利用数字全息显微镜对高度非平面的真核生物鞭毛摆动模式进行精确的3D跟踪

《Small Methods》：Precise 3D Tracking of Highly Non-Planar Eukaryotic Flagellar Beating Patterns Using Digital Holographic Microscopy

　　**摘要**

精确追踪真核生物鞭毛的快速而复杂的3D运动对于理解它们在细胞运动、感知功能以及资源获取中的作用至关重要。然而，实现鞭毛摆动模式的准确3D运动学重建，特别是高度非平面的摆动模式，仍然具有挑战性。在这里，我们介绍了holoV3C方法，该方法基于数字全息显微镜（DHM），能够以高时间分辨率对高度非平面的真核生物鞭毛进行无标记的精确3D追踪。该算法利用相位异常检测，提供了高时间和轴向分辨率的结合，对于摆动的鼠精子鞭毛可以达到0.25微米，对于聚苯乙烯颗粒则可达到53纳米，并且能够在较大的采样体积内高效地进行计算。通过追踪鼠精子鞭毛来验证算法的有效性，沿着单根鞭毛捕捉大约600个点以实现高轴向分辨率。此外，我们应用holoV3C方法重建了200纳米直径的原生动物Reclinomonas americana的高度非平面摆动动力学，时间分辨率为每秒200帧。通过实现非平面真核生物鞭毛的3D追踪，holoV3C可以为理解鞭毛动力学提供重要见解，为研究微生物运动及其生态学作用开辟新的途径。

**1 引言**

运动是生命的基础[1]，包括水生环境中微生物的运动，对于它们的生存至关重要[2, 3]。鞭毛在促进资源获取和逃避捕食者等行为中发挥着核心作用[4]。它们几乎存在于所有真核生物谱系中，从单细胞生物到大多数多细胞动物的配子，包括哺乳动物[5]。理解鞭毛的运动及其如何转化为细胞运动是理解细胞信号传导和生物物理学过程与细胞在行为和生态学层面的更广泛功能之间的接口的关键。例如，鞭毛的固有曲率或手性摆动动力学可以影响细胞通过流变趋性导航[6]。追踪鞭毛摆动还可以揭示人类精子对刺激的反应，为生殖生物学提供见解[7]。此外，鞭毛不仅在逃避捕食者方面发挥关键作用，还在捕食者捕获微生物过程中发挥作用[4]。真核生物鞭毛是复杂的结构，长度通常有几微米，而直径却小至200纳米。它们可以以高达100赫兹的频率振荡[8, 9]，这凸显了测量和追踪其3D形状的挑战。此外，追踪过程不仅受到鞭毛微小尺寸（接近光学极限）的困扰，还受到其通常较低光学对比度的限制。为了捕捉鞭毛的快速振荡，需要高时间分辨率，这给光学系统带来了严格的要求，并且需要开发能够准确表征不同结构、尺寸和行为下鞭毛动态3D摆动模式的工具。尽管量化鞭毛运动非常重要，但现有的成像方法往往无法满足这些要求，因为它们在空间精度、时间分辨率、体积采样和计算效率之间难以取得平衡。关于真核生物鞭毛运动的许多现有研究依赖于2D观测，仅捕捉到本质上是3D的运动投影，或者仅基于显微镜景深限制的样本狭小部分进行分析[10]。这种对2D投影的依赖导致了信息的丢失，可能会扭曲对鞭毛运动的解释和定量分析。例如，复杂的螺旋运动在2D视图中可能看起来是线性的或平面的。此外，将测量限制在显微镜景深限制的子集内，会妨碍对具有垂直运动分量的鞭毛的研究，从而排除了对许多真核细胞所展示的3D摆动模式的分析。这些2D测量无法捕捉到鞭毛运动的复杂动态，可能忽略了微生物运动的关键方面。因此，准确表征自然鞭毛运动及其所有空间复杂性，需要使用3D追踪技术。为了应对这些挑战，已经开发了各种3D方法。尽管之前的努力提供了宝贵的见解，但它们的适用性往往受到方法学限制的约束。挑战不仅来自成像技术的限制，还来自处理结果的计算复杂性。现有的3D成像方法，如光片显微镜和共聚焦显微镜，可以提供精确的3D测量，但需要样本标记，并且受到有限时间分辨率和小采样体积的限制。同样，之前用于捕捉3D鞭毛摆动的方法，包括多焦点显微镜[11-13]、散焦2D显微镜[6, 14, 15]以及使用压电驱动物镜的光学显微镜[16, 17]，虽然显示了一定效果，但存在一些固有限制，可能包括有限的采样体积、需要标记、需要广泛校准，或者依赖于物理扫描来构建3D堆栈，这限制了时间分辨率并影响了测量精度。总体而言，这些限制使得追踪鞭毛摆动更加困难且准确性较低，阻碍了我们精确测量真核生物鞭毛动态3D摆动模式的能力。因此，需要一种方法，既能结合高时空分辨率，又能实现大采样体积和高计算效率，以准确捕捉真核生物鞭毛的快速3D运动。数字全息显微镜（DHM）[18]代表了一种有前景的解决方案，它能够快速进行体积测量和数字重新聚焦，穿透数毫米的样本深度[19]。之前的DHM应用主要用于粒子追踪[20-23]，在精子细胞运动学的背景下，用于重建精子头部的3D轨迹，而对鞭毛动力学的分析则相对较少[24-26]。最近的进展表明DHM在重建3D鞭毛摆动方面具有潜力，这是对鞭毛动力学表征的重大进步[27-31]。然而，尽管大多数实验研究主要集中在精子鞭毛的准平面摆动模式上，但仍存在一种方法学空白，即能够精确捕捉许多鞭毛波形（如对海洋食物网至关重要的吞噬性鞭毛）所特有的高度非平面3D动力学的方法。在这种情况下，现有方法存在几个限制，包括高计算复杂性、有限的采样体积和次优的轴向分辨率。在这项工作中，我们提出了一种使用全息成像技术进行真核生物鞭毛3D追踪的方法。我们的方法结合了高时空分辨率和广泛的采样体积，同时消除了样本标记的需要。我们通过测量具有不同形态特征和运动模式的鞭毛的3D运动学来实验验证我们的方法，特别是以准平面摆动著称的鼠精子细胞，以及展示了高度非平面鞭毛波形的原生动物Reclinomonas americana (Discoba, Jakobida)。我们的结果突出了该方法在精确确定鞭毛上单个点的3D位置(x,y,z)方面的能力，并展示了我们方法的计算效率。高时空分辨率与大采样体积和操作效率的结合，使得这种方法成为在不同生物学背景下精确追踪3D鞭毛运动学的宝贵工具。

**2 结果**

**2.1 3D追踪方法**

本文介绍了一种名为holoV3C的3D追踪方法，专门用于精确追踪真核细胞及其微结构（如鞭毛）。名称“holoV3C”反映了其基本功能：应用全息（holo）技术通过分析沿光轴的1D振幅向量（VEC）来提取细胞的三维（3D）位置。“3”在“VEC”中的包含强调了该方法在3D空间中实现精确单点（像素级）定位的能力。该方法分为四个连续的核心模块：采集、横向定位、轴向定位和解释（图1）。采集模块使用数字全息显微镜捕捉样本体积的全息图，创建样本的3D记录，然后进行全息重建[18]。第二个模块是横向定位，使用相位z堆栈和图像处理技术提取鞭毛上点的(x,y)位置。第三个模块是轴向定位，确定前一模块中找到的横向(x,y)坐标沿光轴的z位置。第二和第三个模块是相互关联的，它们构成了该方法的基础，稍后将详细讨论。完成这三个步骤后，可以获得对应于细胞鞭毛上点的一组3D坐标。通过迭代地将横向和轴向定位模块应用于成像序列中的后续帧，将时间动态纳入3D追踪方法中。第四个也是最后一个模块涉及将这些3D坐标转换成3D运动的定量表示。虽然我们是专门为鞭毛追踪开发并描述了这种方法，但它也可以适应涉及整个细胞3D运动的应用。图1展示了使用数字全息显微镜追踪鼠精子细胞鞭毛的holoV3C方法的示意图。(1) 采集：使用数字全息显微镜测量和获取全息图。(2) 横向定位：相位z堆栈重建、过滤和定位感兴趣的3D相位区域（ROI），并检测横向(x,y)位置。(3) 轴向定位：振幅z堆栈重建，使用步骤2中的(x,y)位置处理振幅ROI，沿光轴构建振幅剖面，并检测Gouy异常。(4) 解释：重建3D轨迹和鞭毛摆动分析。该方法的模块化设计旨在使其具有多功能性。这种架构不仅促进了可扩展性，还支持对各个模块的定制，使其能够根据不同实验的具体要求进行修改。例如，横向定位模块可以进行改进以提高检测精度，适应不同物种在鞭毛数量、排列、波形和运动学方面的差异。

**2.1.1 采集**

数字全息术通过实现精确的体积成像，为3D追踪提供了基础数据。与基于扫描的方法不同，DHM能够在一个全息干涉模式下瞬间捕捉整个采样体积，保留了记录波前的所有空间信息。该技术利用了光的相干性，通过使用两束相干光之间的干涉：物体光束和参考光束。当光穿过样本时，它被显微镜物镜收集形成物体波。然后这个波与参考波干涉，生成全息图，由数字相机记录下来。在holoV3C中，我们采用了离轴配置，物体光束和参考光束以一个小角度干涉。这种布置有助于分离空间频率[32]，简化了振幅和相位图像的重建。振幅图像类似于透射光显微镜中观察到的图像，而相位图像代表细胞厚度与细胞及其周围介质之间折射率差异的乘积[33]。DHM的数字重建过程涉及使用计算生成的参考波来模拟全息图的照明。这与数值调整相结合，以纠正光学系统引入的任何波前畸变，确保重建的准确性[18]。

**2.1.2 横向定位**

确定3D坐标涉及两个过程：横向定位和轴向定位。在全息图采集之后，第二步是准确识别鞭毛上点的横向(x,y)位置。这一组件基本上依赖于2D追踪框架。然而，与每个帧仅检查一个焦平面的2D追踪不同，3D追踪需要分析z堆栈图像，这使计算过程复杂化。主要挑战是对z堆栈的全局分割。当鞭毛在运动时，它通常会在样本体积内跨越不同的高度，因此简单地选择一个平面进行图像分割和随后的(x,y)坐标定位是不够的。此外，高特异性成像技术（如荧光显微镜）中使用的z堆栈处理方法无法直接应用于全息成像，因为后者存在固有的噪声。在全息成像中，同时捕捉强散射和弱散射物体的图像是一个重大挑战。这个问题在鞭毛追踪中尤为明显，其中强散射的细胞体会妨碍对弱散射鞭毛的准确处理。此外，准确确定细胞或如鞭毛等结构的横向位置的方法取决于多种因素，包括被追踪对象的形态、采样体积和散射效率。由于这些复杂性，为具有不同形态和动态特性的鞭毛设计一个通用的横向定位流程仍然具有挑战性。在这项研究中，我们提供了一个完全自动化的横向定位模块的描述，该模块专门为小鼠精子的鞭毛设计，优化了其独特的形态和运动特性（图2）。相比之下，由于两种鞭毛在结构和动态特性上的差异，R. americana鞭毛的处理需要采用半自动化方法。R. americana鞭毛的运动常常导致鞭毛节段的重叠，使得完全自动化的分割变得不可靠。为了解决这个问题，半自动化方法要求用户手动定义每一帧中鞭毛的横向点，以指导算法对鞭毛进行精细化追踪。尽管两种情况都遵循相同的总体追踪框架，但横向定位模块针对每种类型的鞭毛进行了调整，以适应其独特的分割和处理需求。

图2：精子鞭毛分析的横向定位模块示意图（图1中的步骤2）。(a) 原始相位z堆栈的初始处理使用求和投影（SP）方法。之后，投影结果进行分割，以确定精子头的横向（x,y）位置。这些坐标对于定义精子头的焦点平面至关重要。随后，z堆栈经过3D时间过滤处理，以消除静态背景元素，从而增强动态鞭毛的可见性。使用精子头的3D（x,y,z）坐标，建立相应的3D感兴趣区域（ROI）。(b) 将SP重新应用于时间过滤后的3D ROI，以便将鞭毛的3D结构投影到2D平面上。然后对投影图像进行处理，通过分割和鞭毛核心校正算法来精细化鞭毛的表示。鞭毛核心的精细分割能够确定鞭毛的横向（x,y）位置。全息图重建过程产生了两种类型的信息：振幅和相位。为了准确确定精子鞭毛的横向坐标（x,y），我们使用相位z堆栈，因为它提供了更高的对比度和更好的信噪比。首要目标是定义包含细胞的3D感兴趣区域（ROI）（图2a）。该过程从在样本体积内初始识别和定位细胞开始。为此，采用了一种常用的降低图像z堆栈维度的技术，即求和投影（SP）[35]。尽管这种方法可能不适用于所有情况，因为它有可能降低某些样本的信噪比，但它仍然是处理大多数3D图像的可靠技术。此外，当与额外的图像处理步骤结合使用时，SP已被证明对全息图像有效。然后通过对求和图像应用一系列图像处理技术来实现头部分割。首先使用Yen的阈值方法[36]将图像二值化。接下来，应用形态学闭合、小对象去除和边界清洗来精细化二值图像。从清洗后的图像中计算出中轴和距离变换，并使用对应于最大距离的坐标来确定精子细胞头的横向位置。结合下面描述的轴向定位算法，可以得到精子头的3D位置。真核生物的鞭毛由于其纤细的形态和快速的动态特性，在图像处理方面带来了显著挑战，这通常会导致对比度降低和模糊。为了解决这些问题，我们对相位z堆栈序列进行了3D时间过滤，从而提高了信噪比并改善了摆动鞭毛的可见性（图3）。这一步骤去除了来自实验系统的背景、伪影和静态噪声[37]。此外，3D时间过滤还可以用来计算样本中静止物体的3D（x,y,z）坐标，通过提供关于周围环境的上下文信息来帮助解释运动。与通常用于图像分析的传统时间过滤算法不同，3D时间过滤是在z堆栈的所有图像上进行的，而不仅仅是在单个平面上。对于每个z堆栈平面计算平均值图像，共同形成整个帧序列的背景z堆栈。然后从每个z堆栈中减去这个背景，从而提高感兴趣物体的对比度和可见性，包括摆动的鞭毛（图3c）。

3D时间过滤通过从全息z堆栈中去除静态背景噪声来提高鞭毛的可见性。(a) 背景z堆栈计算方法。对于所有帧中的每个相应平面（t0, t1, t2,…,tn），计算平均值图像。这些平均图像随后被编译成一个新的z堆栈——背景z堆栈。(b) 3D时间过滤的第二阶段涉及从分析的堆栈中减去计算出的背景z堆栈，从而消除z堆栈每个平面的背景和静态元素。(c) 一个z堆栈平面的过滤效果示意图。该过程显著提高了鞭毛的可见性，特别是在远离细胞头部的部分（由箭头指示）。通过在每个帧中定位精子细胞头和中部，我们在每个帧中定义了一个3D ROI，该ROI保持头部中心固定，同时捕获被追踪鞭毛周围的区域。ROI最初由处理流程自动生成，之后用户验证其正确性。如果自动定义的ROI没有完全包含鞭毛的形态或需要细化以确保稳健的分析，用户可以相应地调整其尺寸。可以根据需要调整此ROI的横向尺寸，以确保它包含整个鞭毛。这个子堆栈的轴向尺寸取决于所使用的光学系统和重建参数。此时，我们已经获得了一个经过过滤处理的3D ROI，以提高信噪比。通过前面的处理步骤优化的子堆栈，为后续的横向定位步骤奠定了基础（图2b）。为了减轻噪声和平面外配置对后续投影步骤的影响，分析仅限于这个ROI，而不是整个重建的体积。在更具挑战性的情况下，工作流程还允许手动进行横向定位，当自动分割变得不可靠时可以省略基于投影的检测步骤。再次应用求和投影（SP）将3D ROI压缩成单个2D图像。事先进行时间过滤非常重要，因为它可以减少背景噪声，从而得到鞭毛形态清晰定义的2D图像。然后使用这个增强后的图像进行后续的分割步骤。这种表示方法的分割效果会受到鞭毛相对于光轴方向的影响。只要鞭毛段在单个像素内没有完全横向共位，就能保持可靠的分割。实际上，即使鞭毛的部分与光轴局部对齐，保持横向分离的段仍然可以检测到。因此，主要是平面外的方向降低了对鞭毛的有效采样密度，而不是导致定位完全丢失。在鞭毛段与光轴完全对齐的极端情况下，多个点可能在投影中横向共位，从而在这些区域产生局部歧义和重建精度降低。分割是通过一系列图像处理步骤来执行的，以提高对比度并隔离鞭毛。首先，使用高斯滤波器平滑求和投影图像，然后进行强度重新缩放以优化对比度。接着使用Yen的阈值方法[36]对鞭毛进行分割。接下来，应用二值膨胀和小对象去除作为必要的形态学操作来精细化结构并消除伪影。然后使用Lee的算法[38]对得到的二值图像进行骨架化，以提取一个像素宽度的鞭毛核心。最后，使用基于邻近性的方法对骨架点进行排序，确保从鞭毛基部到尖端的空间顺序的一致性。进一步通过校正过程细化核心，该过程基于最大强度投影（MIP）[35]图像，识别每个鞭毛点垂直邻域内的最高强度像素，从而提高位置精度。这种校正提高了横向定位的准确性，并减少了错误识别的点数。通过这些处理步骤，我们提取了一系列对应于鞭毛上点的x,y坐标。点的数量随着鞭毛的长度和目标的放大倍数而变化，因为该方法试图识别鞭毛上的每个像素。这有效地表示了一个2D追踪框架。通过将其与后续部分中描述的轴向定位算法结合起来，我们重建了鞭毛的3D结构。

2.1.3 轴向定位
轴向定位是3D追踪算法中的一个基本组成部分，它允许从2D描述转换为3D描述运动。有几种现有方法可以用来确定细胞沿光轴的位置。有些方法需要准备参考库[10]或校准过程[11, 13, 14]，这可能会影响追踪精度，并阻止它们在不同的测量场景中提供通用解决方案。其他方法通过量化图像清晰度来确定位置[39]，但这些方法对于鞭毛这样的薄而复杂的结构效果不佳。在定量相位成像中应用深度学习的方法，特别是用于细胞的3D追踪，正成为一种有前景和创新的方法[40]。然而，这些深度学习方法的有效性和准确性取决于训练数据的质量和相关性。在这里，我们介绍了一种新的方法，它规避了现有方法的局限性。我们方法的基本原理在于通过将问题从全息重建产生的图像z堆栈的3D分析简化为沿光轴的振幅轮廓的1D向量分析来简化问题。在横向定位步骤中，我们已经识别出属于鞭毛的点（x,y）。使用这些坐标，我们通过重建的图像z堆栈分析这些位置沿光轴的振幅轮廓。处理过程包括检查振幅轮廓以找到Gouy相位异常的位置（图4）。相位异常理论指出，波通过几何焦点时会发生额外的π相位移动[41]。通过识别这种移动的位置，可以使用沿光轴的单一振幅轮廓检测到焦点平面，从而将2D衍射图案的分析简化为1D轮廓的分析，并节省计算资源。鉴于全息重建生成的数据量巨大（单个帧的大小可以达到540 MB，具体取决于重建参数），这一点尤其有益。此外，该方法消除了由于切片平面选择错误或图像中存在噪声而产生的错误。

轴向定位（图1中的步骤3）确保了在较大深度处的样本精确追踪，保持了高精度。(a) 沿光轴的样本体积横截面，其中红线穿过点扩散函数（PSF）的中心，标记用于轴向定位的轮廓线。样本平面中重建z堆栈的深度为428 μm，z堆栈平面之间的步长（距离）为1 μm。(b) 通过PSF中心（对应于横向定位确定的x,y坐标）的振幅轮廓（红色），以及holoV3C算法的结果，即标识出的z位置，用绿色标记。通过利用光沿光轴的连续性，进一步提高了算法的精度，允许在处理1D轮廓时进行插值。检测Gouy相位异常的方法包括几个步骤。首先，对振幅z堆栈应用3D时间滤波以减少噪声和背景信息。接下来，通过在细胞的x,y位置沿光轴采样来生成振幅剖面。然后使用1D高斯滤波器[42]对剖面进行平滑处理，并进行插值以提高分辨率。最后，将z位置确定为振幅剖面一阶导数最大值附近的拐点。我们的算法能够根据前一步确定的横向(x,y)坐标精确地确定轴向位置(z)。该方法支持在数毫米深的样品中进行数字重新聚焦[19]。通过分析1D振幅向量，该方法可以在较大的采样深度范围内精确检测z坐标。在所示的示例中，能够在轴向方向上跨度428微米的重建z堆栈中成功定位鞭毛点（图4）。重要的是，这个值指的是重建搜索体积的高度，而不是鞭毛本身的轴向位移。更大的可访问采样体积可以提高不同深度分布的样品的实验吞吐量，并且能够在较长的轴向范围内跟踪细胞轨迹，同时解析它们的鞭毛运动。此外，由于鞭毛的轴向位移事先是未知的，因此足够大的重建深度可以确保在不需要预先定位的情况下捕获完整的运动。这一能力有效利用了全息显微术的成像潜力，满足了重建3D结构的另一个先决条件，即需要足够的采样体积。成像体积的尺寸主要受显微镜物镜的光学参数决定，但也受到照明相干性和物体散射特性的影响。然而，通过调整全息重建参数，可以扩展轴向尺寸，从而显著增加可访问的成像体积[43]。

2.1.4 解释
holoV3C方法的最后阶段将前几阶段定位的原始3D点转换为适合研究具体目标的参数。这一阶段具有高度适应性，允许修改或扩展参数集。空间和时间数据被综合起来，以实现鞭毛跳动模式的定量分析，从而提取出跳动频率、振幅和传播方向等指标。这种可适应性框架简化了新参数的引入，以便更好地捕捉细胞或鞭毛的功能特性。通过这种方式，最终模块确保了在不同研究背景下的广泛适用性，并允许持续改进分析流程。以下部分将展示该模块在分析鞭毛动态方面的应用示例。

为了评估我们方法的有效性，我们分析了两种不同的细胞类型：小鼠精子和原生动物R. americana。选择这些细胞是因为它们具有不同的形态和鞭毛跳动模式，这共同检验了算法的多样性。我们的测量表明，小鼠精子头部大约为8.09微米×3.13微米，而R. americana的细胞体类似于半个核桃壳，长度约为8.38微米，横向宽度约为4.61微米。小鼠精子的鞭毛相对较宽（1微米）且较长（100微米），可以作为3D跟踪方法的基准，特别是因为大多数当前的3D跟踪鞭毛的方法都集中在精子鞭毛上。在我们的实验中，单个精子细胞体自然附着在玻璃载玻片上。然而，这并没有影响横向定位，因为每个帧都确定了精子头部的位置，无论其附着情况如何。我们的方法成功检测到了以10赫兹频率记录的小鼠精子鞭毛的完整长度，在每个z堆栈中大约有600个点（图5）。通过视觉检查以及我们测得的鞭毛平均长度（102.9微米）与先前研究中报告的长度（96.5微米）[44]之间的良好一致性，确认了完整长度的检测。跟踪算法的结果显示了小鼠精子细胞的鞭毛的精确运动。(a–d) xy平面上精子鞭毛的图像处理和分割。(a) 单个z平面上带有可见精子细胞的相位重建。(b) 3D时间滤波的效果。这一步去除了大部分背景、噪声和静止元素，提高了鞭毛的可见性。(c) 鞭毛核心检测算法的结果（红色）。(d) 鞭毛核心点（红色）叠加在原始相位图像上。(e) 同一细胞的鞭毛在3D空间中作为时间序列绘制。图示显示了1秒内的鞭毛运动序列，数字代表连续的十帧。数据以每秒10个体积的频率在108.7微米×108.7微米×32.6微米（x，y，z）的测量体积内获取，对应于重建的3D视野。结合横向和轴向定位模块，有效地重建了小鼠精子鞭毛的3D形状以及其随时间的运动模式（图5e；电影S1）。大量的重建点保证了捕捉鞭毛形状的高保真度。由于我们算法的计算复杂度为O(N)，其中N表示每个重建体积（即单个时间点的每个全息图）中定位的鞭毛点数量，处理时间与采样密度和重建参数成线性关系，保持了每帧的低计算成本。使用标准PC（3.50 GHz Intel Xeon E5 v4，24 GB RAM，固态硬盘），我们的算法处理32位图像堆栈大约需要2.78秒/帧——横向定位需要1.07秒，轴向定位需要1.71秒。对于轴向定位，每个鞭毛点分别计算，平均处理时间为每点0.003秒。这一应用验证了holoV3C方法的适用性和有效性，并强调了其在量化精子运动动力学方面的能力。此外，通过结合在横向定位阶段确定的精子细胞头部的3D位置，我们的方法提供了一种工具，通过整合头部和鞭毛跳动模式的3D跟踪来研究运动性。对于我们的第二个应用——原生动物R. americana的鞭毛，其高度非平面的鞭毛跳动模式对现有的3D跟踪方法构成了挑战。在这个实验中，观察了处于摄食阶段的R. americana，其前鞭毛表现出复杂的3D跳动。这些测量以200帧/秒的频率进行。我们的主要目标是评估在形态和鞭毛宽度都远小于小鼠精子细胞的情况下，轴向定位算法的性能。鞭毛的微小尺寸、复杂的3D形状（包括更多的垂直于平面的部分）以及较低的散射效率大大降低了鞭毛的可见性，从而复杂化了图像z堆栈的处理。尽管面临这些挑战，我们的方法仍能捕捉到鞭毛的3D形状（图6；电影S2），证实了其对直径小至200纳米的结构（许多吞噬性鞭毛生物的典型尺寸）的适用性[45]。具体来说，我们在每个z堆栈中收集了大约53个沿鞭毛的点，测得的前鞭毛长度为17.8微米。尽管由于关于R. americana鞭毛形态的现有研究有限，直接比较具有挑战性，但这些定量数据突显了我们方法在解析这种微小和复杂鞭毛结构方面的独特能力。3D跟踪的一个特殊障碍是R. americana的独特跳动模式，其特征是鞭毛的部分几乎平行于光轴对齐——这种情况使用许多现有方法进行跟踪时会遇到复杂问题。尽管如此，我们的方法仍能处理这种复杂性并重建整个结构，证明了其在精确捕捉高度非平面3D鞭毛运动学方面的潜力，这是微生物运动学研究中的关键挑战[46]。使用holoV3C算法跟踪R. americana的鞭毛能够实现跳动模式的高时空分辨率。(a) 单个z平面上未经处理的相位重建，显示了R. americana身体的强烈信号；鞭毛不可见。(b) 3D时间滤波对单个z平面的影响。这一处理去除了静止信号，提高了鞭毛的可见性。(c) 单个z平面上全视野的相位重建。前鞭毛的定位结果用红色标记。后鞭毛也可见。(d) 同一细胞的鞭毛在3D空间中绘制。数字表示序列中每隔5毫秒的连续帧。数据以每秒200个体积的频率在69.8微米×69.8微米×26.8微米（x，y，z）的测量体积内获取，对应于重建的3D视野。

轴向分辨率是一个关键但经常被忽视的参数，用于评估3D跟踪方法的性能。它量化了计算轴向位置的精确度，是衡量3D跟踪方法性能的关键指标。能够沿光轴定义位置的能力从根本上区分了3D跟踪和2D跟踪。因此，准确报告轴向分辨率对于表征3D跟踪技术和实现方法间的有意义比较至关重要。然而，轴向分辨率不仅受跟踪方法本身的影响，还受其他因素如样本形态、散射特性或缺失固定等因素的影响。这些因素往往被忽视，但可以显著影响轴向分辨率。基于现有的确定3D跟踪方法中轴向分辨率的策略[47, 48]，我们将轴向分辨率定义为轴向位置的均方根误差（RMSE）。对于每个跟踪点，我们确定其z坐标并将其与相应的参考位置进行比较。为基于点的轴向定位建立实验真实值仍然具有挑战性，因为这需要一种能够以更高精度和可靠性确定3D参考位置的独立方法。据我们所知，目前还没有任何可用的技术能够在不引入自身不确定性和系统偏差的情况下提供此类测量，尤其是在轴向维度上。在没有绝对真实值的情况下，参考轴向位置是使用独立程序（下面描述）计算的，然后通过手动视觉检查进行验证。这种检查作为验证步骤，而不是确定参考位置的主要方法，因为直接的视觉分配可能会不够精确且更容易受到偏差的影响。然后将残差误差（定义为测量z坐标与参考z坐标之间的差异）用于计算均方根误差（RMSE）。我们进一步研究了同一3D跟踪算法在应用于不同跟踪目标（即聚苯乙烯颗粒和小鼠精子鞭毛）时如何产生不同的轴向分辨率。这种比较展示了算法性能与样本特定特性之间的相互作用，强调了根据上下文评估轴向分辨率的必要性，以确保评估的准确性和可靠性。小而球形的颗粒是最常用的轴向分辨率估计形态[10, 13, 31, 47, 48]，使它们成为我们分析的理想起点。我们在去离子水中悬浮的随机分散的聚苯乙烯颗粒（直径1.05微米，标准差=0.03微米，microParticles）上进行了测量，采样时间不同（5帧，?t = 94毫秒）。对于每一帧，分析了30个颗粒。每个颗粒在其边界内定义了五个横向采样点：一个中心点和四个排列在Von Neumann邻域内的外围点[49]。在五个采样时间内，总共获得了750个数据点。选择中心点是为了避免来自横向定位算法的潜在偏差，因为这不是本次分析的主要关注点。对于每个(x,y)位置，使用轴向定位模块确定了相应的轴向坐标(z)。每个粒子的参考轴向位置被定义为五个计算出的z值的平均值，这样可以减少随机测量噪声和系统相关残差变化的影响。这些平均位置还通过视觉检查进行了进一步评估，以确认其与预期的焦平面的一致性。选择平均位置而不是通过视觉确定的参考位置，不仅是为了最小化与手动识别每个粒子焦点位置相关的潜在错误，也是为了减少与成像系统本身相关的错误。在对每个粒子进行基于局部平均值的残差计算后，采用了四分位数范围（IQR）方法[50]来确保数据集的完整性。我们的方法实现了0.053微米的轴向分辨率（以均方根误差RMSE计算），适用于聚苯乙烯粒子（表1）。表1. 3D跟踪方法在轴向定位方面的性能（粒子：n = 750；鞭毛：n = 17,500）。均方根误差（μm） 平均偏差误差（μm） 最大误差（μm）


鞭毛 0.247 ?0.016 0.676
粒子 0.053 0.003 0.131


由于观察到乳胶珠测量和3D鞭毛重建之间的z精度差异[13]，我们还评估了该方法应用于鞭毛时的分辨率。为此，我们在35个采样时间点（Δt = 94毫秒）测量了小鼠精子的鞭毛。每个采样时间点识别出500个鞭毛点，总共获得了17,500个鞭毛点。横向（x,y）位置是手动确定的，从而避免了可能由横向定位算法引起的任何不准确性。鉴于手动确定单个鞭毛点z位置的难度，通过平滑z维数据来获得参考位置。沿着z轴应用了Savitzky-Golay滤波器[51]（窗口大小95，多项式阶数3）来获得参考鞭毛形状。这个平滑后的鞭毛作为计算17,500个点残差的基础，之后使用四分位数范围（IQR）方法[50]去除了异常值。然后我们计算了均方根误差，并进一步比较了鞭毛和粒子分析的性能，计算了平均偏差误差[50]和两个数据集的最大定位误差（表1）。我们的方法对于聚苯乙烯粒子实现了0.053微米的轴向分辨率（均方根误差，或RMSE），对于精子细胞鞭毛实现了0.247微米的分辨率，展示了其在3D跟踪应用中的精确度。对于这两个样本，跟踪方法显示出较低的平均偏差误差（MBE）值。这些最小的MBE值表明系统偏差可以忽略不计，这强调了该方法在不同样本类型中的适应性和可靠性。此外，最大误差值也较低，精子鞭毛为0.676微米，粒子为0.131微米。这些低值表明轴向定位方法与真实位置的偏差很小。这些指标共同强调了该方法的广泛适用性和高精度。尽管MBE和最大误差的值都很低，但我们观察到两种样本类型的均方根误差（RMSE）之间存在显著差异。静止粒子和精子鞭毛的RMSE结果之间的差异表明，相同的跟踪方法对不同的测试对象会有不同的表现。样本特征以及测量系统参数，如图像像素大小或照明均匀性，对轴向分辨率有显著影响[52]。轴向分辨率的不准确估计可能导致对生物动态的误解，在定量模型中产生误差传播，并最终导致研究之间的误导性比较。认识到开发确定跟踪方法轴向分辨率的通用程序的挑战，我们强调了解决这一问题的重要性。建立社区共识的协议将有助于算法的评估和比较，并明确其适用范围。此外，为不同跟踪场景创建的基准数据集将作为验证和改进轴向定位技术的宝贵资源。


3 讨论


理解鞭毛复杂的、通常高度非平面的3D结构和运动对于揭示细胞运动机制在各种应用中的重要性[4]是显而易见的。然而，鞭毛的这种形态多样性，特别是具有显著的非平面组成部分，带来了技术和计算挑战[53]。为了应对这些挑战，方法必须结合高空间和时间分辨率、大体积采样能力以及计算效率，以确保在各种生物环境中的稳健和可靠性能。在这项研究中，我们提出了一种使用数字全息显微镜的方法来克服这一挑战。我们的方法展示了高轴向分辨率，对于跳动的小鼠精子鞭毛达到了0.247微米，对于聚苯乙烯粒子则达到了0.053微米，同时在大样本深度上实现了单像素级别的精确3D定位。这一能力是准确解析完整的、非平面的3D鞭毛运动学的关键特征。此外，该系统还实现了高时间分辨率的测量，每秒最多可拍摄200帧。这一帧率并非方法的固有限制，而是我们使用的成像相机的上限。现有的商业DHM设备能够以高达每秒100,000帧的速度捕捉图像，这表明了该方法在未来实现更高速度成像的可扩展性和潜力。我们算法的计算效率为在配备更高时间分辨率相机的系统中轻松实施提供了坚实的基础，使得跟踪动态行为（如3D鞭毛跳动）的进一步发展成为可能，并增强了时间细节。与现有的3D跟踪方法相比，我们的方法在轴向分辨率上取得了显著提高（以均方根误差计算，表1）。现有方法实现的轴向分辨率因成像技术而异。使用压电驱动物镜的光学显微镜提供的轴向分辨率为3.2微米，而多焦点成像分别实现了0.15微米[13]和0.12微米[11]。其他DHM方法也展示了0.15微米的分辨率[30, 31]。然而，许多方法并未明确报告轴向分辨率，使得直接比较变得困难，并强调了标准化基准的必要性[6, 12, 27, 29]。相比之下，我们的holoV3C算法实现了0.05微米的轴向分辨率（表1），比多焦点和DHM方法提高了三倍，比压电驱动的光学显微镜提高了超过一个数量级。我们还发现，3D跟踪的轴向分辨率与被跟踪对象的属性有关（表1）。这种依赖性可能是由多种因素驱动的，包括几何形状、体积尺寸、散射效率以及对象的运动特性。因此，我们建议应该针对具体应用的材料和条件进行分辨率估算，以确保准确的量化。数字全息显微镜的一个优势，通过所提出的算法得到了增强，就是能够在大采样体积中实现3D跟踪。我们能够精确重建精子鞭毛在428微米深度范围内的3D动态。这与之前提出的DHM方法[27]相比提高了26倍，与多焦点成像[13]相比提高了21倍。沿光学轴扩展重建范围使得能够捕捉到具有显著垂直分量的3D鞭毛跳动模式，如在原生动物R. americana中观察到的那样。这一扩展的范围还使得能够测量样本内不同深度的生物体，从而提高了方法的吞吐量。我们的方法同时结合了高空间和时间分辨率以及计算效率，这对于生物成像的广泛应用至关重要。几种现有的方法依赖于复杂的计算技术来实现高轴向分辨率，这限制了处理速度和可扩展性。我们的算法实现了O(N)的计算复杂性，相比其他方法具有显著优势。采用全息反卷积[20]或拟合艾里环模式[21]的方法通常表现出O(NlogN)的复杂性，导致更高的计算成本。一些方法甚至达到O(N2)的复杂性[22, 23]，这进一步限制了它们的实际适用性。在这些计算复杂性的差异中，特别是在鞭毛跟踪的背景下尤为重要，因为在我们的精子细胞鞭毛应用中，每个时间点大约使用了600个点来准确解析鞭毛的形状。因此，O(N)算法相比O(Nlog N)算法在效率上将有九倍的提高，允许更流畅地处理更大的数据集并增强可扩展性。在未来的实现中，横向和轴向定位步骤可以卸载到图形处理单元（GPU）上，因为计算成本主要由体积图像处理和每个点的轴向定位构成，这两者都是本质上可以并行化的。因此，预计GPU加速将通过卸载密集数组操作（如过滤、分割和焦点度量评估）来减少运行时间。之前的数字全息研究报道，当计算密集的图像处理步骤转移到GPU架构上时，加速效果可达15×到20×[54]。然而，并非所有的定位流程组件都是完全并行化的，特别是涉及骨架排序和鞭毛核心校正的阶段，因此预计总体加速因子大约为4×到20×。在这种假设下，当前每帧2.78秒的处理时间在保守情况下可以减少到大约0.70秒，在有利条件下可以减少到大约0.14秒。重要的是，因为图像采集和定位是分离的阶段（图1），即使当前的处理时间也不会限制采集速率，后者仍然是跟踪快速动态运动的主要瓶颈。将我们的方法应用于精子鞭毛以及至关重要的原生动物R. americana，已经证明了其在准确量和测量鞭毛的完整3D形状和高度非平面运动学方面的有效性和可靠性。对于小鼠精子和R. americana重建的3D运动学与之前的观察结果一致。尽管小鼠精子具有相对较长的鞭毛，但它们的波形通常只是轻微的非平面[14]，因此轴向位移相对较小。相比之下，R. americana在进食过程中表现出更复杂和强烈的非平面跳动模式，细胞附着在基质上[46]。因此观察到的z位移范围与当前的生物学知识一致。通过结合高时间和空间分辨率以及计算效率，该方法为复杂、非平面鞭毛动力学的全面表征提供了坚实的基础，这些通常无法通过传统的2D或其他3D跟踪方法完全解析。这使得它在微生物学中的广泛应用成为可能，尽管需要根据具体情境调整某些方面（例如，轴向分辨率的量化）。实际上，holoV3C对自由游动的精子和其他物种的适用性取决于几个生物学和实验因素，因此必须逐个案例进行评估。相关因素包括细胞和鞭毛的散射特性、细胞体与鞭毛之间的相对大小和光学对比度，以及鞭毛的具体形态。此外，游泳过程中表现出的非平面运动程度和光学设置的特点，如照明条件和成像几何形状，影响鞭毛的可见性和重建质量。这些因素主要影响横向定位步骤的可靠性，而轴向定位在不同形态和运动学制度下相对稳健。所提出框架的模块化设计部分是由于这种变异性而激发的。通过将横向定位阶段与后续的重建和分析步骤分离，该流程允许根据给定数据集的特点和分析的目标来调整或替换定位组件。在当前的工作中，这种灵活性在从小鼠精子过渡到R. americana时被证明是必要的。虽然小鼠精子实现了完全自动的工作流程，但R. americana的更高形态复杂性和更明显的非平面鞭毛运动使得稳健的自动横向定位更具挑战性。更一般地说，对于主要表现为平面或轻微非平面跳动的细胞，自动化性能更为可靠。在这样的条件下，holoV3C预计可以完全自动化运行，因为横向定位变得更加稳健并且可以实现得更可靠。相反，对于具有强烈非平面运动特性或形态复杂性增加的细胞，可能需要额外的用户指导或适应性定位策略。开发一种完全自动化的定位策略来处理这种强烈的非平面运动模式是可行的，但这超出了本研究的范围。更广泛地说，能够研究高度非平面的3D鞭毛动态可以增强我们对细胞运动及其生物学和生态功能的理解。除了鞭毛分析之外，该方法还有更广泛的应用潜力，包括3D追踪细菌的运动。先前已经利用Gouy相位异常的方法在3D中定位细菌和细胞的质心[53, 55]。要实现这种潜力，需要调整算法的侧向定位步骤，以准确识别和追踪微生物细胞的质心，从而将其应用扩展到微生物运动的其他方面。

4 方法

4.1 伦理声明

所有涉及动物的实验程序都遵守国际伦理标准。动物研究得到了洛桑联邦理工学院（EPFL）动物研究伦理委员会的批准（许可证VD3290.1）。所有实验方案均按照相关指南和法规进行。

4.2 样本制备

小鼠精子样本由Sonia Verp（EPFL）提供。一只11周大的B6.CD45.1雄性小鼠根据批准的方案（VD3290.1）通过二氧化碳吸入后进行安乐死，然后通过颈椎脱位法处死。死后立即切除两个附睾并放在无菌滤纸上。在显微镜观察下，去除所有可见的脂肪组织和血液。使用细镊子在每个附睾上划5-6道切口，以促进精子的释放。将附睾转移到含有预培养基（CARD FERTIUP，Cosmo Bio LTD）的单独Eppendorf管中。然后将管子置于培养箱中，让精子游到培养基中。培养后，使用微量吸管从表面收集精子悬浮液，以尽量减少组织碎片并获得最具运动能力的精子。好气性淡水物种Reclinomonas americana（分离株ATCC50394）的样本由Alastair Simpson（达尔豪斯大学）提供。培养物在18°C下的Milli-Q水中维持，并加入0.3%的Miller's LB肉汤培养基。

4.3 DHM成像

本研究中使用的测量系统是一台传输式数字全息显微镜DHM T-1000（Lyncée Tec SA，瑞士），采用离轴配置。该系统包括一个666纳米的激光光源，通过光纤传输并随后准直；两个显微镜物镜，分别为40倍（NA = 0.75，HCX PL FLUOTAR，Leica）和63倍（NA = 1.3，HC PL FLUOTAR，Leica）；以及一个相机（acA1920-155um，Basler AG，德国），像素分辨率为5.86微米。全息图以每秒200帧（fps）的速度记录整个视野（1024 × 1024像素），并保存为8位单通道TIFF图像。数值重建生成相位和强度体积数据，表示为32位浮点数，并以二进制文件形式存储。样品在一个定制的0.5毫米高的观察室内观察，通过使用橡胶垫片将显微镜载玻片与盖玻片密封在一起。对于小鼠精子的鞭毛3D重建，以10体积/秒的速度获取体积数据集。常规3D分析使用标准轴范围重建，对应的成像体积为108.7微米 × 108.7微米 × 32.6微米（x，y，z）。为了评估可实现的采样深度，对同一序列进行了扩展轴范围重建，将重建轴范围增加到108.7微米 × 108.7微米 × 428.1微米，同时保持相同的侧向尺寸和处理参数。R. americana的成像速率为200体积/秒，重建体积为69.8微米 × 69.8微米 × 26.8微米（x，y，z）。

4.4 折射率假设

未对周围介质和成像细胞的折射率（RI）进行测量，因为精确测定需要专门的仪器，超出了本研究的范围。对于R. americana实验，周围介质主要由Milli-Q水组成，因此假设其折射率约为1.333。对于小鼠精子实验，虽然联系了缓冲液制造商，但没有获得精确的RI值。由于缺乏对这里分析的具体样本的直接测量数据，提供了基于文献的RI值作为参考。哺乳动物精子的折射率通常报告为约1.38。在本研究中，这一估计基于相关牛种（包括荷斯坦牛和韩国本地牛）的测量数据[56]。对于R. americana，从类似鞭毛生物的报道值推断出其折射率约为1.394[57]。因此，这些值应被视为跨物种的近似值，而不是对本次研究样本的直接测量结果。重要的是，我们认为这些近似值不会影响本研究的结果，因为分析依赖于相位和振幅的相对变化来进行特征定位，而不是依赖于绝对折射率的量。

4.5 算法设计与实现

holoV3C方法分为四个连续的核心模块：采集、侧向定位、轴向定位和解释（图1）。使用Lyncée Tec的Koala软件（版本8.6）对原始全息数据进行全息重建，包括相位解包和波前传播。核心定位算法（包括侧向（x,y）和轴向（z）定位阶段）是用Python（版本3.11）自定义开发的，使用了标准科学库，包括NumPy（版本1.26.4）、SciPy（版本1.13.1）和scikit-image（版本0.23.2）。通过将每帧的侧向（x,y）和轴向（z）坐标整合，实现了3D鞭毛重建。然后通过迭代应用这些定位模块到成像序列中的后续帧，从而生成鞭毛运动的时间分辨3D表示。

4.6 3D时间过滤和背景估计

应用了一种3D时间过滤程序来构建捕获整个重建序列中静态信息的背景z堆栈。由于给定序列内所有帧的重建参数保持不变，连续的z堆栈具有相同的采样体积、堆栈高度和轴向间距。对于小鼠精子数据集，采样体积为108.7微米 × 108.7微米 × 32.6微米，z堆栈高度为32.6微米，轴向间距为0.13微米。对于R. americana，采样体积为69.8微米 × 69.8微米 × 26.8微米，z堆栈高度为26.8微米，轴向间距为0.099微米。这种一致性确保了具有相同轴向索引的平面对应于相同的物理深度，从而可以实现直接对齐和时间平均。对于每个轴向平面（z），收集所有时间点的相应2D图像并逐像素平均以计算背景估计值。实际上，每个像素（x,y）的强度值在所有相同轴向索引的z堆栈中累积，并除以时间点的数量。这个过程对每个平面独立重复进行，从而得到一个完整的背景z堆栈，其中每个切片代表该轴向位置的时间平均值。由于动态结构（如鞭毛）随时间占据不同的空间位置，因此对平均背景的贡献较小，因此使用了时间平均值。背景是使用序列中的所有z堆栈计算的，因为数据的时间范围允许这样做而不会受到内存限制。对于较长的序列或内存有限的场景，可以采用滑动时间窗口等替代策略。从序列中的每个z堆栈中减去得到的背景z堆栈，以消除静态成分并增强动态特征（如拍动的鞭毛），同时保留周围的空间背景。

4.7 统计分析

我们通过计算测量z位置和参考z位置之间的均方根误差（RMSE）来量化轴向分辨率。对于聚苯乙烯颗粒，参考轴向位置是通过计算每个颗粒内五个侧向点的z坐标平均值（共750个点）然后通过视觉检查验证确定的。对于小鼠精子鞭毛，通过使用Savitzky-Golay滤波器（窗口大小95，多项式阶数3）对17,500个测量的鞭毛点进行平滑处理来确定参考轴向位置。使用四分位距（IQR）方法系统地移除了异常值。除了RMSE之外，还计算了两个数据集的平均偏差误差（MBE）和最大误差，以评估系统的偏差和该方法的最大精度界限。统计分析是在Python（版本3.11）中使用的，使用了包括NumPy（版本1.26.4）和SciPy（版本1.13.1）的标准库。在方法开发过程中，通过重复处理相同的全息图序列来评估重建过程的重复性。对于固定的z堆栈，侧向定位阶段会确定相同的鞭毛点集，随后的轴向定位在每次运行中产生相同的z位置。因此，重复处理相同的全息图不会在重建的3D鞭毛形状中引入额外的变异性。对于R. americana实验，只有当分析中使用相同的侧向点集时，重复性才有意义。使用不同的侧向点处理相同的全息图会捕获沿鞭毛的不同空间位置，因此不构成重复测量。当使用相同的侧向点时，会评估相同的振幅轮廓，并在重复分析中获得一致的z位置。

致谢

我们感谢Sonia Verp和Alexandre Widmer（EPFL表型基因组学中心）提供的专业知识和小鼠精子样本；Alastair Simpson（达尔豪斯大学）提供的Reclinomonas americana样本；Stocker实验室的同事们以及PHYMOT研究人员的反馈，这些反馈推动了项目的进展；以及Lyncée Tec团队在全息显微镜方面的指导以及引发的多次富有启发性的讨论。最后，我们感谢Elzbieta Sliwerska在物流和实验操作方面的支持，以及Russell Naisbit在编辑方面提供的宝贵意见。开放获取出版由苏黎世联邦理工学院通过Wiley - 苏黎世联邦理工学院协议与瑞士学术图书馆联盟的合作促进。

资金支持

我们衷心感谢以下来源的财政支持：欧盟的Horizon 2020研究与创新计划下的Marie Sk?odowska-Curie项目（授予编号955910）对P.N.的支持；瑞士国家科学基金会Ambizione项目（授予编号PZ00P2_202188）和波兰国家学术交流机构（授予编号BPN/PPO/2024/1/00008）对J.S.的支持；Gordon and Betty Moore基金会的水生系统共生倡议研究员奖（GBMF 9197）；Simons基金会的微生物生态系统原理合作项目（授予编号542395FY22）；瑞士国家科学基金会（授予编号205321_207488）；瑞士国家科学基金会Sinergia项目（授予编号CRSII5-186422）；瑞士国家科学基金会国家微生物组研究中心（授予编号51NF40_180575）对R.S.的支持；以及人类前沿科学计划（RGP014/2024）对T.K.的支持。

伦理声明

所有涉及动物的实验程序都遵守国际伦理标准。动物研究得到了洛桑联邦理工学院（EPFL）动物研究伦理委员会的批准（许可证VD3290.1）。所有实验方案均按照相关指南和法规进行。利益冲突

Tristan Colomb和Yves Emery在一家销售数字全息成像仪器的公司工作，但他们声明与本研究没有直接的利益冲突。所有其他作者均声明没有利益冲突。

数据可用性声明

支持本研究发现的数据可在Zenodo上公开获取：https://doi.org/10.5281/zenodo.13842914