LAT1介导的工程化R13A-MOTS-c递送通过激活Nrf2和保护线粒体减轻辐射诱导的肺损伤

《Redox Biology》：LAT1-Mediated Delivery of Engineered R13A-MOTS-c Attenuates Radiation-Induced Lung Injury via Nrf2 Activation and Mitochondrial Protection

　　

摘要： MOTS-c（线粒体开放阅读框12S rRNA类型c）具有显著的抗氧化和抗炎特性，但其高极性导致的细胞膜通透性差限制了其治疗潜力。为克服这一限制，研究人员对野生型肽（序列为Met-Arg-Trp-Gln-Glu-Met-Gly-Tyr-Ile-Phe-Tyr-Pro-Arg-Lys-Leu-Arg）进行工程化改造，将第13位的极性精氨酸替换为丙氨酸，合成了R13A-MOTS-c。该修饰将肽的疏水性指数从-0.938提高到-0.544，显著改善了其细胞摄取。功能性摄取实验，包括与经典LAT1（L型氨基酸转运体1）底物（亮氨酸、BCH）的竞争以及LAT1敲低实验，进一步证实R13A-MOTS-c通过LAT1介导的转运进入细胞。体外实验表明，R13A-MOTS-c抑制了MLE-12细胞中的炎症反应、氧化损伤和线粒体功能障碍。体内研究显示，对接受20 Gy胸部照射的C57BL/6小鼠每日腹腔注射R13A-MOTS-c（5 mg/kg，持续2周），有效减轻了辐射诱导的肺部炎症、氧化应激和线粒体功能障碍。机制研究表明，R13A-MOTS-c激活了Nrf2（核因子E2相关因子2）信号通路，证据包括Nrf2核转位的增加及其下游靶基因的上调。这些效应在LAT1抑制、Nrf2抑制或Nrf2敲除条件下被消除。总之，这些发现表明，LAT1介导的R13A-MOTS-c摄取通过激活Nrf2通路和恢复线粒体功能来减轻辐射诱导的肺损伤，为临床应用提供了一种有前景的治疗策略。

一、 研究背景、问题与研究目的

辐射诱导肺损伤是胸部恶性肿瘤（如肺癌、乳腺癌）患者接受放射治疗时常见的并发症，严重影响治疗效果和患者生活质量。当前临床策略主要集中于对症治疗，如使用抗氧化剂、糖皮质激素等，但这些干预措施疗效有限且副作用明显。肺泡上皮细胞是RILI（辐射诱导肺损伤）的主要细胞靶点，而线粒体作为细胞的能量中心和信号枢纽，是辐射导致肺上皮细胞损伤的核心。线粒体功能障碍被认为是RILI的关键机制。因此，维持肺泡上皮细胞的线粒体功能是缓解RILI的一个有前景的治疗策略。

MOTS-c（线粒体开放阅读框12S rRNA类型c）是一种由线粒体DNA编码的16氨基酸肽，具有抗氧化、抗炎及保护线粒体功能的作用，在肥胖、糖尿病、骨质疏松等多种疾病模型中显示出保护潜力。然而，MOTS-c作为一种极性肽，其细胞膜通透性差，极大地限制了其作为治疗药物的临床应用潜力。尽管已有多种递送系统被开发用于促进细胞内肽的递送，但载体介导的系统常面临溶酶体降解等问题。通过化学修饰肽的氨基酸残基以增强其与细胞膜氨基酸转运体的特异性结合，从而实现肽的直接细胞内递送，是一种新兴策略。L型氨基酸转运体1是一种在肺上皮细胞中高表达的Na⁺和pH非依赖性跨膜转运体，能够高效识别和转运多种氨基酸及外源性肽。因此，本研究旨在探究通过靶向LAT1来增强MOTS-c递送并治疗RILI的可能性。

基于此，研究人员设计了新型肽R13A-MOTS-c，旨在克服野生型MOTS-c的细胞膜渗透屏障，并系统研究其在体内外模型中对RILI的保护作用及具体分子机制。该研究发表在《Redox Biology》期刊上，为RILI的防治提供了新的潜在治疗策略和理论依据。

二、 主要技术方法

为开展研究，研究人员运用了多种关键技术。首先，在临床层面，收集了江南大学医院2021年至2022年间接受放疗的胸癌患者血清样本，建立了RILI患者与未发生RILI的对照组，通过酶联免疫吸附测定、生化指标检测及受试者工作特征曲线分析，评估了MOTS-c在RILI患者血清中的水平及其诊断潜力。在分子与细胞层面，研究人员对MOTS-c肽段进行了生物信息学分析和工程化改造，合成了野生型MOTS-c、R13A-MOTS-c及其荧光标记衍生物。通过分子对接模拟、免疫荧光染色、流式细胞术、免疫共沉淀、小干扰RNA敲低和质粒过表达等技术，深入探究了R13A-MOTS-c与LAT1的相互作用及跨膜转运机制。在功能验证方面，研究采用了小鼠肺上皮细胞系MLE-12的体外辐照模型以及C57BL/6小鼠的体内全肺辐照模型。通过细胞计数试剂盒-8检测确定肽的最佳处理浓度和时间，并利用蛋白质免疫印迹、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光等技术检测了炎症因子、氧化应激指标、线粒体功能相关基因和蛋白、细胞凋亡标志物以及Nrf2信号通路的激活情况。此外，研究还使用了Nrf2基因敲除小鼠的原代肺泡上皮细胞以及Nrf2特异性抑制剂ML385、LAT1特异性抑制剂JPH203，以验证关键信号通路的必要性。组织病理学分析采用苏木精-伊红染色评估肺损伤程度，并通过TUNEL染色、线粒体膜电位探针、活性氧探针等多种荧光染色技术，在细胞和组织水平评估了凋亡和线粒体功能状态。

三、 研究结果

2.1. 在RILI患者外周血中观察到MOTS-c水平降低和氧化应激升高

对临床样本的分析发现，发生RILI的胸癌患者血清中MOTS-c蛋白水平显著低于未发生RILI的对照组。受试者工作特征曲线分析显示MOTS-c对RILI具有潜在的诊断价值。同时，RILI患者血清中乳酸脱氢酶、髓过氧化物酶、丙二醛水平显著升高，而超氧化物歧化酶和谷胱甘肽水平降低，表明RILI患者处于氧化应激状态，且血清MOTS-c水平降低可能是RILI的潜在诊断标志物。

2.2. 工程化R13A-MOTS-c显示出增强的膜渗透能力

通过序列比对和疏水性分析，研究人员将野生型MOTS-c第13位的精氨酸替换为丙氨酸，构建了R13A-MOTS-c。该修饰使肽的平均疏水性指数从-0.938增至-0.544。细胞免疫荧光实验证实，R13A-MOTS-c的细胞核定位显著增强，表明其膜渗透能力得到改善，而相同修饰位点的R16A-MOTS-c则无此效果，提示突变位置对膜渗透性有关键影响。

2.3. 膜蛋白LAT1介导了R13A-MOTS-c的细胞内转运

分子对接实验表明，R13A-MOTS-c与膜蛋白LAT1的结合亲和力强于野生型MOTS-c。免疫荧光显示R13A-MOTS-c与LAT1的共定位增强。流式细胞术竞争实验（使用亮氨酸和BCH）以及LAT1敲低/过表达实验证实，R13A-MOTS-c通过LAT1介导的途径进入细胞，且与LAT1蛋白的结合更强。

2.4. R13A-MOTS-c减轻了辐射诱导的MLE-12细胞炎症反应和氧化应激损伤

确定最佳预处理时间和浓度后，体外实验显示，5 μM R13A-MOTS-c预处理能有效减轻8 Gy照射对MLE-12细胞的损伤。它降低了细胞上清液中乳酸脱氢酶水平，缓解了辐射引起的谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平下降以及丙二醛水平升高，抑制了细胞内活性氧的积累，并降低了肿瘤坏死因子-α和白介素-6的mRNA表达水平。

2.5. R13A-MOTS-c缓解了RILI小鼠的辐射诱导炎症反应和氧化应激损伤

在C57BL/6小鼠模型中，每日腹腔注射5 mg/kg R13A-MOTS-c（持续2周）能显著减轻20 Gy胸部照射引起的肺组织形态学损伤（如水肿、肺泡结构破坏、炎性细胞浸润）。同时，它降低了支气管肺泡灌洗液中的总蛋白浓度和乳酸脱氢酶水平，改善了血清氧化应激指标（降低髓过氧化物酶、丙二醛，升高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽），并下调了肺组织中白介素-6和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达。相同剂量的野生型MOTS-c未显示出显著保护作用，而10 mg/kg的野生型MOTS-c才有效，表明R13A-MOTS-c具有更优的剂量反应特征。

2.6. R13A-MOTS-c减少了辐射诱导的MLE-12细胞线粒体损伤

R13A-MOTS-c处理稳定了辐射后的线粒体膜电位，降低了线粒体活性氧的产生和钙离子水平。同时，它上调了线粒体相关基因（细胞色素c氧化酶亚基I、细胞色素c氧化酶亚基IV、视神经萎缩蛋白1）的mRNA和蛋白表达，促进了线粒体结构和功能的完整性。

2.7. R13A-MOTS-c减轻了辐射诱导的MLE-12细胞凋亡

TUNEL染色显示R13A-MOTS-c缓解了辐射诱导的细胞凋亡。它在mRNA和蛋白水平上均下调了促凋亡基因（Bax、Caspase9、细胞色素c）的表达，同时上调了抗凋亡基因Bcl-2的表达。

2.8. R13A-MOTS-c抑制了RILI小鼠的辐射诱导凋亡和线粒体损伤

在动物模型中，R13A-MOTS-c处理同样下调了肺组织中促凋亡基因（Bax、Caspase9、细胞色素c）的mRNA和蛋白表达，上调了抗凋亡基因Bcl-2的表达。此外，它还显著增加了线粒体功能相关基因（细胞色素c氧化酶亚基I、细胞色素c氧化酶亚基IV、视神经萎缩蛋白1）和蛋白（包括线粒体转录因子A）在肺组织中的表达。

2.9. 工程化R13A-MOTS-c通过Nrf2依赖机制发挥辐射保护作用

机制研究表明，R13A-MOTS-c促进了转录因子Nrf2的核转位，并上调了其下游靶基因血红素氧合酶-1的表达。在Nrf2基因敲除的原代肺泡上皮细胞中，或使用Nrf2特异性抑制剂ML385处理MLE-12细胞时，R13A-MOTS-c对辐射诱导的线粒体活性氧升高、膜电位丢失以及线粒体相关基因表达下降的保护作用均被消除，证明其辐射保护作用依赖于Nrf2通路。

2.10. 抑制LAT1消除了R13A-MOTS-c对MLE-12细胞线粒体损伤的保护作用

使用LAT1特异性抑制剂JPH203处理后，R13A-MOTS-c维持线粒体膜电位、降低线粒体活性氧和钙离子水平的能力被逆转，表明其保护作用依赖于LAT1介导的转运。

2.11. 抑制LAT1削弱了R13A-MOTS-c对MLE-12细胞凋亡和炎症反应的保护作用

JPH203预处理同样消除了R13A-MOTS-c对辐射诱导的凋亡相关基因（Bax、Caspase9、细胞色素c、Bcl-2）表达改变、炎症因子（肿瘤坏死因子-α、白介素-6）mRNA表达上调以及细胞内活性氧水平升高的抑制作用。

四、 讨论与结论总结

讨论部分指出，RILI是胸部肿瘤放疗的常见并发症。本研究提示，用丙氨酸替换MOTS-c第13位的精氨酸可显著增强其膜渗透性。在RILI小鼠模型中，R13A-MOTS-c有效减轻了肺组织的炎症、氧化应激和线粒体损伤。体外实验进一步证实，R13A-MOTS-c通过结合膜蛋白LAT1进入细胞，激活转录因子Nrf2，从而减轻肺上皮细胞损伤，而LAT1抑制剂JPH203可逆转其保护作用。研究还讨论了MOTS-c在多种疾病状态下的水平变化及其保护作用，以及通过氨基酸修饰增强肽类药物递送策略的潜力。LAT1作为转运体在递送外源性肽方面的应用价值得到肯定。此外，研究明确了R13A-MOTS-c通过激活Nrf2发挥作用的机制，并与前人研究保持一致。同时，作者也指出了本研究的局限性，例如未使用LAT1基因敲除小鼠进行直接验证、未在人多肺上皮细胞中验证保护效果，以及动物模型采用单次高剂量照射与临床分次低剂量放疗方案不同等，为未来研究指明了方向。

研究结论翻译如下：

总之，本研究表明R13A-MOTS-c肽能有效减少线粒体活性氧生成，维持线粒体稳态，抑制上皮细胞线粒体凋亡，并通过靶向LAT1膜蛋白显著提高MOTS-c的生物利用度，凸显了其作为一种新型辐射防护剂的潜力。