同源/异源二聚体底物影响了由NIS合成酶DesD组装的羟胺酸螯合剂的类型和数量

《Chemistry – A European Journal》：Homo-/Heterodimeric Substrates Bias the Type and Multiplicity of Hydroxamic Acid Chelators Assembled by a NIS Synthetase DesD

　　**摘要**

铁载体合成酶DesD能够生成羟胺酸螯合剂，这些螯合剂在基于金属的放射性药物以及分离有毒或商业金属方面具有应用价值。DesD已被用于以天然底物为对象的化学酶法合成中，但对非天然底物的研究较少。本研究探讨了通过将非天然底物N-羟基-N-谷氨酸半胱氨酸（2）与天然底物N-羟基-N-琥珀酰半胱氨酸（1）形成异源二聚体来增强其活性。来自Salinispora tropica的重组DesD（StDesD）被用于以1和2的同源及异源二聚体（3–6）为底物的化学酶法反应中，其中包括N到C位置的异构体。使用1和2的异源二聚体进行的化学酶法反应显示，其底物消耗量和产物类型与天然的单体1二聚体（3）相似，但底物消耗量约为单体2的三倍，这证明了这种掩盖方法的有效性。此外，二聚体底物还改变了StDesD生成其主要产物——奇数个结合位点的三聚体六齿螯合剂去铁胺E（DFOE）的能力，反而生成了偶数个结合位点的四聚体螯合剂（3, 5, 6）作为主要产物。虽然StDesD对单体和二聚体底物的最大迭代次数相同，但后者产生的螯合剂具有前所未有的孔腔尺寸和结合位点数量，包括一种能与Ga(III)形成3:1金属:配体复合物的二十齿螯合剂。

**图形摘要**

使用来自Salinispora tropica的铁载体合成酶DesD以及不同多度（单体、二聚体）和组成（同源/异源）的羟胺酸底物进行的化学酶法反应遵循不同的反应路径，这影响了螯合剂主要产物的结构，并表明DesD含有控制二聚体底物结合的位点。

**1 引言**

目前临床、工业和环境应用中的金属螯合剂所占据的化学空间较为狭窄，这限制了它们的应用范围。 exploring 更广泛的化学空间[1, 2] 可能有助于发现具有改进特性的新型螯合剂，而天然产物的丰富资源为这类研究提供了丰富的机会[3-5]。铁载体是一类由细菌和真菌产生的天然产物螯合剂，它们对Fe(III)具有高亲和力（Ka = 10^25–10^50 M^-1），使这些生物能够获取这种难以生物利用的必需营养物质[6-12]。去铁胺B（DFOB）是一种含有羟胺酸的铁载体，临床上用于治疗依赖输血的铁过载疾病[13, 14]。DFOB还作为89Zr(IV)或68Ga(III)的螯合剂，用于正在开发中的正电子发射断层扫描（PET）成像技术，用于癌症[15-21]或感染[22-25]的诊断。利用产生DFOB等铁载体的生物合成机制，可以为发现和生物工程化具有多种功能和应用的新金属螯合剂提供一个潜在平台[26, 27]。DesABCD生物合成基因簇负责DFOB和其他去铁胺类铁载体的生物合成[28, 29]。该簇中的最终酶是DesD，它是一种不依赖于NRPS（核酸合成酶蛋白）的铁载体（NIS）合成酶，能够催化内羟胺酸与氨基羧酸单元之间的酰胺键形成，从而生成多聚体产物。DesD催化从天然底物单体N-羟基-N-琥珀酰半胱氨酸（HSC）（1）（由DesABC上游生成[29-31]）形成寡聚体和端到端的环状螯合剂。来自Salinispora tropica CNB-440的重组DesD（StDesD）能够处理1，生成多种线性多聚体和相应的端到端环状螯合剂（图1），这表明StDesD的活性位点具有适应这些高阶多聚体的灵活性。**图1**
单体底物HSC（1）和HGC（2）；以及二聚体底物HSC-HSC（3）、HGC-HGC（4）、HGC-HSC（5）和HSC-HGC（6）的结构。**图1**
通过使用1进行的化学酶法反应，StDesD生成了线性和环状多聚体（O = 寡聚化；M = 环状化）（图31）。DesD及其功能类似物通过激活一个底物的羧基团，生成一个酰基腺苷酸中间体，从而为第二个底物的氨基团进行亲核攻击提供条件，形成酰胺键[29-33]。据提议，DesD具有两个不同的底物结合位点：A位点（A = 腺苷化）负责结合接受腺苷化的底物，C位点（C = 缩合）负责将第二个底物的N端定位为亲核试剂[32]。使用来自Streptomyces coelicolor的重组DesD（ScDesD）对1类似物N-羟基-N-谷氨酸半胱氨酸（HGC）（2）进行的反应表明，与1相比，二酸区域中烷基间隔区的增加长度降低了底物对A位点的亲和力，从而限制了腺苷化和产物的形成[32]。本研究设计了一种方法，旨在提高StDesD处理结构修饰的非天然C端底物的能力。该方法通过将2与天然底物1偶联，生成HGC-HSC异源二聚体（5）（N到C方向），从而掩盖2的C端修饰（图1）。1和5之间C端区域的相似性可能有助于促进StDesD对5的腺苷化。为了评估这种方法，合成了1和2的所有同源及异源二聚体组合（图1），并通过液相色谱-串联高分辨率质谱（LC-HRMS/MS）分析了与StDesD进行的化学酶法反应的产物谱型。随后将这些螯合剂与Ga(III)和Zr(IV)共同孵育，以确定其螯合功能并评估配位化学性质。

**2 结果与讨论**

单体（1, 2）和二聚体（3–6）底物是使用改进的文献方法（方案S2）[34-36]合成的。重组StDesD是使用之前建立的方法（支持信息）[31, 37]制备的，并通过将产物谱型与之前建立的产物谱型进行比较来评估酶的功能（图S1）[31]。化学酶法反应溶液包含辅因子MgCl2（15 mM）和ATP（4 mM）、缓冲液Tris/HCl（145 mM, pH = 8）以及等摩尔的底物（2.4 mM），并在37°C下孵育24小时。反应通过加入甲酸（2% v/v）终止，随后通过离心和过滤去除变性的酶。反应溶液随后通过LC-HRMS/MS进行分析。所有化学酶法反应都使用了不含StDesD的对照样品。

**2.1 StDesD与天然单体底物（3）**

初步研究评估了StDesD处理天然二聚体底物HSC-HSC（3）的能力。含有StDesD的反应溶液的LC-HRMS/MS分析显示，在总离子色谱图（TIC）中10–16分钟时出现了一些信号，而在不含酶的对照样品中这些信号不存在（图2）。进一步分析每个信号及其相应的MS/MSfragmentation模式，确认了StDesD介导的线性四聚体（HSC-HSC）2（7）和六聚体（HSC-HSC）3（8）的组装。相应的环状螯合剂（HSC-HSC）2-MC（10, DFOT1）和（HSC-HSC）3-MC（11）也被识别出来，以及二聚体环状螯合剂（HSC-HSC）-MC（9）（图2和方案S2）。通过提取离子色谱图（EIC）信号下的曲线下面积（AUC）测量估算了每种多聚体的相对丰度，这里假设这些产物的电离行为相似[38]。这一假设得到了含有等摩尔量的3和（HSC）3-MC（DFOE）作为真实标准的实验结果的支持（图S7a）。二十齿螯合剂10是丰度最高的多聚体（注意图2c–h中y轴的比例差异），占检测到的多聚体的85%（表S1）。在制备3的过程中，C端琥珀酸的酸性导致形成了HSC-HC（12）（方案S1），这导致了des-succinyl物种（HSC-HSC）-HSC-HC（13）和（HSC-HSC）2-HSC-HC（14）的形成，分别是由于7和8的de-succinylation以及/或StDesD介导的12的延长（图S5）。**图2**
含StDesD的反应溶液（a）或不含StDesD的反应溶液（b）的LC-MS TICs；以及线性多聚体[3]（c）、7（d）和8（e）；和环状多聚体[9]（f）、10（g）和11（h）的[M+H]+加合物的EICs。通过MS2 fragmentation模式（ESI，图S10和S11）确认了目标多聚体。多聚体以自由配体的形式表示，绿色圆圈代表酰胺键，X代表羟胺酸基团。使用标准曲线（ESI，图S9）来量化底物消耗量，作为反应效率的指标。这表明≥90%（定量上限）的天然二聚体底物3被StDesD消耗，这与天然单体底物1的消耗量相似（图3）[36, 39]。

**2.2 StDesD与非天然单体底物（2）和非天然单体二聚体底物（4）**

在标准化学酶法条件下，研究了StDesD处理C端修饰的单体底物2及其相应的单体二聚体底物4的能力。先前的研究表明ScDesD处理2的能力减弱[32]，不同DesD同源物产生的产物谱型存在差异，因此需要使用StDesD进行进一步研究[36, 39]。通过LC-HRMS/MS分析StDesD、2和辅因子的反应溶液，确认了StDesD介导的线性二聚体（HGC）2（15）和三聚体（HGC）3（16）的组装（图4a和S2）。相应的二聚体（HGC）2-MC（17）和三聚体（HGC）3-MC（18）环状螯合剂也被检测到（图4a和S2）。StDesD产生的产物谱型与ScDesD报告的产物谱型基本一致[32]，除了18，在StDesD系统中被检测到但在ScDesD系统中未被检测到。底物消耗量的测定显示，2的26%被StDesD消耗，远低于天然底物1的消耗量（图3）。

**2.3 StDesD与天然-非天然异源二聚体底物（5和6）**

鉴于StDesD对非天然单体底物2和二聚体底物4的腺苷化能力较弱，研究了提高非天然底物腺苷化的方法。合成了HGC-HSC异源二聚体（5），旨在掩盖2的C端修饰，并在模拟天然底物的区域促进腺苷化。分析含有StDesD和5的反应溶液，确认了线性四聚体（HGC-HSC）2（24）、六聚体（HGC-HSC）3（25）、八聚体（HGC-HSC）4（26）和十聚体（HGC-HSC）5（27）的组装（图5和方案S4）。还检测到了相应的环状螯合剂（HGC-HSC）-MC（28）以及四聚体（HGC-HSC）2-MC（29）、六聚体（HGC-HSC）3-MC（30）和八聚体（HGC-HSC）4-MC（31）（图5和方案S4）。线性十聚体20的相应环状螯合剂（HGC-HSC）5-MC（32）未被检测到。主要产物是四聚体环状螯合剂29（64%），其含量显著高于28（27%）和所有其他产物（1.9%）的总和（表S2）。由于5的C端存在琥珀酸，也检测到了des-succinyl线性螯合剂（图S6）。底物消耗量的测定显示，≥90%的5被消耗，与使用天然二聚体底物3的反应相似，并显著高于4（图3）。

**2.4 StDesD与天然-非天然异源二聚体底物（5和6）**

在标准化学酶法条件下，研究了StDesD处理C端修饰的单体底物2及其相应的单体二聚体底物4的能力。先前的研究表明ScDesD处理2的能力较弱[32]，不同DesD同源物产生的产物谱型存在差异，因此需要使用StDesD进行进一步研究[36, 39]。通过LC-HRMS/MS分析StDesD、2和辅因子的反应溶液，确认了StDesD介导的线性二聚体（HGC）2（15）和三聚体（HGC）3（16）的组装（图4a和S2）。相应的二聚体（HGC）2-MC（17）和三聚体（HGC）3-MC（18）环状螯合剂也被检测到（图4a和S2）。StDesD产生的产物谱型与ScDesD报告的产物谱型基本一致，除了18，在StDesD系统中被检测到但在ScDesD系统中未被检测到。底物消耗量的测定显示，2的26%被StDesD消耗，远低于天然底物1的消耗量（图3）。

**2.5 StDesD与天然-非天然异源二聚体底物（5和6）**

在确定了StDesD对非天然单体底物2和二聚体底物4的腺苷化能力较弱的基础上，研究了提高非天然底物腺苷化的方法。合成了HGC-HSC异源二聚体（5），旨在掩盖2的C端修饰并促进在类似天然底物的区域进行腺苷化。分析含有StDesD和5的反应溶液，确认了线性四聚体（HGC-HSC）2（24）、六聚体（HGC-HSC）3（25）、八聚体（HGC-HSC）4（26）和十聚体（HGC-HSC）5（27）的组装（图5和方案S4）。还检测到了相应的环状螯合剂（HGC-HSC）-MC（28）以及四聚体（HGC-HSC）2-MC（29）、六聚体（HGC-HSC）3-MC（30）和八聚体（HGC-HSC）4-MC（31）（图5和方案S4）。线性十聚体20的相应环状螯合剂（HGC-HSC）5-MC（32）未被检测到。底物4的消耗量为55%，低于天然底物1和3的消耗量（图3），这与之前的研究结果一致，即2的C端谷氨酸区域减弱了ScDesD的腺苷化作用[32]。

**2.6 StDesD与天然-非天然异源二聚体底物（5和6）**

在确定了StDesD对非天然单体底物2和二聚体底物4的腺苷化能力较弱之后，研究了提高非天然底物腺苷化的方法。合成了HGC-HSC异源二聚体（5），目的是掩盖2的C端修饰并促进在类似天然底物的区域进行腺苷化。分析含有StDesD和5的反应溶液，确认了线性四聚体（HGC-HSC）2（24）、六聚体（HGC-HSC）3（25）、八聚体（HGC-HSC）4（26）和十聚体（HGC-HSC）5（27）的组装（图5和方案S4）。还检测到了相应的环状螯合剂（HGC-HSC）-MC（28）以及四聚体（HGC-HSC）2-MC（29）、六聚体（HGC-HSC）3-MC（30）和八聚体（HGC-HSC）4-MC（31）（图5和方案S4）。线性十聚体27的相应环状螯合剂（HGC-HSC）5-MC（32）未被检测到。主要产物是四聚体环状螯合剂29（64%），其含量显著高于28（27%）和所有其他产物的总和（1.9%）（表S2）。由于5的C端存在琥珀酸，也检测到了des-succinyl线性螯合剂（图S6）。底物消耗量的测定显示，≥90%的5被消耗，与使用天然二聚体底物3的反应相似，并显著高于4（图3）。观察到由5衍生的多种线性和大环多聚体，以及5、1和3相似的底物消耗量，表明StDesD能够轻易地腺苷酸化5。与2和4相比，5的底物腺苷酸化效率更高，这证明了通过与天然的底物1二聚化来增强非天然底物A位点亲和力的设计意图是有效的。来自Streptomyces griseoflavus的重组DesD [30]（SgDesD）与失活的腺苷酸化1类似物结合的X射线晶体结构阐明了底物结合模式（图6a），它是疏水性、氢键作用和静电相互作用与精氨酸（R303）及天冬氨酸（D497）残基的结合（PDB: 7TGM）[30]。基于这些结果以及当前研究的结果，可以推测5的C末端单元与StDesD的A位点的结合方式与1相似（图6d），从而实现腺苷酸化。

图中展示了单体底物1（a）和2（b）；以及二聚体底物3（b）、5（c）、6（d）和4（e）在StDesD活性位点上的单体和二聚体结合模式。显示的氨基酸残基对应于在SgDesD中鉴定出的1的结合位点[30]。绿色箭头表示静电和/或氢键作用；粉色箭头表示较弱的静电和/或氢键作用；红色箭头表示有害的相互作用。合成了另一种异二聚体HSC-HGC（6）并作为StDesD的底物进行了评估，以检验异二聚体系统的N端到C端位置的依赖性。通过LC-HRMS/MS对反应液的分析显示线性四聚体（HSC-HGC）2（33）、六聚体（HSC-HGC）3（34）和八聚体（HSC-HGC）4（35）的生成（图S4和方案S5）。线性十聚体（HSC-HGC）5（36）是通过在m/z 2090.2622处检测到的特征性MS2片段化模式识别的（图S18）。虽然由5或6生成的同序线性多聚体对都是不同的构象异构体（例如（HGC-HSC）2（24）和（HSC-HGC）2（33）），但它们形成了独特的端到端大环产物（例如（HGC-HSC）-MC（28）≡（HSC-HGC）-MC（28））。除了线性多聚体外，还识别出了大环二聚体（HSC-HGC）-MC（28）、四聚体（HSC-HGC）2-MC（29）和六聚体（HSC-HGC）3-MC（30）（图S4和方案S5）。由35或36生成的相应大环化合物31和32未被检测到。底物消耗水平以及6的产品谱图趋势与5相似（图3，以及表S2和S3），除了（HSC-HGC）4-MC（31）未被检测到。这些结果表明6对A位点的亲和力与5相似，这出乎意料，因为使用单体2进行的实验显示由于C端谷氨酸单元的存在导致腺苷酸化显著减弱。这促使人们考虑StDesD结合口袋的细微差异，这些差异可能是专门针对处理二聚体底物的。

2.4 StDesD中用于二聚体底物的扩展结合位点
可能StDesD在底物结合口袋内有一个区域，这里称为二聚体底物结合位点，它与3和6中存在的1单元的N端区域相互作用，稳定了底物的整体定位，包括远端A位点的区域，从而增强了腺苷酸化（图6c,e）。维持6比2（图6b）更高反应性的相互作用可能包括6的末端胺基与酸性氨基酸残基AA?之间的静电相互作用和/或其他疏水性或氢键作用。鉴于StDesD对5和6的处理程度相似，N端（5）或C端（6）的分子突出部分可能引起的任何结合惩罚可能被底物内部酰胺基团与D497之间的稳定效应和/或涉及亚甲基基团的疏水性相互作用所抵消。相比之下，4的处理可能因两个非天然二酸单元的结合惩罚而受到损害，导致N端和C端发生长度变形（图6f），同时由于位置偏移，底物内部酰胺基团与D497的稳定效应也减弱。这种对单体和二聚体底物与StDesD结合的分析与早期关于单体底物的研究结果一致，这些研究显示了极性结合基团的间距模式对底物能力的影响[32]。我们正在继续进行StDesD的X射线晶体结构分析，并结合计算机模拟，以便进一步评估二聚体底物结合位点。

2.5 二聚体底物偏置了StDesD介导的八齿螯合物的产生
使用二聚体底物阻止了StDesD形成奇数个多聚体的能力，例如其主要的生物合成产物（HSC）3-MC（DFOE），该产物是由（HSC）3（DFOG1）形成的（方案1）。这倾向于底物池延长形成偶数个多聚体（图7），注意到由于空间位阻，二聚体大环9或其类似物的产量较低[32, 38]。这指导了StDesD介导从3生成四齿大环10，以及从5或6生成29（在独特的大环29中方向性丧失）作为主要产物。大环10和29具有适合与较大离子半径的金属离子（如Zr(IV)）结合的腔体尺寸和齿数[40, 41]。使用总合成或金属模板合成法报告的10的产率在7%–11%之间[40, 42]。从StDesD系统生成的10及其类似物的产率为50%–85%（表S1–S3），突显了使用平行化学酶实验方法来合成这些螯合物的潜力。

2.6 高腔体积-高齿数螯合物的形成
StDesD从3、5和6生成了六齿十二齿多聚体，以及从5和6生成的八齿十六齿和十齿二十齿多聚体，尽管产量较低（图7）。线性和大环多聚体的相对丰度表明，随着多聚体的延长，它们作为大环化的底物能力降低（图S7b）。六齿、八齿和十齿多聚体的大环化速率降低可能是由于高阶多聚体的体积超过了StDesD活性位点的空间，导致部分多聚体底物位于活性位点之外，从而无法将C端和N端分别定位在A位点和C位点。预计多聚体长度的增加会增加自由度，并且结合底物浓度效应，减少相应端到端大环的丰度。使用单体1和二聚体3–6底物制造的upper limit oligomeric和macrocyclic产物的腔体体积和齿数之间存在显著差异。在1的情况下，观察到的最高阶多聚体是五齿十二齿螯合物[31]。在3–6的情况下，虽然观察到的最高阶多聚体也是五聚体，但由于是由二聚体起始底物组装而成，最终产物是十二齿螯合物。这表明螯合物产物（体积、齿数）的不同可能由进料底物的多重性决定。

2.7 筛选螯合物产物的配位化学
使用Ga(III)和Zr(IV)作为医学相关放射性同位素68Ga(III)和89Zr(IV)的替代物，研究了螯合物库的配位化学。使用5生成的生物组合螯合物混合物（产物：24–32）与Ga(III)(NO3)3以3:1的比例或Zr(IV)Cl4以5:1的比例孵育2小时。金属:螯合物的化学计量比设计用于生成饱和配位复合物，以便通过LC-HRMS进行分析[31]。对由StDesD生成的Ga(III)(NO3)3和螯合物混合物的分析显示形成了单金属、双金属和三金属Ga(III)复合物（图8）。通过质谱图中65.9031 m/z的位移、与匹配的自由螯合物相比色谱图的信号位移以及特征性的Ga(III)同位素模式，识别出了1:1金属:配体复合物4-Ga、24-Ga、25-Ga、26-Ga、27-Ga、29-Ga和30-Ga的信号（图9）。具有较大腔体尺寸和齿数的螯合物能够形成多金属复合物。识别出了2:1金属:配体复合物24-Ga2、25-Ga2、26-Ga2、29-Ga2和30-Ga2的信号，其中十二齿螯合物27形成了3:1金属:配体复合物27-Ga3（图9）。

3 结论
本研究评估了来自S. tropica CNB-440的重组NIS合成酶（StDesD）对二聚体底物的活性。StDesD在处理天然二聚体底物3时的能力与处理天然单体底物1时相似。通过形成1和2的异二聚体底物，2的底物能力得到了恢复，其中2位于N端或C端分别生成5或6。产品谱图表明StDesD结合位点的存在，该位点能够结合二聚体底物的N端1单元，从而提高5或6的C端区域的腺苷酸化亲和力。二聚体底物内部酰胺基团与相应酸性氨基酸残基之间的结合相互作用减弱，加上4的C端和N端区域的额外分子突出部分削弱了结合相互作用，可能是其在这三个二聚体底物中的排名较低的原因。在这种化学酶反应系统中使用二聚体底物阻止了StDesD形成奇数个多聚体的能力。这消除了形成三聚体大环羟酸（如DFOE）的能力，而是偏向于生成四聚体羟酸DFOT1（10）。在Ga(III)或Zr(IV)存在下评估了螯合物混合物的配位化学。八齿（24, 29）、十二齿（25, 30）、十六齿（26, 31）和二十齿（27）配体与Ga(III)形成了1:1或2:1金属:配体复合物，其中27形成了3:1金属:配体复合物。八齿（24, 29）和十二齿（25, 30）螯合物与Zr(IV)形成了1:1金属:配体复合物。使用二聚体底物3–6使得StDesD能够介导生成高腔体积-高齿数的螯合物。这项工作展示了StDesD作为生物催化剂在化学空间探索中的实用性，并提供了一个平台来鉴定具有有用功能的新型螯合物。感谢澳大利亚研究委员会（DP220100101）对研究的支持。这项研究得益于悉尼大学提供的核心研究设施，如悉尼质谱实验室和悉尼分析实验室。此外，还感谢悉尼大学授予CAR的澳大利亚政府研究培训计划奖学金。由悉尼大学促进的开放获取出版服务，该服务是沃利出版社（Wiley）与悉尼大学通过澳大利亚大学图书馆协会（Council of Australasian University Librarians）签署协议的一部分。

利益冲突
作者声明不存在任何利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究结果的数据可在该文章的“支持信息”（Supporting Information）部分获取。