《Reproductive Toxicology》：FSH mediated endocrine disruption potential of Dibutyl phthalate in cultured ovine ovarian granulosa cells: cytotoxicity, oxidative stress, steroidogenesis, cell senescence and expression of related key developmental genes
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普纳姆·辛格（Poonam Singh）|博加帕蒂·桑帕特·库马尔（Bogapathi Sampath Kumar）|苏曼塔·南迪（Sumanta Nandi）|帕卢鲁·苏布拉姆尼亚姆·帕拉梅斯瓦拉·古普塔（Paluru Subramniyam Parameswara Gupta
普纳姆·辛格（Poonam Singh）|博加帕蒂·桑帕特·库马尔（Bogapathi Sampath Kumar）|苏曼塔·南迪（Sumanta Nandi）|帕卢鲁·苏布拉姆尼亚姆·帕拉梅斯瓦拉·古普塔（Paluru Subramniyam Parameswara Gupta）|苏坎塔·蒙达尔（Sukanta Mondal）
ICAR-国家动物营养与生理学研究所（ICAR-National Institute of Animal Nutrition and Physiology），印度班加罗尔阿杜戈迪（Adugodi, Bangalore, India）
摘要
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种广泛使用的邻苯二甲酸酯，因其干扰内分泌系统的特性和潜在的生殖毒性而被熟知。本研究旨在评估在FSH存在的情况下，DBP对培养的羊卵泡颗粒细胞（ovine granulosa cells）的形态、细胞毒性、氧化应激、细胞衰老、类固醇生成及相关关键发育基因表达的浓度依赖性影响。颗粒细胞从屠宰场来源的羊卵巢中分离出来，并在含有0、1、10、25、50和100 μM DBP的培养基中体外培养。通过评估核损伤、活性氧（ROS）生成、细胞凋亡和细胞衰老来检测细胞毒性反应。此外，还使用定量PCR技术测量了关键类固醇生成基因（CYP11A1、CYP17A1、CYP19A1、STAR、HSD3B1、HSD17B1）、激素受体（ESR1、ESR2、PGR、FSHR）以及促凋亡和抗凋亡标志物（BAX、CASP3、BCL2）的表达水平。为了评估类固醇生成功能，还测定了培养基中的雌二醇和孕酮水平。结果显示，DBP暴露会导致ROS水平、与凋亡相关的基因表达以及细胞衰老迹象的浓度依赖性增加，尤其是在≥25 μM的浓度下。有趣的是，尽管存在细胞应激，雌二醇的产生量仍随着DBP浓度的增加而显著增加。基因表达分析显示ESR1、FSHR和CYP19A1的表达显著上调，而ESR2和其他关键类固醇生成基因的表达则保持不变。这些发现表明，DBP可能通过选择性调节雌激素和FSH受体信号传导来改变雌激素活性，而不是通过全局性的类固醇生成酶转录激活来实现这一过程。此外，线粒体膜电位和核形态的变化表明DBP引发了亚细胞应激反应。总之，DBP对羊卵泡颗粒细胞产生了双重影响：一方面诱导氧化应激和细胞功能障碍，另一方面通过选择性受体途径增强雌二醇的合成。虽然FSH在DBP存在的情况下能刺激颗粒细胞的类固醇生成，但无法缓解DBP引起的细胞毒性。
引言
邻苯二甲酸酯是一类由邻苯二甲酸（1,2-苯二甲酸）衍生的二酯类化合物，广泛应用于工业和消费品中[1]。其中，邻苯二甲酸二丁酯（DBP）常作为增塑剂用于油漆、印刷油墨、纸张、地毯、混凝土、化妆品和指甲油等产品中，以提高聚合物的柔韧性[2][3][4]。然而，接触邻苯二甲酸酯与激素失衡有关，这种失衡会影响生殖健康和雌激素敏感组织的生长[5]。尽管邻苯二甲酸酯在体内会经历大量代谢并迅速被清除，但由于持续暴露和高吸收率，它们被归类为半持久性化学物质[6]。DBP已被确认为内分泌干扰物和生殖毒物，会对细胞活力和发育产生负面影响，这一点已有先前的研究证实[7][8]。虽然DBP被认为是一种卵巢毒物，但其剂量-反应关系尚未明确确定[9]。
卵泡颗粒细胞（GCs）在卵泡发生和类固醇激素合成中起着关键作用，因此对内分泌干扰化学物质（EDCs）特别敏感。研究表明，DBP会导致GCs稳态紊乱、激素生成受损、氧化应激加剧、细胞凋亡以及羊、牛和大鼠的生育能力下降[10][11][12]。我们实验室的最新研究显示，即使在低微摩尔浓度下，DBP暴露也会显著降低GCs的活力，增加氧化应激标志物（如丙二醛）的水平，损害抗氧化能力，并破坏雌二醇的分泌及细胞膜结构[10][13]。这些效应可能与芳香化酶活性的调节以及卵泡刺激素受体（FSHR）的上调有关，这可能通过非线性的、选择性的受体介导机制增强雌激素的生物合成[14]。但也有研究指出，DBP会通过下调FSHR来抑制FSH对大鼠GCs的作用[15]。此外，关于人类或啮齿动物模型的研究显示，DBP暴露会导致CYP11A1、CYP19A1和3β-HSD表达的变化[16][17]。
早期的研究主要关注混合内分泌干扰物的暴露或双酚类物质，而非特定的邻苯二甲酸酯。例如，双酚类增塑剂已被证明可以通过雌激素受体途径干扰羊GCs的类固醇生成[18]，但针对这种物种的邻苯二甲酸酯特异性研究较为有限。总的来说，这些观察结果强调了需要对DBP对GCs的影响进行详细的剂量-反应分析。我们之前的研究发现，即使在不含FSH的培养条件下，DBP也会对羊GCs产生不利影响[10][13]。FSH在DBP存在的情况下能否调节DBP引起的GCs毒性仍存在争议[14][15]。
羊卵巢的生理结构与人类卵巢功能有显著相似性，这为本研究选择了这一模型提供了理论基础[19]。我们假设FSH可以减轻DBP对羊GCs的毒性作用。因此，本研究在FSH存在的情况下，考察了不同浓度（0、1、10、25、50和100 μM）的DBP对体外培养的羊GCs的影响。通过评估细胞形态、氧化应激、线粒体膜电位、细胞衰老、基因表达谱以及雌二醇和孕酮的产生情况，本研究旨在阐明DBP引起的颗粒细胞功能障碍的细胞和分子机制，并确定FSH是否调节了这些效应。
章节摘要
化学品
除非另有说明，本研究中使用的所有化学品均购自Sigma Chemical Co.（圣路易斯，密苏里州）。已提供包括目录编号、来源物种、配方及纯度/等级在内的详细信息，以确保实验的可重复性。
培养基的制备及DBP工作浓度的确定
GCs培养基由Medium-199（M199；M4530，粉末配方，细胞培养级，Sigma-Aldrich）组成，并添加了0.3%的牛血清白蛋白（BSA；分数V，纯度≥98%，来自牛血清）。
细胞活力
与对照组相比，当GCs暴露于1 μM的DBP时，其活力显著下降（见表2）。DBP浓度进一步增加会进一步降低细胞活力，但这种差异没有统计学显著性。
单层细胞形成速率
培养5天后，单层细胞形成速率显著下降。对照组和最低处理组表现出最高的单层细胞形成率（分别为1.83 ± 0.03和1.81 ± 0.02）。
讨论
邻苯二甲酸二丁酯（DBP）是一种公认的内分泌干扰化学物质；然而，其对不同物种的卵巢影响及其作用机制尚不完全清楚。据我们所知，这是首次在羊GCs研究中发现DBP既能诱导氧化应激相关的细胞凋亡和细胞衰老，同时又能促进雌二醇的产生。这种双重毒性-雌激素效应表明了内分泌效应的非线性特征，不能仅用单一机制解释。
结论
我们的观察结果表明，DBP不仅通过氧化应激和凋亡途径干扰GCs的功能，还通过调节激素反应性来发挥作用，这可能会干扰正常的卵泡动态并导致生殖功能障碍。GCs暴露于DBP会导致ROS水平升高、细胞老化以及与凋亡相关的基因上调。这些效应在DBP浓度达到25 μM及以上时尤为明显。
资助
印度新德里的大学拨款委员会（University Grants Commission, UGC）[参考编号21/06/2015 (i) EUV]及所在机构的资助
CRediT作者贡献声明
苏坎塔·蒙达尔（Sukanta Mondal）：软件处理。帕卢鲁·苏布拉姆尼亚姆·帕拉梅斯瓦拉·古普塔（Paluru Subramniyam Parameswara Gupta）：数据管理。博加帕蒂·桑帕特·库马尔（Bogapathi Sampath Kumar）：撰写初稿、概念构思。普纳姆·辛格（Poonam Singh）：撰写初稿、概念构思。苏曼塔·南迪（Sumanta Nandi）：撰写、修订与编辑、数据可视化及实验设计。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文的研究结果。
致谢
我们感谢印度新德里的大学拨款委员会（University Grants Commission, UGC）[参考编号21/06/2015 (i) EUV]和ICAR-NIANP的主任提供的研究支持。作者还感谢Heena H.S在流式细胞术数据分析方面的帮助。
