维生素通过调节MMP-2和MMP-9的活性及表达，成为有效的癌症治疗方法

《Bulletin of the Korean Chemical Society》：Vitamins as potent cancer treatments through regulating the activity and expression of MMP-2 and MMP-9

　　**摘要**

基质金属蛋白酶（MMP-2和MMP-9）是癌症进展的关键调节因子，参与肿瘤侵袭、血管生成和转移过程。尽管已开发出合成抑制剂，但由于毒性和安全性问题，它们的临床应用仍然受到限制。在本研究中，我们探讨了常见维生素（维生素A（VA）、维生素B6（VB）、维生素C（VC）和维生素D3（VD）作为肺癌细胞（A549）和宫颈癌细胞（HeLa）中MMP-2/9表达和活性调节因子的潜力。免疫荧光和Western blot分析显示，所有检测到的维生素都能降低MMP-2和MMP-9的表达水平，其中VA、VD和VB在两种细胞系中表现出明显的抑制作用。VC的效果相对温和，尤其是在MMP-2表达方面。从机制上讲，这些抑制作用与MAPK信号通路的抑制有关，包括JNK和ERK的磷酸化减少。酶活性检测表明，VA和VD以剂量依赖的方式选择性地抑制MMP-2的活性，而未观察到对MMP-9活性的显著抑制。分子对接模拟表明，VA可能与MMP-2的S1′口袋结合，而VD则可能与催化结构域附近结合，这支持了它们的抑制潜力。总体而言，这些发现表明维生素，特别是VA、VD和VB，可以通过转录和MAPK信号通路调节来调控MMP-2和MMP-9的表达和活性。本研究突显了维生素作为低毒性治疗或辅助剂在靶向MMP介导的癌症进展中的潜在作用。

**引言**

通过识别各种生物标志物来理解癌症的病理机制对于癌症治疗至关重要。基质金属蛋白酶（MMPs）已成为与癌症相关的关键生物标志物之一。MMPs是一类含有锌的内肽酶，具有重组组织和分解细胞外基质（ECM）成分的功能。其中，MMP-2和MMP-9在癌症的发展和进展中起着关键作用，并被认定为癌症诊断的关键生物标志物。MMP-2和MMP-9最初以无活性的前体形式在多种细胞类型的内质网中分泌，随后通过胞吐作用释放到细胞外环境中，在肿瘤微环境中其产生显著增加。一旦在细胞膜上激活，MMP-2和MMP-9可以通过降解基底胶原IV型来促进肿瘤细胞的迁移和转移，使癌细胞能够侵入血液和淋巴系统。抑制MMP-2和MMP-9的活性可能会减缓疾病进展。MMP-2水平的升高会触发p38 MAPK/ML/SH27通路，包括促进行为的聚合。同时，JNK/ERK MAPK通路会刺激AP-1转录因子（c-Fos/c-Jun），直接上调多种癌症中的MMP-9表达；ERK还与整合素信号通路协同作用，调节乳腺癌中的MMP-2/9活性。MMP-2/9表达的增加也与癌症侵袭相关。在结肠、胰腺、前列腺和肺癌等恶性肿瘤中观察到了MMP-2的过表达；卵巢癌、胰腺癌和乳腺癌中也发现了MMP-9表达的升高。这些发现强调了通过调节MMP-2/9的表达和活性来破坏癌症进展机制的治疗潜力。维生素是维持机体生物平衡的重要微量营养素。在众多具有健康促进作用的维生素中，维生素A、B、C和D特别值得关注，因为它们参与了视觉、免疫反应和骨骼健康等关键生理功能。维生素A（VA）以支持健康视力而闻名，同时也有助于免疫系统、促进细胞生长和维持健康的皮肤和黏膜。维生素D，特别是其主要形式维生素D3（VD），对钙稳态和骨骼健康至关重要。B族维生素包括八种水溶性化合物：硫胺素（B1）、核黄素（B2）、烟酸（B3）、泛酸（B5）、吡哆醇（B6）、生物素（B7）和钴胺素（B12），它们对细胞代谢至关重要。每种B族维生素都有独特的功能，但共同作用于能量产生、DNA合成与修复以及神经系统的正常运作。其中，维生素B6（VB）在氨基酸和核酸的合成与分解以及葡萄糖、鞘脂和脂肪酸代谢中起着重要作用。多项荟萃分析表明，维生素B6在癌症治疗期间具有潜在的保护作用；然而，关于其对癌症进展中MMPs影响的研究仍然有限。维生素C（VC），也称为抗坏血酸，是一种强效抗氧化剂，可保护细胞免受自由基的损伤。

**图1** 本研究探讨的维生素结构。除了作为补充剂的角色外，维生素的异常水平可能会增加患癌症的风险或影响疾病的进展。研究表明，补充脂溶性维生素（尤其是VA和VD）在癌症管理中显示出治疗潜力。VA及其活性代谢物（如视黄醇、全反式视黄酸ATRA）已被证明能调节细胞分化和增殖，诱导癌细胞凋亡，并抑制血管生成。同样，维生素D通过多种机制表现出抑肿瘤效果。流行病学研究显示，绝经前妇女摄入足够维生素D可降低结直肠癌和乳腺癌的发病率。1,25(OH)2D（维生素D的活性代谢物）的抗肿瘤作用已被充分记录，包括抑制血管生成模拟和调节乳腺癌细胞中的TIMP/MMP平衡。1,25(OH)2D通过与核维生素D受体（VDR）结合来介导其生物效应，从而调节控制细胞增殖、分化和程序性细胞死亡等关键过程的基因活性。

与脂溶性维生素类似，VC也被研究其在癌症预防和治疗中的作用。多项研究表明，VC可能通过其抗氧化特性降低多种恶性肿瘤的风险，包括影响膀胱、乳腺和肺部的癌症。VC通过产生H2O2导致恶性细胞的氧化损伤，从而表现出选择性的抗癌效果。高浓度的VC通过抑制细胞迁移和破坏体外血管生成相关结构来干扰关键癌症过程。相比之下，VB在癌症进展中的作用尚不清楚。一些研究表明，VB可以减少肿瘤数量，抑制结肠癌小鼠的细胞增殖，并诱导c-myc和c-fos蛋白的表达，以及增强腺瘤细胞的凋亡。然而，流行病学研究表明，VB并不具有化学预防作用，反而可能增加癌症风险。因此，由于维生素可能直接或间接影响癌症的发生和/或进展，我们尝试通过靶向MMP-2和MMP-9来明确它们对癌症病理的详细机制。尽管必需微量营养素包含多种化合物，但本研究重点关注四种日常饮食和阳光中容易获得的维生素：VA、VD、VB和VC。这种方法旨在阐明这些维生素通过靶向MMP-2/9在癌症治疗中的潜在效果，并可能为习惯性维生素补充如何影响治疗效果提供见解。

**材料与方法**

**试剂和化学品**

视网膜醇（维生素A，VA）、吡哆醛5′-磷酸盐（维生素B6，VB）、抗坏血酸（维生素C，VC）和胆钙化醇（维生素D3，VD）购自Sigma–Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。水溶性维生素（VB和VC）进一步用双蒸水（ddH2O）稀释，而脂溶性维生素（VA和VD）则用不同浓度的DMSO稀释。细胞培养补充剂和培养基购自GIBCO BRL（美国纽约州格兰德岛）。所有用于本研究的化学品和抗体的信息列于表S1中。

**细胞培养**

本研究使用了多种细胞系，包括来自韩国细胞系库（首尔）的宫颈癌细胞（HeLa）和肺癌细胞（A549）。培养条件维持在37°C、5% CO2的湿润培养箱中。为了处理细胞中的维生素，使用了溶剂[水溶性维生素使用ddH2O，脂溶性维生素使用DMSO]，不同浓度的维生素以最终DMSO和/或ddH2O浓度1%的方式递送到细胞中。

**MTT实验**

通过MTT实验测定HeLa和A549细胞在维生素处理后的存活率。将HeLa和A549细胞（每孔15,000个细胞）接种到96孔板中并培养24小时。然后，分别用0、10、20、50、100和200 μM的维生素处理细胞（最终DMSO浓度为1%），继续培养24小时。随后向每个孔中加入25 μL MTT溶液（5 mg/mL，pH 7.4的PBS），并在37°C下再培养4小时。MTT在活细胞中代谢产生的甲苯胺蓝结晶通过加入100 μL溶解缓冲液（50%（v/v）DMF、20%（wt/v）SDS和2%（v/v）冰醋酸）在室温下过夜溶解。使用微孔板读取仪在590 nm处测量吸光度以评估细胞存活率。通过比较每个样品（分别用0、10、20、50、100和200 μM维生素处理）与对照组（非维生素处理）的吸光度值来确定相对细胞存活率。误差条为三次独立实验的标准误差（SE）。IC50值通过OriginPro软件计算得出。

**免疫荧光实验**

进行免疫荧光实验以研究维生素处理是否影响HeLa和A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达。细胞在处理的同时转染MMP-2或MMP-9质粒。MMP-2和MMP-9质粒是通过将相应的基因[MMP-2/CLH43A（Refseq NM_002428.2，2010 bp）和MMP-9/CLG43B（Refseq NM_004994.2，2124 bp）模板DNA插入pcDNA3哺乳动物表达载体中构建的，随后使用5-alpha大肠杆菌（New England Biolabs Inc.，美国马萨诸塞州）进行重组合成。将HeLa和A549细胞（每孔20,000个细胞）接种到96孔板中并培养24小时以确保适当粘附。随后，使用Lipofectamine 2000试剂盒（Thermo Fisher，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）转染MMP-2/9质粒，并同时用0–200 μM的维生素处理细胞（最终DMSO浓度为1%）。转染4小时后更换培养基以减少Lipofectamine的细胞毒性，并持续向培养基中添加所需浓度的维生素。细胞板继续培养，直到转染和维生素处理开始24小时后。然后进行免疫荧光染色。首先，向培养基中加入等量的4%戊二醛进行预固定。2分钟后，用新鲜的4%戊二醛替换预固定培养基，固定13分钟。固定后，用1× PBS洗涤细胞，然后在室温下用含有5%山羊正常血清（Abcam）和0.3% Triton X-100（Sigma–Aldrich）的封闭缓冲液封闭1小时。接着，用1:500稀释度的初级抗体[抗-MMP-2（ab97779）和抗-MMP-9（ab76003，均来自Abcam]处理细胞，孵育过夜（4°C）。之后，用1× PBS洗涤细胞，并用1:500稀释度的荧光偶联二级抗体[山羊抗兔IgG H&L（ab150080，来自Abcam）孵育2小时）。使用荧光显微镜（Nikon eclipse TE2000U，Nikon Instruments，美国纽约）和Texas Red滤镜组获得荧光标记图像。通过以下公式计算MMP-2和MMP-9的相对表达：[具体公式缺失]。

**Western blot实验**

在10 cm细胞培养板上培养A549细胞（4 × 10^6个细胞），培养24小时后加入维生素并继续培养24小时。随后通过胰蛋白酶消化收集细胞，再用冰冷的RIPA缓冲液裂解细胞。通过离心（20分钟，4°C）获取蛋白质提取物，并用BCA蛋白 assay进行定量。等量的蛋白质样本与4倍的SDS上样缓冲液（含有40%甘油、25 mM Tris、8% SDS、5%巯基乙醇和溴酚蓝）混合10分钟。随后将样品进行10% SDS-PAGE电泳。蛋白质通过Western blot转移到硝酸纤维素膜上（Thermo Fisher Scientific），在130 mA下处理3小时，然后在4°C下用3%（重量/体积）的牛血清白蛋白（Sigma-Aldrich）在Tris缓冲盐水（TBS）中封闭过夜，TBS中还含有0.1%的Tween-20（Sigma-Aldrich；TBS-T）。免疫印迹片分别与抗MMP-2、抗MMP-9、抗JNK、抗pJNK、抗ERK和抗pERK抗体反应2.5小时（所有抗体均来自Abcam），然后在室温下用山羊抗兔IgG（H+L）和HRP结合的二抗（1:2500；Promega，USA）在3% BSA的TBS-T溶液中孵育1.5小时。使用LAS-4000富士胶片仪（Fujifilm Corporation，日本）进行图像可视化。通过以下公式计算每个上样样品条带的相对蛋白表达量：

其中 是维生素处理后样品条带的强度， 是未处理对照样品条带的强度。

**明胶酶谱分析**

根据先前的描述，进行明胶酶谱分析以评估MMP-2和MMP-9的酶活性。简而言之，MMP-2（ab81550，来自Abcam）和MMP-9（911-MP-010，来自R&D Systems）与维生素在一系列浓度下（MMP:维生素摩尔比为1:0.01至1:10.000）在2×样品缓冲液[25%（体积/体积）甘油、50 mM Tris、0.01%（重量/体积）溴酚蓝]中孵育，并在37°C下以250 rpm的速度摇动。孵育后的样品放置在由7.5%（重量/体积）芳基酰胺组成的堆积凝胶上，然后再放置在由7.5%丙烯酰胺（重量/体积）和1 mg/mL明胶组成的分离凝胶上。凝胶随后用2.5% Triton X-100清洗，并在37°C下的反应缓冲液中孵育18小时[10 mM Tris，pH 7.35，0.02% NaN3，50 μM CaCl2，10 μM ZnCl2]。然后，凝胶用Coomassie blue（Bio-rad，Hercules，CA，USA）染色，并用甲醇/醋酸/去离子水（50:10:40）脱色。凝胶图像由GelPic LED Box（Koreabiotech，韩国）获取。根据维生素处理后样品条带的亮度与上样对照条带的亮度之比，使用ImageJ确定蛋白质的相对活性。

**动力学测定**

根据抑制剂筛选试剂盒的说明书（ab139446用于MMP-2，ab139448用于MMP-9，均来自Abcam），检测所研究化合物对MMP-2和MMP-9的抑制活性。维生素与MMP-2或MMP-9和测定缓冲液在37°C下孵育60分钟。然后向每个样品中加入10 μL MMP底物（1 mM），并每隔5分钟记录一次412 nm处的吸光度。维生素处理后MMP-2和MMP-9的相对活性计算如下：

其中Vi是维生素的反应速率，Vc是对照样品的反应速率。每个样品的反应速率通过吸光度与孵育时间的线性拟合的斜率确定。Ki值通过IC50确定如下：

其中IC50值由OriginPro计算得出，S是底物浓度（100 μM），Km是米氏常数（105 μM）。

**对接模拟**

根据先前发表的方法进行对接研究。使用AutoDock Vina对维生素与MMP-2（PDB: 1CK7）进行柔性配体对接研究。在Chem3D 20.1中使用的MMFF94能量最小化来优化配体结构以进行对接研究。维生素和肽的结构文件由AutoDock Tools生成并导入PyRx中，然后用于运行AutoDock Vina。搜索空间维度设置为包含整个肽。对接运行的彻底性设置为1024。维生素与MMP-2的对接姿势使用PyMol可视化。进一步使用Discovery Studio Visualizer预测MMP-2与VA/VD之间的相互作用。

**统计方法**

数据表示为三次独立实验重复的平均值±标准偏差。使用单尾t检验进行与对照样品的统计比较，p值<0.05被认为是统计学上显著的。

**结果**

**维生素对癌细胞的抗癌能力**

通过MTT测定法确定了维生素对HeLa和A549细胞的细胞毒性。此外，还进行了这项测定作为预先步骤，以支持MMP表达数据，确保化合物不会引起过多的细胞死亡，从而影响MMP表达结果的解释。脂溶性维生素（VA和VD）对两种癌细胞均表现出细胞毒性（图2）。首先，对于脂溶性维生素，VA在HeLa细胞的IC50值为75.7 μM，在A549细胞的IC50值为89.72 μM。相比之下，VD在HeLa细胞的IC50值为112.73 μM，在A549细胞的IC50值为192.84 μM。相反，水溶性维生素VB和VC即使在高浓度200 μM时也对两种细胞系没有显著的细胞毒性。根据我们的结果，脂溶性维生素比水溶性维生素具有更强的抗癌能力，表明它们对宫颈癌和肺癌具有更强的抑制作用。

**维生素对HeLa和A549细胞的抗癌能力**。图表表示了通过MTT测定法研究的维生素（IC50值）对两种细胞的细胞毒性。

**癌细胞中MMP-2和MMP-9的表达**

使用免疫荧光（ICC/IF）和Western blot测定法确定了HeLa和A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平（图3和4）。细胞在进行分析前先用维生素处理24小时。由于它们的毒性，实验中VA使用了25 μM，VD使用了50 μM，而水溶性维生素VB和VC使用了200 μM。根据HeLa和A549细胞的ICC/IF结果，添加脂溶性维生素后，MMP-2和MMP-9的表达显著下降（图3a,b, S1, 和 S2）。特别是VA使HeLa细胞中这两种酶的水平下降了一半以上，在A549细胞中分别下降了30%和20%。VD在HeLa细胞中可将MMP-2和MMP-9的表达分别降低40%和60%，在A549细胞中抑制了大约50%的MMP-2和MMP-9表达（图3c,d）。

**癌细胞中MMP-2和MMP-9的表达**。免疫荧光图像显示了（a）维生素处理后HeLa和A549细胞中MMP-2的表达情况，以及（b）MMP-9的表达情况。基于（a）和（b）的结果确定了（c）HeLa和A549细胞中MMP-2和（d）MMP-9的相对表达水平。实验条件：[VA] = 25 μM，[VD] = 50 μM，[VB] 和 [VC] = 200 μM；比例尺 = 100 μm。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005，与DMSO或H2O处理的对照相比。

**维生素处理后A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达**。（a）Western blot分析了维生素处理24小时后的A549细胞中MMP-2和MMP-9的情况，（b）根据实验条件确定了相对表达水平：[VA] = 25 μM，[VD] = 50 μM，[VB] 和 [VC] = 200 μM。水溶性维生素VB在两种细胞系中均显著降低了MMP-2和MMP-9的表达（在HeLa细胞中降低了50%以上，在A549细胞中降低了约80%；图3c,d）。

**MMPs的表达**

维生素对癌细胞中MMP-2和MMP-9的表达影响**

**维生素的抗癌能力**

通过MTT测定法确定了维生素对HeLa和A549细胞的细胞毒性。此外，这项测定也是作为预防步骤进行的，以确保化合物不会引起过度的细胞死亡，从而影响MMP表达结果的解释。脂溶性维生素（VA和VD）对两种癌细胞均表现出细胞毒性（图2）。首先，对于脂溶性维生素，VA在HeLa细胞中的IC50值为75.7 μM，在A549细胞中的IC50值为89.72 μM。相比之下，VD在HeLa细胞中的IC50值为112.73 μM，在A549细胞中的IC50值为192.84 μM。相反，水溶性维生素VB和VC即使在高浓度200 μM时也对两种细胞系没有显著的细胞毒性。根据我们的结果，脂溶性维生素比水溶性维生素更具毒性，表明它们对宫颈癌和肺癌具有更强的抗癌能力。

**癌细胞中MMP-2和MMP-9的表达**

使用免疫荧光（ICC/IF）和Western blot测定法确定了HeLa和A549细胞中MMP-2和MMP-9的表达水平（图3和4）。细胞在进行分析前先用维生素处理24小时。由于它们的毒性，实验中VA使用了25 μM，VD使用了50 μM，而水溶性维生素VB和VC使用了200 μM。根据HeLa和A549细胞的ICC/IF结果，添加脂溶性维生素后，MMP-2和MMP-9的表达显著下降（图3a,b, S1, 和 S2）。特别是VA使HeLa细胞中这两种酶的水平下降了一半以上，在A549细胞中分别下降了30%和20%。VD在HeLa细胞中可将MMP-2和MMP-9的表达分别降低40%和60%，在A549细胞中抑制了大约50%的MMP-2和MMP-9表达（图3c,d）。

**癌症细胞中MMP-2和MMP-9的表达**

**MAPK通路的调节**

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路是细胞外信号的关键介质，调节激酶激活和转录以调节细胞过程。本研究重点关注两个主要的MAPK组分：细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）和c-jun N末端激酶（JNK1/2）。我们研究了维生素处理后A549细胞中JNK和ERK及其磷酸化（活化）形式（p-JNK和p-ERK）的表达。我们的发现表明，维生素（VA、VD和VB）抑制了A549细胞中JNK和ERK的磷酸化活化通路（图5）。因此，VA降低了p-JNK和p-ERK的表达，这些结果与先前的研究相反，先前的研究表明视黄酸（RA，VA的一种活化形式）在神经细胞、Sertoli细胞和胚胎干细胞中诱导了MAPK通路的激活。这表明VA的调节活性可能因细胞类型而异。

**维生素对MMP-2和MMP-9的抑制活性**

根据抑制剂筛选试剂盒（ab139446用于MMP-2，ab139448用于MMP-9，均来自Abcam）的说明书，检测了所研究化合物对MMP-2和MMP-9的抑制活性。维生素与MMP-2或MMP-9和测定缓冲液在37°C下孵育60分钟。然后向每个样品中加入10 μL MMP底物（1 mM），并每隔5分钟记录一次412 nm处的吸光度。维生素处理后MMP-2和MMP-9的相对活性计算如下：

其中Vi是维生素的反应速率，Vc是对照样品的反应速率。每个样品的反应速率通过吸光度与孵育时间的线性拟合的斜率确定。Ki值通过IC50确定如下：

其中IC50值由OriginPro计算得出，S是底物浓度（100 μM），Km是米氏常数（10^5 μM）。

**维生素与MMP-2的对接模拟**

根据先前发表的方法进行了对接研究。使用AutoDock Vina对维生素与MMP-2（PDB: 1CK7）进行了柔性配体对接研究。在Chem3D 20.1中使用MMFF94能量最小化来优化配体结构以进行对接研究。维生素和肽的结构文件由AutoDock Tools生成并导入PyRx中，然后用于运行AutoDock Vina。搜索空间维度设置为包含整个肽。对接运行的彻底性设置为10^24。维生素与MMP-2的对接姿势使用PyMol可视化。进一步使用Discovery Studio Visualizer预测了MMP-2与VA/VD之间的相互作用。

**统计方法**

数据表示为三次独立实验重复的平均值±标准偏差。使用单尾t检验进行与对照样品的统计比较，p值<0.05被认为是统计学上显著的。然而，S1′口袋被认为是一个关键的决定因素，决定了抑制剂的选择性靶向。在MMP抑制剂的设计中，对这一口袋的占据情况已经被广泛研究。鉴于VA被预测会以类似的方式占据这一口袋，这些发现支持了一种合理的机制，即VA可能通过这种方式调节MMP-2的活性。图7（在图形查看器中打开）

对接模拟显示了（a）VA和（b）VD与MMP-2（PBD: 1CK7）之间的强相互作用：相应地，VA占据了S1′口袋的位置，并紧密结合到了S1′口袋的Ω环上。而VD则位于S1′口袋之外，靠近活性位点。参与这些相互作用的氨基酸残基包括：浅绿色表示疏水相互作用，绿色表示氢键的形成，淡粉色表示π-烷基相互作用。与VA不同，VD并没有进入S1′口袋，而是定位在催化结构域内，在那里它与这里的残基形成了π-烷基键和烷基键（见图7b和S4）。VD与MMP-2的结合亲和力相对稳定，为?8.1 kcal/mol，这可能是由于它能够改变酶的构象。讨论

脂溶性维生素在两种研究的细胞系中对MMP-2和MMP-9的表达表现出强烈的抑制作用，这一点通过ICC/IF和Western blot得到了证实。VA和VD的转录效应已在多项研究中进行了讨论。VA的代谢物RA可以与核激素受体（RARs/RXRs）结合，形成复合物，这些复合物可以与特定的DNA序列（RAREs）结合，从而激活或抑制靶基因。这一机制与在大鼠肺成纤维细胞和人牙髓细胞中观察到的MMP-2抑制作用一致。类似地，VD的代谢物1,25(OH)2D3通过与核VD受体（VDRn）与RXR的异二聚化来调节基因网络。在这些基因中，1,25(OH)2D3处理后被发现在人肺成纤维细胞和人子宫纤维瘤细胞中能够调节MMP-2和MMP-9基因的表达。因此，根据我们的结果和文献回顾，VA和VD可以直接下调HeLa和A549这两种不同癌细胞系中的MMP-2和MMP-9表达。此外，VB也被报道具有转录活性。此外，VB被认为可以通过多种机制改善动物模型中的MMPs/TIMP-1失衡，包括减轻氧化应激、抑制促炎细胞因子（TNF-α）的合成、抑制晚期糖基化终产物（AGEs）以及防止细胞外基质的积累。我们的发现通过显示VB处理后MMP-2和MMP-9表达的显著降低来支持这些机制见解，这可能归因于上述途径。另一方面，我们的研究还表明，用脂溶性和VB处理的MAPK蛋白被失活，这种效应可能有助于下调这两种细胞系中的MMP-2和MMP-9表达。考虑到MAPK蛋白（如JNK1/2和ERK1/2）在癌症进展和MMP调节中的作用，先前的研究表明抑制JNK和ERK通路可以减少MMP-2和MMP-9的表达。有观点认为p-JNK可以通过上调MMP来促进侵袭性表型。此外，p-JNK可以通过激活关键的转录因子（如c-Jun、ATF-2、Elk1和FO XO）来增强细胞增殖，从而导致参与细胞周期进展的基因表达。另外，ERK1/2在细胞增殖、分化和凋亡中起着关键作用。p-ERK在多种癌症中经常失调，它激活转录因子和其他蛋白质，导致参与细胞周期进展的基因表达，从而促进癌细胞的快速生长。此外，p-ERK还会增加MMP-2和MMP-9的表达，这可能促进癌细胞的侵袭和转移。根据我们的结果和先前的研究，维生素的治疗可能通过下调MAPK信号通路间接抑制这些金属蛋白酶。最近在MMP-2/9抑制剂方面的进展，如小分子（例如磺酰胺衍生物）和基于抗体的疗法（例如Andecaliximab），旨在通过聚焦活性调节来提高选择性和减少脱靶效应。然而，仍然存在挑战，包括由结构同源性引起的交叉反应、高抗体生产成本以及与历史上的广谱抑制剂（如Marimastat和Prinomastat）相关的临床转化障碍，这些抑制剂在试验中导致了肌肉骨骼毒性和疗效不佳。相比之下，维生素具有独特的优势：它们可以通过不同的途径调节MMP-2和MMP-9，包括直接调节MMP-2活性（VA和VD）、上调内源性TIMP（例如，维生素D在肺成纤维细胞中抑制IL-1β诱导的MMP-9同时提高TIMP-1/2）、转录调控（例如，ATRA在结肠癌细胞和人牙髓细胞中降低mRNA水平）以及本研究和先前研究中显示的MAPK信号通路的抑制。这些机制与它们的饮食兼容性和多种益处（例如，免疫调节、抗氧化作用）相匹配，使它们成为MMP相关病理中的更安全的辅助或预防剂。

在这项研究中，我们调查了维生素A、B、C和D对A549和HeLa细胞中MMP-2和MMP-9的表达和活性的影响。我们的发现表明，两种脂溶性维生素（VA和VD）和一种水溶性维生素（VB）显著降低了这两种细胞系中MMP-2和MMP-9的表达，这表明它们可能对这些酶的转录具有调节作用。此外，这些维生素还抑制了磷酸化活性形式的JNK和ERK的表达，这可能有助于它们对MMP-2和MMP-9生成的调节作用。还需要进一步详细研究脂溶性维生素和维生素B6在这些细胞系以及其他癌细胞中调节MMP-2和MMP-9表达的分子机制，以更深入地了解它们的抗癌机制。此外，这项研究还强调了这些维生素作为癌症治疗药物或与现有癌症疗法联合使用的潜力。

这项工作得到了韩国国家研究基金会（NRF）的支持，该基金会由韩国政府（科技信息通信部；MSIT）资助（授权号RS-2022-NR073879给H.J.L.），以及2024年孔州大学的研究年项目（给N.K.）。利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。数据可用性声明

支持本研究结果的数据可应相应作者的要求提供。