一种新型的地上部分全植株活体H2S成像方法揭示了H2S、NO和H2O2之间的相互关系

《Redox Biology》：Aboveground whole-plant live H2S imaging method sheds new light on the relationships between H2S, NO, and H2O2

　　

过氧化氢（H2O2）、一氧化氮（NO）和硫化氢（H2S）通过修饰多种细胞蛋白的结构、定位和功能，调控植物生长、发育和应激响应等过程。这些分子也被认为通过多种途径相互调节细胞内的水平。虽然已有多种在细胞和组织水平成像这些分子的方法，但全植株活体成像方法此前仅针对NO和H2O2开发。本文报道了一种与之前开发的H2O2和NO成像方法互补、可并用的全植株活体H2S成像方法。研究人员利用H2S供体、清除剂、L-半胱氨酸脱硫酶1（L-CYSTEINE DESULFHYDRASE 1, des1）突变体，以及热应激（heat stress, HS）或flg22处理，验证了所开发方法的特异性和生物学相关性。通过在野生型和不同突变体中对H2O2、NO和H2S进行并列成像，进一步揭示在HS后，H2O2的积累可以与H2S和NO的积累解偶联，但H2S和NO的积累通常相互关联，表明它们之间存在密切的相互作用。研究人员还发现，HS后H2S的积累需要NO的积累，并且缺乏抗坏血酸过氧化物酶1（ASCORBATE PEROXIDASE 1, APX1）的突变体在HS后不积累NO或H2S。这些发现为植物中H2O2、NO和H2S之间复杂的相互作用提供了新的见解，并为未来研究这三种关键信号分子铺平了道路。

论文解读文章

研究背景与问题

在植物生物学领域，过氧化氢（H₂O₂）、一氧化氮（NO）和硫化氢（H₂S）是三种关键的氧化还原信号分子。它们通过氧化翻译后修饰（oxiPTM），如S-亚硝基化、硝化和过硫化，调控众多蛋白质的功能，进而影响植物的代谢、生长、发育以及对生物和非生物胁迫的响应。此外，越来越多的证据表明，这三种信号分子之间存在复杂的相互作用网络，能够通过相互间的翻译后修饰来调节彼此的水平和活性。例如，NO和H₂S已知可以修饰呼吸爆发氧化酶同系物D（RESPIRATORY BURST OXIDASE HOMOLOG D, RBOHD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）等关键酶的活性，从而影响H₂O₂的产生和清除。然而，关于H₂O₂如何影响NO和H₂S水平的研究尚不充分，且三者之间的调控关系在整体植株水平、尤其是在不同胁迫条件下的动态变化仍不清晰。

尽管已有多种技术在细胞和组织层面实现了对H₂O₂、NO和H₂S的成像，但在土壤中生长的完整活体植株（地上部分）上进行非破坏性、实时成像的方法，此前仅成功开发用于H₂O₂和NO。缺乏相应的H₂S全植株成像方法，限制了对这三种分子在整体植物信号传导中相互作用机制的深入研究。因此，开发一种可靠的、可与现有H₂O₂和NO成像方法并用的全植株H₂S活体成像技术，对于阐明它们在植物胁迫响应（如热应激）中的协同与拮抗关系至关重要。本研究旨在填补这一技术空白，并利用该技术揭示H₂O₂、NO和H₂S在热胁迫下的积累动态及其相互关系。本研究成果发表在《Redox Biology》期刊上。

关键技术方法概述

本研究建立并验证了一种适用于拟南芥（Arabidopsis thaliana）的全植株活体H₂S成像方法。核心是利用医疗雾化器将荧光染料（最终选定HSip-1 DA）以气雾形式施加于生长在泥炭丸上4-5周龄的植株，染料通过气孔等途径进入植物组织。成像使用IVIS Lumina S5荧光/生物发光成像系统，在固定参数下采集时间序列图像。方法的特异性通过H₂S供体GYY4137、清除剂hypotaurine、以及H₂S合成关键酶缺失突变体des1进行验证。此外，研究将H₂S成像与已建立的H₂O₂（使用PO1染料）和NO（使用DAF-2-DA染料）成像方法结合，对不同基因型拟南芥（野生型、rbohd、apx1、nia1nia2noa1）在热胁迫（40°C，10分钟）及不同光强（5或100 μmol photons s^-1m^-2）下的三种信号分子积累进行同步比较分析。数据通过ImageJ分析感兴趣区域的总辐射效率，并进行统计学检验。

研究结果

1. 全植株活体H₂S成像方法的开发

研究人员测试了三种H₂S荧光探针（HSip-1 DA, WSP-1, SF7-AM），最终选择信号强度最高且能穿透成熟植株的HSip-1 DA用于后续研究。通过施加H₂S供体GYY4137可显著增强HSip-1 DA荧光信号，而使用清除剂hypotaurine则能淬灭由热应激诱导的H₂S信号，证明了该方法的检测能力与特异性。此外，在H₂S合成缺陷的des1突变体中，无论是热应激还是病原相关分子模式flg22处理所诱导的H₂S积累均显著低于野生型，进一步证实了该方法的生物学相关性。这些结果共同表明，所开发的成像方法能够特异、可靠地检测全植株水平的H₂S动态变化。

2. 中光与低光下热应激诱导的H₂S、NO和H₂O₂成像

在中等光强（100 μmol photons s^-1m^-2）下进行热应激时，野生型植株中H₂S、NO和H₂O₂三者均发生积累。然而，在低光强（5 μmol photons s^-1m^-2）下进行相同的热应激时，H₂S和NO仍然积累，但H₂O₂的积累被抑制。这一结果表明，在特定条件（低光）下，H₂O₂的积累可以与H₂S和NO的积累解偶联。同时，H₂S和NO的积累在低光下依然耦合，提示两者之间存在紧密关联，且这种关联可能独立于H₂O₂。

3. 中光下不同突变体中H₂S、NO和H₂O₂水平的成像

为深入探究三者关系，研究人员在中光条件下比较了野生型、H₂O₂产生缺陷突变体rbohd、H₂O₂清除缺陷突变体apx1以及NO合成缺陷三重突变体nia1nia2noa1对热应激的响应。

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  H₂O₂积累：所有基因型在热应激后均积累了H₂O₂，包括rbohd突变体，这与局部热应激的结果不同，提示全植株热应激下H₂O₂的来源可能不依赖于RBOHD，且其积累不依赖于NO的存在（因为nia1nia2noa1中也积累）。
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  NO积累：热应激后，野生型和rbohd中NO积累，但在apx1和nia1nia2noa1中不积累。有趣的是，在对照生长条件下，rbohd植株的基底NO水平就显著高于野生型。
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  H₂S积累：热应激后，H₂S在野生型和rbohd中积累，但在apx1和nia1nia2noa1中不积累。在rbohd中，HS诱导的H₂S积累水平甚至高于野生型。

这些结果揭示了几点重要信息：首先，H₂O₂的积累可以不依赖于NO或H₂S；其次，H₂S的积累似乎依赖于NO（因为NO缺陷突变体也不积累H₂S）；第三，APX1的缺失意外地阻断了热应激诱导的NO和H₂S积累；第四，RBOHD的缺失导致了植株基础NO水平的升高以及热应激下更强的H₂S积累，这可能暗示着反馈调节机制的存在。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员整合了上述发现，对H₂O₂、NO和H₂S在热胁迫下的复杂关系进行了阐述。核心观点如下：

1. 1.
   H₂O₂与NO/H₂S的解偶联：在低光热胁迫下，以及在中光下的apx1和nia1nia2noa1突变体中，均观察到H₂O₂的积累可以与NO和H₂S的积累分离。这表明在这些条件下，H₂O₂的积累既不是NO/H₂S积累的充分条件，也不是必要条件。低光下H₂O₂积累的缺失，提示其来源可能主要是光依赖的叶绿体。
2. 2.
   NO与H₂S的紧密耦合：与H₂O₂不同，NO和H₂S的积累在绝大多数实验条件下表现出一致性，尤其是在热应激响应中。NO缺陷突变体同时缺失H₂S积累，强烈暗示H₂S的积累需要NO，支持了NO可能位于H₂S上游的观点，尽管时间先后顺序在本研究中未能分辨。
3. 3.
   APX1与RBOHD在调控网络中的特殊角色：apx1突变体在热应激下无法积累NO和H₂S，这是一个出乎意料的发现。由于APX1本身受NO和H₂S的翻译后修饰调控，这可能意味着APX1蛋白水平与NO/H₂S信号通路之间存在一种反馈调节机制。同样，rbohd突变体中基础NO水平升高和应激下H₂S积累增强，也提示RBOHD与NO/H₂S信号之间存在反馈回路，可能与RBOHD蛋白的S-亚硝基化和过硫化修饰有关。
4. 4.
   方法学意义：本研究成功开发的全植株H₂S活体成像方法，与已有的H₂O₂和NO成像方法兼容，为在不进行植物转化的情况下，快速、同步研究三种关键信号分子在整体植株水平的动态变化提供了强大工具。

研究结论（译文）

研究人员开发了一种全植株活体H₂S成像方法，对其进行了验证，并利用该方法研究了拟南芥热应激后H₂O₂、NO和H₂S之间复杂的关系。研究结果揭示，热应激后H₂O₂的积累可以与H₂S和NO的积累解偶联，但H₂S和NO的积累大多是相互关联的。研究人员进一步表明，热应激后H₂S的积累需要NO的积累，在对照生长条件下的rbohd突变体积累了高水平的NO，并且apx1突变体在热应激后不积累NO或H₂S。本研究揭示了H₂S、NO和H₂O₂信号之间复杂的相互关系，并为未来研究这些重要的氧化还原调节因子铺平了道路。