miR-191 调节猪颗粒细胞的机能，并影响其对促卵泡激素（FSH）的响应性

《Reproductive Biology》：miR-191 regulates porcine granulosa cell functions and modulates responsiveness to FSH

　　

Zuzana Fabová | Barbora Loncová | Alexander V. Sirotkin

斯洛伐克尼特拉市康斯坦丁哲学大学自然科学与信息学学院

摘要

微小RNA（miRNAs）是卵巢功能的关键转录后调节因子，它们将内分泌信号与细胞内通路结合，以控制颗粒细胞（GC）的命运。尽管miR-191与卵巢生理和病理有关，但其在猪颗粒细胞中的作用及其与促卵泡激素（FSH）的相互作用仍不清楚。我们利用猪颗粒细胞研究了miR-191功能增强或缺失对细胞活力、增殖、凋亡和孕酮分泌的影响，并评估了其与FSH信号的相互作用。miR-191过表达可增强颗粒细胞的活力和增殖并抑制凋亡，而抑制则产生相反的效果。值得注意的是，miR-191减少了孕酮的产生，表明细胞状态更倾向于增殖而非分化。FSH可上调miR-191的表达，并刺激颗粒细胞的增殖、存活和孕酮释放。重要的是，miR-191过表达增强了FSH的增殖和抗凋亡作用，同时减弱了其对孕酮产生的影响。计算机模拟分析确定了参与细胞周期调节和卵巢功能的潜在靶标，支持了间接调节机制的存在。这些发现表明miR-191是颗粒细胞功能的调节因子，也可能是FSH驱动反应的精细调节器。

引言

卵巢功能依赖于卵泡生长、分化、类固醇生成和细胞存活的协调调节，主要由垂体促性腺激素（如FSH）驱动。FSH通过其受体（FSHR）激活细胞内信号通路，包括cAMP/PKA/CREB、PI3K/AKT和MAPK，从而调节颗粒细胞的增殖、分化和类固醇激素的产生[1]。除了内分泌调控外，卵巢生理还受到细胞内调控网络的严格控制。在这些调控网络中，微小RNA（miRNAs）已成为基因表达的关键转录后调节因子。miRNAs是长度约为23个核苷酸的小型非编码RNA，通过与目标mRNA 3′非翻译区的互补序列结合来抑制基因表达[2]。在卵巢中，miRNAs调节颗粒细胞的增殖、凋亡、分化和类固醇激素的产生，从而影响卵泡的发育和闭锁[3]、[4]、[5]。miRNA表达失调与卵巢病理及辅助生殖技术（ART）中的反应性下降有关[3]。

miR-191在卵巢组织和早期胚胎中高度表达，在生殖生理和疾病中具有依赖情境的作用[6]、[7]。在病理情况下，miR-191的功能各不相同：在子宫内膜异位症和子宫内膜样卵巢癌中，它通过DAPK1和TIMP3等靶标促进增殖和侵袭，同时抑制凋亡[8]、[9]；而在浆液性卵巢癌中，它通过靶向TRMT6抑制增殖和迁移[10]。此外，miR-191-5p作为卵巢透明细胞癌亚型分化的诊断标志物[11]。

除了在病理情况中，miR-191还存在于人卵泡液和胚胎培养基中的细胞外囊泡中，表明其参与正常的卵巢和胚胎发育[12]。在人颗粒细胞中，miR-191能增强细胞存活并调节类固醇生成，但其对孕酮的影响因细胞环境和分化状态而异[13]、[14]。

miRNAs与促性腺激素信号之间的双向相互作用越来越受到认可。FSH调节颗粒细胞中多种miRNAs的表达，而miRNAs反过来又调节FSH信号通路的关键组成部分[15]、[16]、[17]、[18]、[19]。然而，尽管有这些发现，miR-191在调节颗粒细胞对FSH反应中的作用仍不清楚。因此，我们假设miR-191调节颗粒细胞的关键功能并影响FSH诱导的反应。以猪颗粒细胞为人类卵巢研究的转化模型[20]，我们研究了miR-191功能增强或缺失对增殖、凋亡和类固醇生成的影响，并评估了其与FSH信号的相互作用。通过将功能性实验与计算机模拟靶标预测相结合，本研究阐明了miR-191在猪卵巢生理中的作用，从而推进了生殖科学中促性腺激素-miRNA相互作用的认识。

章节片段

寡核苷酸

miR-191模拟物（对应于成熟miR-191的双链RNA）、miR-191抑制剂（单链反义寡核苷酸）及其各自的阴性对照（NC）购自GenePharma有限公司（中国上海）。所有寡核苷酸均通过高效液相色谱法纯化（纯度>97%），并通过质谱法验证了序列完整性。寡核苷酸序列见表1。

卵巢颗粒细胞的制备、转染和培养

来自青春前期长白猪（6-8个月大）的卵巢

转染效率

通过RT-qPCR评估了miR-191在猪颗粒细胞中的调控效果。miR-191模拟物的转染导致miR-191表达上调，而非转染和NC转染的对照组则相反（图1）。这些结果与哺乳动物细胞中miRNA调控的公认方法一致，证实了我们的转染方案适用于后续的功能性实验[3]。

miR-191对细胞活力、增殖、凋亡和孕酮分泌的影响

转染后

讨论

本研究表明，miR-191调节猪颗粒细胞的功能，并参与促性腺激素驱动的反应的调节。通过功能增强和缺失实验，我们发现miR-191促进颗粒细胞的增殖和存活，抑制凋亡，并调节孕酮分泌，从而影响卵泡发育的关键过程。

结论

总之，miR-191是猪颗粒细胞增殖、存活、凋亡抑制和孕酮释放的调节因子，并参与FSH诱导的细胞反应的调节。数据支持一种模型：miR-191作为促性腺激素信号的精细调节器，促进增殖和抗凋亡过程，同时抑制与分化相关的类固醇生成活动。这些发现加深了人们对miRNA-促性腺激素在卵巢中相互作用的理解

作者贡献

Z. Fabová和B. Loncová组织、展示和分析了数据；撰写了初稿；并审阅和修改了手稿。A.V. Sirotkin监督了研究并审阅和编辑了手稿。

伦理批准

本研究使用了从屠宰场获得的卵巢中分离出的猪颗粒细胞，未涉及活体动物。实验程序获得了斯洛伐克尼特拉市康斯坦丁哲学大学伦理委员会（作为机构动物护理和使用委员会IACUC）的批准，批准号为EC/2023/01。该研究符合欧盟关于用于科学研究的动物保护的2010/63/EU指令

资助

本研究由斯洛伐克教育、科学和体育部的科学资助机构（VEGA）通过VEGA 1/0133/25项目资助。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能存在影响本文所述工作的财务利益或个人关系。