪影。在这方面，扫频光源（SS）OCTA系统由于其更长的波长，提供了通过RPE的改进穿透，减少了阴影伪影的影响，并增强了AMD眼中CC的可视化，这主要是由于在较长波长下视网膜组织中光学散射减少。此外，量化CC灌注涉及多种算法，包括用于CC可视化的板、二值化阈值、亮度/对比度调整以及使用结构信息补偿信号衰减的方法。二值化是将灰度图像转换为二值（黑白）图像的过程，能够量化黑白像素的比例以评估血流和无血流区域。此外，一些算法还考虑了由过度高度散射材料（如钙化玻璃膜疣）引起的拖尾效应。 CC OCTA评估的主要局限性之一是各研究中使用的方法学存在显著异质性，这可能导致结果存在重大不一致，尽管已有已发布的指南推荐CC评估的最佳实践。最近的一项系统综述通过分析102项使用OCTA研究AMD中CC评估的研究解决了这个问题。该综述揭示了成像方案和后处理技术方面的相当大的变异性，突显了对方法学标准化的迫切需求，以提高研究的可重复性和可比性。 扫描尺寸和分辨率也各不相同，3x3毫米和6x6毫米扫描是最常用的，导致了侧向分辨率和视野的差异。重要的是，眼轴长度影响图像缩放，因此相同的标称扫描尺寸在不同患者之间并不覆盖完全相同的视网膜区域。因此，如果不校正这种放大效应，计算出的血流空隙面积可能不准确。 在87项研究中进行了定量分析，图像二值化方法不一致。虽然局部阈值化，特别是Phansalkar方法，被认为是AMD的优选，但仅在少数情况下使用。重要的是，所选的阈值可能显著影响结果。使评估进一步复杂化的是，在使用局部阈值化时，所选半径可能显著影响结果，先前的研究已经调查了评估CC的最佳参数。另一个可以影响结果的因素是在CC评估中应用补偿策略，以考虑由玻璃膜疣等上层结构引起的信号损失。此外，一些研究应用任意尺寸截断来定义“真实”的血流空隙，从而忽略了血流空隙大小的自然幂律分布，并使得统计度量（如平均值）不那么有意义。此外，术语和指标的差异进一步复杂化了跨研究比较。这些发现强调了在CC成像中进行方法学标准化的迫切需求，以提高可重复性并支持OCTA在AMD中的临床和研究应用。总体而言，CC灌注的准确定量需要最佳的光学条件、精确的解剖分割和稳健的图像处理方法。 在AMD中，外层脉络膜主要通过结构OCT使用不同参数进行研究，包括脉络膜厚度和体积以及脉络膜血管指数，这是OCT衍生的脉络膜腔面积/总体积/体积的估计比率。
4.0. AMD中的内层视网膜神经变性
尽管AMD传统上被认为是一种主要针对外层视网膜、RPE和脉络膜的疾病，但来自先进成像方式和组织学分析的越来越多的证据表明，内层视网膜在疾病过程中也受到影响。本节将探讨支持AMD中内层视网膜改变的关键影像学和组织病理学发现。 线粒体功能障碍越来越被认为是AMD发病机制的一个关键因素。研究表明AMD中线粒体功能受损，导致细胞易损性和疾病进展。鉴于RGCs具有高代谢活性并依赖于线粒体能量，这种功能障碍可能是AMD内层视网膜变化的基础。探索这种联系可能产生对AMD相关神经变性的新见解。
4.1. AMD影响内层视网膜的影像学证据
4.1.1. 早期/中期AMD
结构OCT研究揭示了在AMD早期和中期阶段就开始的内层视网膜的显著改变。这些变化最常见于神经节细胞层（GCL）和内丛状层（IPL），还有证据涉及视网膜神经纤维层（RNFL）和内颗粒层（INL）。 研究发现，与健康对照组相比，中期AMD眼的黄斑神经节细胞复合体（GCC）厚度和RNFL厚度均减少。他们还报道了平均黄斑GCC厚度与玻璃膜疣面积呈负相关。此外，描述了AMD眼中GCC变薄的一种独特的环状模式。 一项包括25项研究的系统综述和荟萃分析发现，在中期AMD眼中，视盘周围RNFL厚度和黄斑RNFL-GCL-IPL厚度显著减少。作者还指出，设备变异性和方法学的不一致在研究间引入了显著的异质性，强调了标准化成像方案和结果测量的重要性。 INL受到的关注相对较少，结果仍不一致。虽然两项研究报告了早期/中期AMD阶段的一般性INL变薄，但其他三项研究发现与正常眼相比没有显著差异。这些相互矛盾的结果可能归因于粗略的采样技术，这限制了检测与正常衰老不同的AMD相关微妙变化的能力。 在AMD中，内层视网膜变性也被研究用作内层视网膜反射率作为结构生物标志物。内层视网膜反射率被认为是微观结构完整性的标志，包括视网膜GC线粒体和周围的细胞骨架元素。这个成像指标可能比厚度变化更早地检测到神经元丢失。最近一项关于中期AMD患者的研究表明，内层视网膜反射率的下降速度是厚度下降速度的11倍，这表明它可能作为疾病进展的更敏感、更早的生物标志物。 基于内层和外层视网膜损伤都可能发生在中期AMD的证据，一项研究旨在探索这些眼中内层视网膜变薄与外层视网膜改变之间的关系。作者测量了正常眼和中期AMD眼的GCC厚度和EZ反射率，将它们分别视为内层和外层视网膜完整性的标志。该研究揭示了在中期AMD眼中GCC厚度和EZ反射率之间存在强线性相关，这种关联在健康对照组中未观察到。这些发现表明，在中期AMD中，内层和外层神经视网膜结构之间存在潜在的病理联系，并为“感受器后功能丧失假说”作为这种情况下内层视网膜神经变性的合理解释提供了支持。
4.1.2. 晚期AMD
结构OCT已被广泛用于研究晚期AMD眼中的内层视网膜形态变化，包括新生血管性AMD和地图样萎缩。 在未经治疗的nAMD中，一项关键的结构OCT研究表明，GCC在整个黄斑区（而不仅限于MNV区域）显著变薄。作者认为，这种变薄可能是由于感光细胞变性导致内层视网膜输入长期减少，从而导致经神经元变性。然而，后一项研究没有提供MNV区域与感光细胞丢失和GCC变薄区域的拓扑比较分析。另一种解释——“感受器后缺血假说”——提出脉络膜微血管功能不全可能导致继发性感受器后损伤。 在一项相关研究中，分析了接受玻璃体内抗VEGF治疗的nAMD眼中的内层视网膜变化。他们观察到在12个月内内层视网膜进行性变薄，特别是RNFL和GCC。鉴于VEGF已知的神经营养和神经保护作用，作者假设长期抑制VEGF可能导致神经元丢失和内层视网膜变薄。然而，不幸的是，缺乏对未接受抗VEGF治疗的nAMD患者自然史进行研究的纵向研究。因此，无法确定观察到的内层视网膜变化是治疗相关的还是疾病自然过程的一部分。然而，重要的是要注意，AMD的自然进展也可能导致内层视网膜变薄。 一项更近期的纵向OCT研究调查了从中期过渡到nAMD的眼睛中内层视网膜的改变。作者报告了，与之前眼睛仍表现为中期AMD的访视相比，在MNV发作时内层视网膜厚度增加，这可能归因于视网膜内渗出。一年后——抗VEGF治疗后渗出消退——内层视网膜显示出显著变薄。这些发现表明，一旦渗出成分消退，神经元丢失变得更加明显。在一年的随访中，内层视网膜变薄与结构OCT生物标志物，特别是与外限制膜损伤呈强相关，这支持了感受器后假说。由于渗出引起的机械应激也可能有贡献。支持这一点，基线时存在视网膜内液（IRF）被确定为随后内层视网膜变薄的关键预测因子，可能是由于感光细胞和神经节细胞之间突触连
