利用 bulk 声波高效提升精子冷冻保存的质量

《Sensors and Actuators A: Physical》：Highly Efficient Quality Enhancement of Sperm Cryopreservation Using Bulk Acoustic Waves

　　梅赫兰·阿扎德巴赫特 | 贝赫达德·巴拉希米 | 萨拉·达尔巴拉里 | 伊曼·哈尔瓦伊 | 穆罕默德·扎贝蒂安
伊朗德黑兰塔比阿特莫达雷斯大学电气与计算机工程学院

**摘要**
对于那些可能因治疗（如癌症治疗）而导致不育的男性来说，冷冻保存至关重要，因为它为未来的生育能力和心理支持提供了希望。尽管在辅助生殖技术（ART）中取得了成功，但由于细胞内冰晶的形成、生长和再结晶，冷冻保存仍可能导致细胞损伤，包括DNA完整性受损、渗透冲击和机械性伤害。本文提出了一种新的声学辅助方法，利用体声波（BAWs）来辅助世界卫生组织（WHO）推荐的冷冻保存程序步骤，包括与冷冻保护剂（CPA）的平衡、精子冻存和解冻过程。将每个精液样本分成四个相等的部分，在固定的750 kHz共振频率下，研究不同驱动电压幅度（Vp-p=11 V、22 V、43 V）对BAW辅助冷冻保存过程中精液样本特性的影响，并与采用传统冷冻保存方法的对照样本进行比较。结果表明，与对照样本相比，BAW辅助冷冻保存的精液样本在 progressive motility（前进运动能力）方面提高了约16.5%，总运动能力提高了18%，活力提高了17.5%，DNA完整性提高了12.4%。鉴于这些显著的质量提升，所提出的BAW辅助精子冷冻保存方法被认为是一种简单、生物相容且经济可行的改进方法，所需设备体积小，符合世界卫生组织的标准，为实现高效ART铺平了道路。

**引言**
冷冻生物学是一门研究如何在极低温度下长时间保存细胞或组织的科学学科。人类精子的冷冻保存已成为辅助生殖技术（ART）中的标准实践，在全球的体外受精（IVF）诊所中广泛使用。精子冷冻保存主要用于无精子症病例、癌症治疗前的睾丸精子提取、输精管切除术、性别重置手术，以及诊断出性腺功能减退症、脊髓损伤、糖尿病和各种自身免疫性疾病的患者。然而，冷冻保存可能会对精子运动能力、膜完整性、DNA完整性和活力产生不利影响。现有的冷冻保存方法虽然相对成功，但仍有许多细胞在过程中死亡，其功能也会显著下降。虽然卵子和胚胎的冷冻保存技术已接近最佳方案，但精子的冷冻保存距离最佳方法还有很大差距。冷冻后的精液质量指标不可避免地低于新鲜精液，因此精子冷冻保存技术仍然需要进一步的研究和发展。

**冷冻保存过程中的问题**
冷冻保存过程中精子质量下降的原因包括冷休克、细胞内外冰晶的形成、渗透冲击以及活性氧（ROS）的生成。精子对冷冻保存非常敏感，其细胞膜中含有大量的多不饱和脂肪酸，细胞质体积小，线粒体数量多，并具有抗氧化潜力。冷冻后精子失去受精能力的原因包括细胞内冰晶的形成、氧化应激和细胞凋亡途径。冷冻-解冻过程会降低25%-75%的精子运动能力，这可能与线粒体损伤有关。冷冻还会导致精子形态恶化、顶体完整性丧失以及膜和顶体基质的损伤，从而影响精子的受精能力。许多研究认为活性氧是损害精子DNA的关键因素。此外，冷冻过程中膜损伤也会引发细胞凋亡和死亡。为了减少冷冻保存带来的损害，精子具有细胞内的抗氧化防御机制，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物还原酶等，以中和氧化应激。

**冷冻保存方法**
冷冻保存主要有三种成熟的方法：可编程缓慢冷冻法、快速冷冻法和玻璃化法。需要注意的是，与冷冻保护剂（CPA）的平衡、冷冻、保存、解冻和去除CPA是确保精子用于后续临床使用的关键步骤。因此，迫切需要开发能够减少渗透冲击的改进方法，从而降低细胞损伤。由于与CPA的平衡过程至关重要，人们投入了大量精力研究先进的冷冻保存技术，例如利用微流控技术实现逐步平衡[20-23]。冷冻保护剂可分为两类：可穿透细胞膜的（如DMSO、甘油、乙二醇和1,2-丙二醇）和不可穿透细胞膜的（如葡萄糖、蔗糖和海藻糖）。

**提高精子存活率的研究**
全球的冷冻生物学家正在探索多种新方法来提高冻融精子的存活率和受精能力。除了在人类辅助生殖技术中的应用外，精子冷冻保存还在牲畜繁殖计划、濒危陆地物种保护、水产养殖种苗管理和鱼类遗传资源银行等领域发挥着重要作用，这些领域也面临着类似的挑战，如渗透冲击、冰晶损伤和DNA片段化[24-27]。为此，除了研究理想的冷冻保护剂配方及冷冻和解冻程序外，还可以对外部刺激场进行应用。通过使用外部物理场技术，在控制冰晶形成和抑制冰晶生长方面取得了显著进展[28]。目前，外部场对冷冻保存中的冰晶有两种主要影响：（i）外部场可以提供适当的升温速率，防止再结晶或玻璃化；（ii）外部场可以影响水分子的运动，从而改变冷冻过程中的冰晶形成和发展。总之，通过外部场（如磁场[30]、激光场[31]和声场[28]）调节冰晶的形成和生长，在细胞、组织甚至器官的冷冻保存中引起了广泛关注。

**声学辅助冷冻保存方法**
本文提出了一种利用声学场辅助的精子冷冻保存方法，以提高精子的存活率和质量，同时遵循世界卫生组织（WHO）推荐的精液冷冻保存标准[13]。在与CPA平衡、精液快速冷冻和解冻过程中使用体声波（BAW）后，精子的运动能力、活力和DNA完整性得到了提升。这种声学辅助方法完全兼容传统的临床冷冻保存程序，操作简单且成本低廉，能够处理相同体积和流量的精液，并显著提高解冻后精子的质量。因此，这种BAW辅助冷冻保存方法有望提高生育几率。

**操作原理**
先前已有研究表明，超声波频率的表面声波（SAWs）在与CPA平衡过程中可快速有效地保存细胞，对细胞的伤害最小，细胞回收率平均提高了24%[44]。冷冻保存效果的提升归因于声波在液体中引起的流动，从而增强了与CPA的平衡效果。

**研究方法**
为阐明BAW刺激对精子冷冻保存结果的影响，本研究采用了多学科方法，结合了设备微制造、声流控原理和生物检测协议。实验设计旨在量化不同驱动条件对解冻后精子质量的影响，特别关注样本准备、操作参数和伦理标准。

**结果与讨论**
本节总结了实验结果，阐明了BAW驱动对精子冷冻保存效率的影响。首先确定了确保设备可靠运行的最佳工作电压，然后评估了BAW对关键指标（如运动能力、活力和染色质完整性）的影响。观察结果基于微观操作原理进行解释，强调了各因素之间的功能相互作用。

**结论**
本文的研究结果表明，BAW辅助精子冷冻保存在提高解冻后精子质量方面具有巨大潜力。对于因医疗干预而不育的男性来说，冷冻保存仍然是一个重要的选择；然而，传统方法常因冰晶形成和机械损伤而损害精子功能。本研究探讨了改变驱动条件对精子冷冻保存效果的影响。

**作者贡献声明**
穆罕默德·扎贝蒂安：撰写、审阅与编辑、可视化、方法学；
伊曼·哈尔瓦伊：撰写、审阅与编辑、可视化、验证、监督、项目管理、方法学、概念设计；
萨拉·达尔巴拉里：撰写、审阅与编辑、可视化、验证、监督、资源管理、项目管理、方法学、资金获取、概念设计；
贝赫达德·巴拉希米：撰写初稿、可视化、方法学、数据分析、正式分析。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

**致谢**
作者衷心感谢塔比阿特莫达雷斯大学（IG-39703）和伊朗国家科学基金会（INSF）的部分资金支持，同时也感谢甘地IVF诊所提供的精液样本支持。

**作者简介**
梅赫兰·阿扎德巴赫特于2023年在伊朗德黑兰的塔比阿特莫达雷斯大学获得电气工程硕士学位，专注于超声波辅助人类精子冷冻保存技术的改进。他目前正寻求加入先进的冷冻保存技术和辅助生殖技术研究团队。