巴西西部河水中自由生活的变形虫多样性及其体外和体内的致病潜力

《Protist》：Free-living amoeba diversity in river waters of western Brazil and their in vitro and in vivo pathogenic potential

　　阿曼达·卡多佐·丰塞卡·莱莫斯|伊万·路易斯·桑托斯·达·克鲁斯|伊瓦尼·索萨·梅洛|伊布拉伊姆·范廷·克鲁兹|马克斯·安东尼奥·索亚雷斯1
生物技术和微生物生态学实验室（LABEM），马托格罗索联邦大学生物科学研究所，费尔南多·科雷亚·达·科斯塔大道2367号，库亚巴，MT 78060-900，巴西

**摘要**
自由生活的阿米巴（FLA）是水生和陆地生态系统中的关键组成部分，但它们在巴西中西部的多样性和分布情况仍然知之甚少。一些FLA具有病原性，可能携带对公共卫生有影响的细菌。本研究旨在识别并表征库亚巴河流域的FLA生物多样性，并推断其潜在的病原性。我们在两个水质周期内从八个地点收集了水样，并测量了物理化学和微生物参数。通过使用含有热灭活大肠杆菌的营养琼脂培养基分离出FLA，并通过形态学和分子标记进行鉴定。共分离出39株FLA（属于6个属和14个物种）；其中锥虫阿米巴（Acanthamoeba）占比最高（51.3%），其次是Vannella（23.1%）和Vermamoeba（12.8%）。无论是在高水位期（检测到4种特有物种）还是低水位期（检测到9种特有物种），都仅检测到了V. vermiformis。有17株FLA能够杀死斑马鱼幼苗（Danio rerio）；其中11株（64.7%）属于锥虫阿米巴属。FLA的耐热性和耐渗透压性与斑马鱼幼苗的死亡率无关。这些发现扩展了目前对巴西FLA生物多样性的认识，并强调了在库亚巴河流域进行综合监测的必要性。

**1. 引言**
自由生活的阿米巴（FLA）是一类单细胞真核原生生物，可能具有多系起源。根据形态学、生物化学和分子证据，FLA被归类为Excavata和Amoebozoa超群（Shi等人，2021；Tekle等人，2008）。这些生物通过伪足移动，某些谱系（尤其是Excavata亚群中的）还具备鞭毛阶段。伪足的形态表明它们在功能上适应了特定的生态位（Aguilar和Lado，2012）。尽管FLA主要以自由生活的方式存在，但某些物种表现出两栖行为，在有利条件下可能成为人类和其他动物的机会性病原体（Fan等人，2024）。FLA具有三种主要的形态阶段：滋养体、囊肿以及某些类群的鞭毛形态。滋养体是代谢活跃的生理阶段，使FLA能够摄取营养、生长和繁殖；囊肿是许多物种在环境压力下发展出的生存策略，其厚实的耐受性囊壁有助于FLA耐受极端pH值、温度、干燥以及消毒剂（如氯、热和紫外线辐射）（Bornier等人，2021；Salazar-Ardiles等人，2022）。在某些物种（如Naegleria fowleri）中，鞭毛阶段有助于其在水环境中的扩散（Siddiqui等人，2016）。这种形态功能的可塑性赋予了FLA生存、扩散和定植的能力。FLA分布广泛，可栖息于多种环境中（Bornier等人，2021；Shi等人，2021）。它们常见于自然水生生态系统（湖泊、河流和海洋区域）以及陆地栖息地（土壤），甚至也在大气中被发现。这种生态多样性使FLA能够在极端条件下生存，包括极地融化水、干旱地区和高度生物多样化的生态系统（Vingataramin等人，2024）。除了自然环境外，FLA还经常在人工环境中被分离出来，如饮用水系统、冷却塔、游泳池和污水处理厂。FLA常存在于水网络中的生物膜中，与多种微生物共存，利用这些结构作为营养来源并获得附着表面的部分保护（Scheid，2018）。FLA对生态系统服务至关重要，如有机物分解和养分循环，并调节各种生态系统中的微生物种群（Dinda等人，2024）。例如，湿地中的Hyalospheniidae科成员被提议作为环境生物指示物。FLA与细菌之间的相互作用通过捕食、在生物膜中的庇护以及促进水平基因转移来影响微生物群落（Abu Khweek和Amer，2018）。一些FLA（如锥虫阿米巴属、Balamuthia mandrillaris和Naegleria fowleri）具有两栖性，既能在环境中自由生活，也能寄生在人类和其他动物体内并引起严重感染（Hendiger-Rizo等人，2024）。这些阿米巴可作为病原微生物的储存库，为其提供保护，并在某些情况下增加其毒力（Scheid，2018）。全球范围内已检测到耐热性和潜在致病的FLA物种，气候变化和人为压力可能导致这些物种的增殖，从而增加人类接触的风险（Abdul Majid等人，2017）。缓解这些风险需要一种整合生物多样性、致病性、气候和公共卫生的整体方法（Salazar-Ardiles等人，2022）。FLA感染通常导致高死亡率、诊断困难和治疗选择有限，这突显了开发稳健实验模型的必要性（Kofman和Guarner，2022）。体外模型使用宿主细胞可以更好地控制实验变量，通过高通量筛选评估FLA，并研究宿主-寄生虫相互作用机制（Guerlais等人，2024）。然而，细胞培养无法完全模拟免疫反应或药代动力学，且毒力可能因培养条件而异。体内哺乳动物模型有助于评估毒力、疾病进展和治疗效果，但涉及较高的成本和伦理限制。替代方案包括体外系统和更易于处理的替代生物（Shi等人，2024）。斑马鱼（Danio rerio）具有幼体透明性、功能性先天免疫系统以及支持实时成像和筛选的遗传工具，作为中间模型可减少对哺乳动物的依赖（Barbosa等人，2025）。近年来，关于巴西FLA多样性的认识有所增加，其中锥虫阿米巴属的记录最为丰富，其次是Naegleria属。这种分布差异部分是由于这些属在临床上的关注度和更成熟的检测方法。然而，地理偏见明显存在：研究主要集中在巴西的东南部和南部地区，而关于北部和中西部地区的数据非常有限（Bellini等人，2022；dos Santos Zanetti等人，2021）。因此，本研究旨在填补马托格罗索州FLA知识的空白，具体目标是：（i）从库亚巴河流域分离和鉴定淡水FLA；（ii）表征分离株的形态和与致病性相关的特征；（iii）评估阿米巴与斑马鱼幼苗之间的相互作用。这些结果有助于环境监测和临床预警，为风险管理和未来的诊断、预防和治疗策略提供信息。

**2. 材料与方法**
**2.1. 样本收集**
2024年2月至5月期间，在库亚巴河流域的八个地点收集了地表水样本（图1和表S1）。使用无菌聚乙烯瓶，样本在冷藏条件下运输（4°C）。所有样本均在采集后6小时内进行处理。

**2.2. 水质微生物和物理化学分析**
总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠杆菌采用多管发酵法测定，结果以最可能数（MPN 100 mL?1）表示，遵循CETESB协议（2018）和Technical Standard L5.202（第5版）。异养细菌通过涂布平板法量化。地表水样本依次稀释于0.8%盐水（NaCl）中，然后接种在营养琼脂（5 g L?1蛋白胨、3 g L?1酵母提取物、15 g L?1琼脂）平板上，每个平板重复三次，并在30°C下培养48小时。根据APHA（2017）标准计算菌落形成单位（CFU mL?1）。

**2.3. FLA的分离和单相培养**
从每个地表水样本（1 L）中通过真空过滤分离FLA；使用Kitasato系统和醋酸纤维素膜（1.5 μm；47 mm；Hexis Científica）进行分离。每个膜切成八段，上下表面朝上放置在含有营养琼脂（NNA，成分：0.142 g L?1 Na?HPO?、0.136 g L?1 KH?PO?、0.025 g L?1 MgSO?·7H?O、0.027 g L?1 CaCl?·2H?O、0.120 g L?1 NaCl和20 g L?1琼脂）的Petri皿上，表面覆盖热灭活的大肠杆菌OP50（80°C加热30分钟）。在制备细菌菌层之前，将大肠杆菌OP50在LB液体培养基（20 mL）中37°C下摇床培养48小时，然后离心（3000 g，15分钟）。所得沉淀物重新悬浮在2 mL无菌盐水中，每个NNA平板上接种500 μL悬浮液以形成细菌菌层。平板在26–28°C下培养，并每天检查阿米巴生长情况。每隔五天将生长前沿的琼脂块转接至新的NNA + 大肠杆菌平板上以纯化培养物。此步骤重复六次，以去除真菌和其他原生动物的污染。FLA菌株分离后，每周在NNA + 大肠杆菌培养基上转接一次以确保其存活并监测污染情况。

**2.4. FLA形态学特征与鉴定**
通过光学显微镜观察滋养体和囊肿的独特特征及运动模式（Page，1988）。含有单相培养物的平板用冷却后的PAGE盐水溶液（0.117 g L?1 NaCl、0.0040 g L?1 MgSO?和0.141 g L?1 Na?HPO?）冲洗（4°C）并离心（850 g，4分钟）。阿米巴重新悬浮在PAGE溶液中，放在玻璃载玻片上并在倒置显微镜下观察。阿米巴的运动被记录为视频，运动速度使用ImageJ软件估算（Campolo等人，2021）。部分细胞用甲醇固定在玻璃载玻片上，并用Giemsa染色（1 mL染液在10 mL水中染色20分钟），然后用Panótico?染色（0.1%三芳基甲烷固定10秒，0.1%酸性黄染料染色20秒，0.1%碱性噻嗪染料染色10秒）。随机选取每个菌株的10个细胞测量滋养体和囊肿的大小；优先选择运动状态的细胞进行测量，以更准确地反映其形态。将活阿米巴的形态特征与已发表的描述进行比较（Kudryavtsev等人，2009；Smirnov和Brown，2004；Smirnov等人，2011；Visvesvara等人，2007；Watson等人，2014）。**FLA分子鉴定**

基因组DNA根据制造商的说明，使用GeneJET基因组DNA纯化试剂盒（Thermo Scientific?）从FLA细胞中提取。目标区域通过PCR扩增；使用引物对（表S2和S3）。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色，并在紫外光下观察。经过酶法纯化后，扩增产物进行Sanger测序。序列在Chromas（v2.6.6）中编辑，并基于BLASTn获得的序列同源性进行分类。表S3列出了GenBank访问编号。这些菌株及其相应的遗传物质存储在巴西马托格罗索联邦大学的生物技术和微生物生态学实验室中。

**2.6. 与致病性相关的特征：渗透压（甘露醇）和耐热性**

菌株的鉴定依据Kahraman和Ak?n Polat（2024）的方法进行，并进行了适应性调整。FLA通过冷却后的PAGE缓冲液（4°C）从NNA+E. coli平板表面收集。细胞清洗（3000 g，15分钟）并重新悬浮在同一缓冲液中。将10-μL的阿米巴悬浮液接种到含有0、0.5或1 M甘露醇的NNA+E. coli平板中心，然后在30°C下培养。使用放大镜评估放射状生长直径。耐热性评估方法类似：将阿米巴悬浮液接种到NNA+E. coli平板上，并在30、37或42°C下培养。所有实验均重复三次。

**2.7. 阿米巴与斑马鱼（Danio rerio）幼体之间的相互作用评估**

涉及Danio rerio胚胎的所有实验程序均符合巴西国家动物实验控制委员会（CONCEA）的指导方针。该研究获得了马托格罗索联邦大学（UFMT）动物使用伦理委员会（CEUA）的批准，批准号为23,108.059766/2025–64。FLA菌株在添加了200 μL热灭活E. coli OP50细胞悬浮液的5 mL NN培养基中培养。在30°C下培养10天后，用PAGE缓冲液清洗（850 g，4分钟）以去除细菌。通过50毫升聚丙烯管将2-dpf（受精后第2天）的斑马鱼胚胎转移到含有0.292 g L?1 NaCl、0.0126 g L?1 KCl、0.0367 g L?1 CaCl?和0.0400 g L?1 MgSO?的E3培养基中。每管中接种1毫升FLA悬浮液（5000个阿米巴），并在26°C下培养七天，光照周期为12小时：12小时。每天评估斑马鱼幼体的存活情况，并计算死亡数量。对照组为空管中接种1 mL PAGE缓冲液的幼体。所有实验均重复三次。

**2.8. 统计分析**

所有数据均使用R（v. 4.4.2）（R Core Team，2024）进行处理和计算。物理化学和微生物变量进行了标准化（z分数），并通过主成分分析（PCA）来检查采样批次之间的差异以及变量贡献。使用PERMANOVA（欧几里得距离；9999次排列；α = 0.05）在vegan包中（Oksanen等人，2025）中测试批次间的差异。

**3. 结果**

地表水样的物理化学和微生物参数取决于采集时间（2月 vs 5月；图2；表S4）。在雨季（批次1）采集的样品与较高的NO??浓度、COD/BOD、降水量和E. coli数量相关，而在旱季（批次2）采集的样品与较高的NO??浓度、溶解氧、异养细菌数量和电导率相关（PERMANOVA，p = 0.002）。

**下载：**下载高分辨率图像（304KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图2.** 对库亚巴河流域八个采样点（S1–S8）采集的地表水样的物理化学和微生物数据进行的主成分分析。每个点代表一个采样点，聚类轮廓表示批次1（雨季）和批次2（旱季）。变量的贡献以向量形式显示：溶解氧（DO）、化学需氧量（COD）、生化需氧量（BOD）、pH值、电导率（C）、总大肠菌群、耐热大肠菌群、E. coli、异养细菌（Het. bac.）、硝酸盐（NO??）、亚硝酸盐（NO??）和降水量（P）。

我们在库亚巴河流域八个采样点采集的所有地表水样中检测到了FLA并分离出了它们（图3和表S3）。获得了39个FLA分离株（单相培养），分布在六个属中。通过BLASTn的分子鉴定，核苷酸同源性介于93.36%到100%之间（表S3）。

**下载：**下载高分辨率图像（224KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图3.** 从库亚巴河流域八个采样点（S1–S8）采集的地表水样中分离出的自由生活的阿米巴（FLA）的分类群多样性和相对丰度。

大多数分离株（n = 39；图3）属于Acanthamoeba（51.2%）、Vannella（23.07%）和Vermamoeba（12.8%）属。这六个鉴定的属包含14个物种，其中Acanthamoeba hatchetti（12.82%）、Vermamoeba vermiformis（12.82%）、Acanthamoeba castellanii（10.26%）和Acanthamoeba lenticulata（10.26%）相对丰度最高（图3）。Vannella sp.和V. vermiformis分布最广：分别在我们检测的8个采样点中的75%和62%被发现（表S3）。

我们在批次1采集的地表水样中仅检测到Ptolemeba和Vannella，在批次2采集的地表水样中检测到了Acanthamoeba和Flamella（图4）。批次1或2采集的样品中含有属于Naegleria和Vermamoeba属的FLA。这些样品的物种丰富度不同：批次1和2采集的样品分别仅检测到4种和9种物种（图4）。Vermamoeba vermiformis是在两个批次中都检测到的唯一物种。

**下载：**下载高分辨率图像（248KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图4.** 从库亚巴河流域八个采样点（S1–S8）采集的地表水样中分离出的自由生活阿米巴（FLA）的属丰富度（左）和物种丰富度（右）。地表水样分别在雨季（批次1）或旱季（批次2）采集。

**图5.** 分离出的FLA的代表性滋养体（左）和囊泡（右）。图S1和S2提供了特定分类群的形态细节和囊泡形态。

**下载：**下载高分辨率图像（257KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图5.** 自由生活阿米巴（FLA）的代表性形态：(A) Acanthamoeba，(B) Flamella，(C) Naegleria，(D) Ptolemeba，(E) Vannella，(F) Vermamoeba。阿米巴之前在含有接种了热灭活E. coli细胞的NNA培养皿中培养。

**下载：**下载高分辨率图像（106KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图6.** 自由生活阿米巴（FLA）的代表性囊泡形态：(A) Acanthamoeba，(B) Naegleria和(C) Vermamoeba。阿米巴之前在含有接种了热灭活E. coli细胞的NNA培养皿中培养。

Vannella（75%）、Acanthamoeba（75%）和Vermamoeba（75%）是在八个采样点中最常检测到的属（表S3）。站点S2包含了六个鉴定属中的四个，其次是S1、S6和S7，每个站点各包含三个属。就物种丰富度而言，S1、S6和S7分别包含了我们鉴定出的14个物种中的50%（7/14）、42.86%（6/14）和42.86%（6/14）。

Vannella分离株主要表现出扇形（flabellate）的运动形态，但我们也观察到了半圆形变体及偶尔出现的铲形（spatulate）形态（图S1YAg）。主轴长度范围为13.19 ± 0.04至28.82 ± 2.95 μm（表S3）。浮游形态具有长而细的伪足（3-11），末端呈圆形。这个属不形成囊泡（图6和图S2）。运动速度范围为2.66至4.47 μm s?1（表S3）。

V. vermiformis的营养体细长且呈圆柱形，使其外观纤细且线性。它们的主轴长度范围为16.69 ± 3.40至23.56 ± 3.12 μm（图S1Ah–Al；表S3）。运动方式为单伪足（1.33–5.60 μm s?1），由单个主导的前伪足驱动，导致连续、均匀、非爆发性的运动（表S3）。尽管大多数细胞为单伪足，但在方向变化时会出现多伪足和不规则形态，这些形态会暂时变为双伪足或多伪足。V. vermiformis的囊泡呈球形，表面光滑（图S6）。它们的直径根据菌株不同而介于6.37 ± 0.68至10.60 ± 0.21 μm之间（表S3），并具有双层囊壁（图S2UY）。

Naegleria cf. gruberi的营养体呈椭圆形至梭形，细长且柔韧，平均长度为24.16 ± 2.06 μm（表S3）。Giemsa染色显示其核呈球形（图S1V）。运动速度快（9.27 μm s?1）（表S3），具有方向性，并且会爆发性地移动，细胞质突起形成前伪足。球形囊泡的直径为13.24 ± 0.11 μm，具有厚实的单层囊壁（图S2S；表S3）。Naegleria philippinensis的营养体稍小（21.05 ± 1.93 μm），移动速度为4.00 μm s?1（图S1W；表S3）。

Ptolemeba bulliensis的营养体细长，类似扁形虫，前部透明质较宽，长度为29.39 ± 5.77 μm（图S1X；表S3）。运动方式为单轴，几乎完全通过一个主导的前伪足进行（表S3）。然而，某些个体表现出突然的方向变化（菌株Am26）。P. bulliensis的运动速度最快：25.15 μm s?1（表S3）。

Flamella balnearia（菌株Am39）的营养体较扁平且多叶状，平均长度为17.87 ± 2.22 μm，移动速度比其他物种的营养体慢（2.90 μm s?1）（图S1T；表S3）。在本实验条件下，F. balnearia的营养体不会形成囊泡。

Acanthamoeba菌株包含六个物种/基因型：A. castellanii（T4）、A. hatchetti（T11）、A. jacobsi（T15）、A. lenticulata（T5）、A. quina（T4）和A. stevensoni（T11）。营养体的长度在13.75 ± 0.94至44.99 ± 1.12 μm之间，具有扁平形态和叶状伪足（图S1AS；表S3）。该属的平均运动速度为3.60 μm s?1（表S3）。在多个物种中观察到明显的细胞质液泡（图S1AS）。囊泡（8.54 ± 0.08至21.72 ± 0.54 μm）具有双层壁，外囊呈现皱褶或波浪状，内囊形状多样，包括星形、三角形或圆形（图6；图S2A–R；表S3）。

关于热响应，大多数测试菌株（74%）在温度从30°C升至37°C时表现出放射状生长减少（表S5）。P. bulliensis的菌株Am26和Am38以及A. castellanii的菌株Am51在37°C时不生长。相比之下，V. vermiformis（菌株Am4和Am45）、N. cf. gruberi（菌株Am8）、Vannella sp.（菌株Am13）、P. bulliensis（菌株Am36）、A. jacobsi（菌株Am57）和A. hatchetti（菌株Am60）在30°C至37°C之间生长（表S5）。在42°C时，Vannella sp.（菌株Am13）、A. jacobsi（菌株Am33和Am57）、Acanthamoeba sp.（菌株Am34）、A. lenticulata（菌株Am40、Am47和Am49）、V. vermiformis（菌株Am45）以及A. hatchetti（菌株Am53）也表现出生长（表S5）。

在渗透压胁迫下，大多数菌株（68.57%）在含有0.5 M甘露醇的培养基中生长，而只有A. hatchetti（菌株Am43）、A. castellanii（菌株Am44）和A. lenticulata（菌株Am47）在1.0 M甘露醇中生长（表S6）。总体而言，这些结果表明不同菌株之间存在热耐受性和渗透压耐受性的差异（表S5和S6）。

我们监测了斑马鱼幼体（n = 34）暴露于阿米巴菌株（24至168小时）后的存活情况。在所有时间点，阴性对照组（E3和含有E. coli的NN）的斑马鱼幼体存活率为100.0 ± 0.0%（图7）。到实验结束时，94.1%的FLA菌株降低了斑马鱼幼体的存活率，且96至120小时之间的效果更为明显。在168小时时，斑马鱼幼体的死亡率为4.2%至55.0%（例如，Vannella sp.菌株Am22在168小时的死亡率为55.0%）（图7）。至少杀死30.0%斑马鱼幼体的菌株占测试菌株的26.5%，包括Vannella sp.菌株Am22（55.0%死亡率）、F. balnearia菌株Am39（37.1%）、P. bulliensis菌株Am26（39.9%）、N. philippinensis菌株Am36（32.5%）和V. vermiformis菌株Am45（35.0%），以及几个Acanthamoeba菌株（Am35、Am46、Am55和Am59）（图7）。菌株间的变异性也很明显。例如，在A. lenticulata的情况下，168小时的斑马鱼幼体死亡率介于8.3%（菌株Am48）至25.0%（菌株Am49）之间，而菌株Am40的死亡率仅为12.5%（图7）。

**下载：**下载高分辨率图像（269KB）
**下载：**下载全尺寸图像

**图7.** 不同阿米巴物种和菌株引起的斑马鱼幼体死亡率的比较分析。尽管关于巴西淡水原生动物（FLA）生物多样性和生态学的科学研究成果有所增加，但地区间的差异仍然存在（Bellini等人，2022年）。截至2020年，关于巴西马托格罗索州这种生物多样性的记录仍然很少，这限制了人们对FLA在该地区分布和关键区域出现情况的了解，并削弱了监测和预防工作的效果（Bellini等人，2022年）。我们在分析的表层水样本中记录了14种FLA物种。从地理角度来看，FLA分布广泛，能够适应多种栖息地。它们既存在于自然水生系统中（Fan等人，2024年），也存在于陆地环境中（Chaúque等人，2023年），并且还能在受人类影响的环境中找到，包括自来水中（Zahid等人，2024年）、城市广场和公园（Hendiger-Rizo等人，2024年）、游泳池（Chaúque等人，2022年）、污水系统以及家庭、学校、医院等场所的室内表面（Lasjerdi等人，2011年；Abedi等人，2021年）和牙科环境（Khatoonaki等人，2022年）。与以往对淡水系统的调查相比，库亚巴河流域的FLA物种丰富度相对较高（6个属，14种），高于巴西及其他地区的其他河流和湖泊的记录。从巴拉那河盆地蒙霍利尼奥河采集的水样中发现了6个FLA属（Naegleria、Acanthamoeba、Hartmannella、Stenamoeba、Filamoeba和Vannella），共包含8种物种（Naegleria australiensis、N. philippinensis、Acanthamoeba spp.和A. hatchetti）（Bellini等人，2020年）。相比之下，从巴西朗多尼亚州的蒙特内格罗河采集的水样中只发现了Acanthamoeba属的菌株（Magliano等人，2012年），而从巴西南里奥格兰德州瓜伊巴湖采集的水样中则发现了Acanthamoeba、Vermamoeba和Naegleria属的变形虫（Marinho等人，2023年）。伊朗德黑兰省5条河流中采集的60个水样中约有30%含有Acanthamoeba spp.、Vermamoeba sp.和Vahlkampfiidae（Javanmard等人，2025年）。同样，在西班牙的河流中，变形虫的多样性主要限于Vahlkampfiidae、V. vermiformis和Acanthamoeba spp.（Pérez-Pérez等人，2025年）。从韩国不同河流采集的水样中发现了属于3个属的FLA，共12种：Acanthamoeba（10种）、Vannella croatica和Vermamoeba sp.（Choi等人，2024年）。

本研究的方法学局限性在于使用了一种培养基进行变形虫分离，这可能限制了样本中分类多样性的恢复。基于单一协议的方法往往有利于那些更能适应所使用条件的群体。虽然公认使用添加了灭活大肠杆菌的非营养琼脂（NNA）是一种标准方法，但其应用可能会导致实际多样性的低估。因此，采用多种培养基和改变培养条件的实验策略是一种有前景的方法，可以扩大分类单元的检出范围并加深对自然环境中变形虫多样性的理解。热带流域的物理化学和生物特性在雨季和旱季之间存在显著差异（Li等人，2022年；Pakoksung等人，2025年；van Vliet等人，2023年）。库亚巴河流域受到潘塔纳尔湿地的季节性影响。在这个生物群落中，水文和生态状况直接受到周围高地的影响，这些高地驱动着洪水和水退循环，维持着其生物多样性和环境平衡（Bergier，2013年）。在潘塔纳尔北部，水文循环遵循季节性模式，但会因当地降雨情况而变化，并受河流的影响。2月通常是洪水期，而5月标志着从高水位向水位下降的过渡（Jean Milien等人，2023年）。这种季节性差异使得两次采样活动（2月和5月）在物理化学和生物特征上有所不同。这些差异可能解释了在旱季（第二次采样）观察到的物种丰富度高于高水位期（第一次采样）。变形虫的数量通常与细菌的可用性相关（Bednarek等人，2025年；Goudot等人，2012年；Potgieter等人，2021年）。一致地，我们发现在水位下降期间，异养细菌的数量更多，这可能与该季节观察到的更高变形虫多样性有关。在这些地点全年监测变形虫多样性对于确认这些模式非常重要。

除了常见的属（如Acanthamoeba、Naegleria、Balamuthia和Sappinia）之外，新发现的分类单元如Parafumarolamoeba stagnalis（Vahlkampfiidae，Heterolobosea）也凸显了提高变形虫生物多样性分辨率的必要性（Borodina等人，2021年）。除了Naegleria属（Excavata）外，我们还通过分子标记将Acanthamoeba、Flamella、Ptolemeba、Vannella和Vermamoeba鉴定为阿米巴纲成员，这一结果得到了形态特征的验证。识别和分类FLA依赖于综合的形态学、生化和分子方法（Adl等人，2012年）。准确识别FLA对于描述其多样性和解释这一原生动物群体的进化形成的生态特征至关重要。本文中验证的形态特征，包括滋养体形状（细长型、裂片型、椭圆形、不规则型或旗状型）、大小、伪足类型以及运动方式（缓慢型、爆发型、定向型或多向型），与我们鉴定出的属和种的特征描述相符（Lorenzo-Morales等人，2015年；Marzouk等人，2024年）。此外，胞囊形状、壁厚度和大小也有助于鉴定形成胞囊的分类单元。总体而言，这些特征加强了我们从分子分析中得出的鉴定结果。Naegleria、Acanthamoeba和Vermamoeba中包含能够侵染人类并导致危及生命的感染的物种（Alanazi等人，2025年；Aykur等人，2024年；Burqi等人，2024年；Delafont等人，2018年）。Acanthamoeba和Vermamoeba是我们从八个地表水采样点中最常分离出的属，这进一步强调了持续监测库亚巴河流域FLA的必要性。尽管Vannella和Vermamoea通常不被认为是致病的，但它们可能携带与人类感染相关的细菌，包括军团菌，因此构成了潜在的公共卫生隐患（Lorenzo-Morales等人，2007年）。从角膜炎患者分离出的Vannella菌株据报道携带类似微孢子的生物体，这些生物体被认为是角膜炎的致病因子（Scheid，2007年）。此外，Vannella属成员还可以寄生军团菌（导致军团病的病原体），可能有助于该病原体的环境持久性和传播（Radziminski和White，2023年）。从整体生物学的角度来看，变形虫及其相关微生物群形成一个功能单元，可以在水生环境中增强耐药细菌的保护、持久性和扩散（Bordenstein等人，2024年）。相比之下，Flamella或Ptolemeba尚未被报道具有致病性或与人类病原体的关联。

变形虫的大小范围从大约2微米（例如Massisteria voersi）到巨型物种（如Chaos carolinense）的约700–2000微米不等（Kofman和Guarner，2022年）。在库亚巴河流域鉴定的物种都属于这一范围，相应的滋养体大小从13.19±0.04微米（Vannella sp. Am13）到44.99±1.12微米（Acanthamoeba castellanii Am44）不等。多种FLA属已在巴西的不同栖息地中被报道（Bellini等人，2022年）。Acanthamoeba和Naegleria分布广泛，可以在自来水中、河流中、游泳池中、污水中、土壤中和隐形眼镜中发现。V. vermiformis和Vannella也被发现存在于多种水生环境和生物膜中。Acanthamoeba是一种普遍存在的FLA，广泛分布于自然水生系统（如河流和温泉）和人工环境（如自来水中、牙科设备水和冷却塔中）。它们还在大气中和表面被检测到（Khan，2006年；Solgi等人，2012年）。在我们收集的数据集中，这一属是最常检测到的属之一（八个采样点中有五个）。小亚基核糖体RNA基因（SSU rRNA）的测序是Acanthamoeba分类的重要工具。SSU rRNA数据支持当前的基因型系统（T1–T23），该系统与系统发育关系一致，并与形态特征相关（Diehl等人，2021年；Roshni Prithiviraj等人，2020年）。Acanthamoeba是巴西乃至全球范围内引起阿米巴性角膜炎（AK）的主要致病属（Alves等人，2018年；Castro-Artavia等人，2017年；Diehl等人，2021年）。超过90%的AK病例归因于基因型T4（Alawfi等人，2024年；Khan，2006年；Raghavan和Rammohan，2024年）。人类感染这一属还可能导致肉芽肿性阿米巴性脑炎（GAE），这是一种严重且常常致命的中枢神经系统（大脑和脑膜）感染（Spottiswoode等人，2024年）。T4基因型在环境和临床样本中都最常见，在意大利、伊朗、西班牙（Berrilli等人，2024年；Esboei等人，2020年；Magnet等人，2013年）以及巴西（Bellini等人，2022年）等国家中普遍存在。这种基因分型方法对于流行病学研究至关重要，因为它可以追踪来源、绘制致病谱系并设计更加有针对性和有效的预防策略（Diehl等人，2021年；Otero-Ruiz等人，2022年）。在我们的数据集中，我们鉴定了六种Acanthamoea属，其中A. castellanii（T4）、A. lenticulata（T5）、A. hatchetti（T11）和A. jacobsi（T15）最为丰富。A. castellanii和A. lenticulata已在巴西东北部的淡水环境中单独或共同分离出来（Matos de Oliveira等人，2023年）。这些物种也在巴西南部的医院环境和污水处理厂中被检测到（Borella da Silva等人，2023年）以及角膜炎患者中（Bellini等人，2022年）。在国际上，这些分类单元已在埃及（A. lenticulata）（Nageeb等人，2022年）和台湾（A. castellanii和A. hatchetti）（Kao等人，2014年）的淡水样本中被报道；在菲律宾、印度、德国、美国和法国的 both 人类相关和环境来源中（A. lenticulata、A. castellanii和A. hatchetti）（Cruz和Rivera，2014年）；以及在意大利的人类和水环境来源中（A. jacobsi）（Corsaro等人，2017年）也被报道。A. hatchetti、A. jacobsi、A. quina（T4）和A. stevensoni（T11）尚未在巴西样本中直接报道。由于基因型T4在全国范围内占主导地位，且A. quina也被归入这一基因型，因此该物种可能存在于巴西并可能导致角膜炎病例。A. jacobsi和A. stevensoni主要从巴西以外的海洋环境中分离出来，包括韩国的海洋沉积物和纽约的贝类养殖场（Liu等人，2006年）。

F. balnearia（在第二次采样点的S2位置检测到）是一种水生FLA（Variosea），具有特征性的旗状形态（11–34微米）和结构复杂的坚韧胞囊（Kudryavtsev等人，2009年）。这种物种表现出明显的生态适应性和全球分布，从温带淡水系统（Kudryavtsev等人，2009年）到极端极地环境（Shmakova等人，2016年；Yirmibe?o?lu等人，2022年）。F. balnearia已在医院供水网络中被报道（Ovrutsky等人，2013年），并且它可以寄生军团菌（Boamah等人，2017年），这对公共卫生有潜在影响。据我们所知，这种物种在巴西尚未有记录，这进一步强调了在该国需要进行有针对性的FLA分类调查。Naegleria常见于自然和水工环境（如饮用水管道和游泳池）以及潮湿的土壤中（Visvesvara等人，2007年）。N. cf. gruberi和N. philippinensis的发现表明必须进行常规的水质监测，因为这些分类单元已被报道会在动物模型中引起脑炎（Dyková等人，2001年；El-Badry等人，2020年；Visvesvara等人，2007年）。它们在库亚巴河流域的存在表明，这不仅对水生生物构成风险，也对使用该河流作为水源的哺乳动物构成风险。随着全球气温升高，监测水生环境中的变形虫变得尤为重要，以确保水质和食品安全（Prillaman，2022年）。P. bulliensis（在第一次采样点的S7位置）最初是在基因上不同的土壤和淡水分离物中描述的，其形态与Hartmannellidae相似（Watson等人，2014年）。报道的平均滋养体长度（25.6微米；范围17.1–37.2微米）与P. bulliensis菌株Am26的平均长度（29.39±5.77微米）相匹配。尽管P. bulliensis存在于土壤中，但它与养殖鳟鱼的结节性鳃病（NGD）有关。它还在捷克共和国的淡水和鲑鱼鳃中以及美国的城市土壤中被检测到（Dyková等人，2002年；Tyml和Dyková，2017年；Watson等人，2014年）。此外，这种微胞虫还与意大利的虹鳟鱼（Brocca等人，2024年）以及俄罗斯的虹鳟鱼鳃（Oncorhynchus mykiss）有关（Kudryavtsev等人，2025年）。尽管我们没有在实际测试中验证P. bulliensis菌株Am26的热耐受性和渗透耐受性，但其他研究表明该菌株能够耐受高达18%的盐度，并在如此高的盐度下存活并繁殖，这表明它已经适应了半咸水环境，从而解释了其广泛的地理分布（Kudryavtsev等人，2025年）。在我们的培养条件下，我们没有观察到该菌株形成囊肿的现象，这与先前的研究结果一致。来自库亚巴盆地的Vannella菌株表现出典型的运动形态，即扁平、扇形或铲状体，并具有明显的前部透明边缘（Smirnov等人，2007年）。我们在属于这一分类单元的所有九个菌株的营养体中观察到了由透明外质组成的前部透明区域，这一区域约占细胞面积的四分之一到一半，符合该属的诊断特征（Marzouk等人，2024年；Smirnov等人，2007年）。Vannella菌株包括生活在土壤、淡水和海洋栖息地中的自由生物以及生物膜中的物种（Kudryavtsev等人，2025年；Mesentsev等人，2021年）。在这九个Vannella菌株中，我们仅确定Am28和Am32为Vannella planctonica菌株，这种菌株形成的椭圆形囊肿长度为22.12±0.75微米。该物种最初是在蓝藻Microcystis aeruginosa的水华期间被描述的（Mesentsev等人，2021年），产生的囊肿直径可达32微米（Van Wichelen和Vanormelingen，2016年）。V. planctonica被认为是一种潜在的蓝藻水华生物控制剂，相比化学处理方法更为可持续（Van Wichelen等人，2012年）。因此，它可能对调节库亚巴盆地的光合微生物具有重要意义。虽然Vannella不直接关联到人类感染，但其营养体可以作为“特洛伊木马”，携带病原菌。Vannella sp.与角膜溃疡中的铜绿假单胞菌有关，因此可能保护这种细菌免受庆大霉素和头孢唑啉等抗生素的侵害（Makioka等人，2000年）。尽管Vannella已在多个大陆和巴西生物群落中被报道（Marzouk等人，2024年；Smirnov等人，2007年），但V. planctonica在巴西的分布情况仍不清楚。据我们所知，这是首次在巴西北部潘塔纳尔地区记录到这一物种。V. vermiformis（在第一次调查中的采样点S1、S3和S4以及第二次调查中的采样点S6和S7被发现）是一种全球分布的物种，存在于多国的土壤和水中，包括巴西东南部和南部的河流（Bellini等人，2020年；Kuiper等人，2006年；Marinho等人，2023年）。它出现在农业土壤、自然土壤、河岸带、沼泽、游泳池、饮用水和医院供水系统中（Chelkha等人，2020年；Delafont等人，2018年；Siddiqui等人，2021年）。它在营养体（营养阶段）和囊肿阶段之间的转换支持了其环境持久性和广泛分布（Fouque等人，2015年）。V. vermiformis具有公共卫生重要性，因为它易于适应温度变化，并可作为病原微生物（如嗜肺军团菌和嗜麦芽窄食单胞菌）的宿主/载体（Chelkha等人，2020年）。某些FLA物种偶尔会感染动物宿主，包括人类，导致不良健康后果（Schuster和Visvesvara，2004年）。因此，绘制其存在分布图并评估其菌株级别的致病风险至关重要，以便实施有效的预防和诊断策略。除了P. bulliensis菌株Am26和Am38以及A. castellanii菌株Am51外，所有检测到的菌株都在37°C下生长。在37°C或42°C下生长的阿米巴通常被认为是对人类或其他恒温动物具有潜在致病性的，因为它们能在体温下存活和繁殖（Griffin，1972年；Stahl和Olson，2020年；Visvesvara等人，2007年）。这对于N. fowleri尤为重要，因为这种阿米巴在温暖的水中繁殖（Zaongo等人，2018年）。另外，我们检测到八种在42°C下生长的菌株，其中大多数属于棘阿米巴属。在高溶质浓度（如高甘露醇浓度）下的生存能力也与FLA的致病潜力有关（Mohd Hussain等人，2022年；Sharma等人，2023年）。棘阿米巴经常表现出渗透耐受性；例如，约92%的尼罗河分离株能在1.0 M甘露醇浓度下生长（Al-Herrawy等人，2013年）。在我们的数据集中，约69%的菌株能在0.5 M甘露醇浓度下生长。在棘阿米巴中，除了A. jacobsi（菌株Am46和Am57）和A. hatchetti（菌株Am60）外（即85%），所有菌株都能在0.5 M甘露醇浓度下生长。值得注意的是，只有棘阿米巴菌株能在1.0 M甘露醇浓度下生长。体内模型，尤其是哺乳动物模型，对于研究FLA引起的感染非常重要，因为它们提供了更接近人类感染过程的复杂生理环境（Borges等人，2024年；Sharma等人，2021年）。从伦理角度来看，像斑马鱼（Danio rerio）这样的鱼类模型符合3R原则（替代、减少和优化）。只有当水生替代模型不足以解决问题的科学问题时，才应使用哺乳动物模型。这种方法既促进了道德行为，又增强了科学严谨性和社会责任感（Bauer等人，2021年）。尽管此前没有关于阿米巴与斑马鱼相互作用的报道，但我们的数据显示，斑马鱼幼体在暴露于51%的测试菌株后会被杀死。多项研究警告不要仅将渗透耐受性作为致病性的唯一指标，因为这种关系并不总是成立（Arberas-Jiménez等人，2024年；Silva等人，2024年；Kahraman和Ak?n Polat，2024年；Marcelino等人，2024年；Pérez-Pérez等人，2025年；Sharma等人，2023年）。与此一致的是，我们没有观察到FLA的热耐受性/渗透耐受性与斑马鱼幼体死亡率之间存在明确的相关性。从河流或湖泊水中分离出的FLA可以作为多种细菌的天然载体（Delumeau等人，2023年；Gomes等人，2020年）。例如，从瓜达卢佩河水中分离出的棘阿米巴属和N. fowleri菌株被描述为病原细菌的天然载体（Vingataramin等人，2025年）。尽管我们将斑马鱼幼体暴露于阿米巴悬浮液中，但相关的共生微生物可能导致了观察到的死亡现象。在这种情况下，不携带病原菌的FLA菌株不太可能杀死斑马鱼幼体，这与49%的FLA菌株未引起斑马鱼幼体死亡的结果一致。斑马鱼也被用作感染模型，用于研究由A. castellanii携带的Mycobacterium peregrinum和Klebsiella pneumoniae等细菌（Harriff等人，2007年；Marcoleta等人，2018年）。在这些研究中，细菌的毒力在与阿米巴结合后增强。虽然这种方法没有直接评估阿米巴的致病性，但它有助于理解在原生动物和脊椎动物宿主之间循环的病原体中的毒力生态和进化。用P. bulliensis菌株Am26感染斑马鱼幼体导致大约39.9%的死亡率。P. bulliensis与虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）的鳃病理（结节性鳃病）有关，但尚无确凿证据表明阿米巴是该疾病的主要原因（Kudryavtsev等人，2025年）。未来的工作应分离与这些阿米巴相关的潜在细菌，并通过改变宿主阶段（胚胎、幼体或成体）和感染期间的细菌剂量来评估它们的致病性。从阿米巴中消除细菌是另一种识别导致斑马鱼幼体死亡的原因的策略。斑马鱼幼体组织学研究可以进一步明确阿米巴是否侵入宿主组织并直接导致其死亡。

5. 结论

我们的发现有助于缩小关于巴西中西部，特别是库亚巴河流域自由生活阿米巴（FLA）多样性的知识空白。我们在该流域的地表水中鉴定出了六个属和14种FLA物种。一些分类单元，包括Acanthamoeba castellanii和A. hatchetti，与公共卫生相关，因为它们与严重甚至致命的疾病有关。据我们所知，Flamella和Ptolemeba属以及A. hatchetti、A. jacobsi、A. quina、A. stevensoni和Vannella planctonica物种在巴西之前尚未被报道。我们观察到不同分离株之间存在热耐受性和渗透耐受性的差异，但这些特征与斑马鱼（Danio rerio）幼体的死亡率无关。未来的研究应评估幼鱼和成年鱼的致病性，以更好地理解阿米巴与斑马鱼之间的相互作用。此外，未来的研究还应引入其他模式生物来界定宿主范围。未来的工作还将对与阿米巴相关的微生物群进行表征。总体而言，这项研究记录了库亚巴河流域丰富的FLA多样性，并强调了必须监测潜在致病性分类单元，以帮助进行风险管理和制定诊断、预防和治疗策略。

**作者贡献声明**
Amanda Cardoso Fonseca Lemos：写作——审阅与编辑、方法学、调查
Ivan Luiz Santos da Cruz：写作——审阅与编辑、方法学、调查、正式分析
Ivani Souza Mello：写作——审阅与编辑、方法学、调查、数据管理
Ibraim Fantin Cruz：写作——审阅与编辑、资金获取
Marcos Ant?nio Soares：写作——审阅与编辑、原始草稿撰写、监督、项目管理、方法学、资金获取、正式分析、数据管理、概念化

**资助**
本研究得到了FINEP（Financiadora de Estudos e Projetos）（拨款/项目编号01.23.0309.00）、CNPq（Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico）（拨款/项目编号445388/2024–2和310250/2021–8）和CAPES（Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de Nível Superior）的支持。