一种具有中性pH偏好性的胆绿素-Cu2+纳米酶用于甲醛特异性荧光检测及智能手机辅助胆固醇传感

《Sensors and Actuators B: Chemical》：A Biliverdin-Cu2+ nanozyme with neutral pH preference for specific fluorescent detection of formaldehyde and smartphone-assisted cholesterol sensing

　　

尽管天然酶具有高催化效率，但由于其结构脆弱、对环境条件敏感以及成本高昂，在实际应用中面临重大挑战。纳米酶已成为有前途的替代品，然而大多数纳米酶仅在酸性条件下表现出最佳活性，限制了其在生理或中性环境中的应用。在此，研究人员报道了一种通过简单配位反应合成并经密度泛函理论（DFT）计算指导合理设计的Cu2+-胆绿素（CuBV）纳米酶。DFT计算确定了胆绿素（BV）的吡咯氮和酰胺氧原子是Cu2+的首选配位位点，建立了富电子的Cu-N配位微环境。CuBV纳米酶在生理中性pH下表现出卓越的过氧化物酶样（POD-like）和漆酶样活性，这一突破克服了传统纳米酶长期存在的pH限制。机理研究表明，Cu2+/Cu+氧化还原循环的高转换速率、配体增强的电子转移和底物吸附是pH非依赖型催化的关键。基于CuBV优异的中性pH活性，研究人员构建了一个新型荧光检测平台，该平台通过邻苯二胺（OPD）介导的催化氧化反应和-NH2、-CHO基团缩合反应检测甲醛，实现了0-100 μM的线性范围和0.68 μM的检测限（LOD）。此外，利用胆固醇氧化酶/CuBV级联系统构建了比色法胆固醇传感器，其线性范围为0-300 μM，LOD为0.83 μM；该系统进一步与智能手机集成，用于现场视觉传感。这项工作不仅提供了一种中性pH通用的纳米酶，还为设计适用于生物医学和环境应用的仿生催化剂提供了通用策略。

该研究论文发表于《Sensors and Actuators B: Chemical》。论文针对天然酶稳定性差、成本高以及现有纳米酶多在酸性环境下发挥活性的局限性，开发了一种具有中性pH偏好性的胆绿素-Cu²⁺（CuBV）纳米酶，并成功将其应用于甲醛和胆固醇的高性能传感检测。

研究背景指出，天然酶虽具高效催化性，但其蛋白质本质导致在工业应用中受限于高昂成本和非生理条件下的不稳定性。尽管封装技术可改善稳定性，但蛋白质核心的固有脆弱性仍是瓶颈。纳米酶作为替代物虽发展迅速，但绝大多数受pH制约，仅在酸性环境（pH 3-5）表现最佳，这严重限制了其在需要中性条件的生物医学和环境监测中的应用。虽然已有异原子掺杂、纳米限域等方法尝试解决此问题，但通常涉及多步合成或高温处理。因此，开发在生理中性pH下具有高活性的简便合成纳米酶具有重要意义。

研究人员通过密度泛函理论（DFT）计算预测胆绿素（BV）分子中吡咯氮和酰胺氧为Cu²⁺的最佳配位位点，随后通过室温下水相简单的配位反应制备了CuBV纳米酶。表征结果显示，该纳米酶形成了类似天然漆酶的Cu-N配位微环境。不同于传统纳米酶，CuBV在生理中性pH下表现出增强的过氧化物酶样（POD-like）和漆酶样活性，其机理归因于Cu²⁺/Cu⁺氧化还原循环的高切换速率及配体促进的电子转移。基于此特性，研究人员构建了两种传感体系：一是利用邻苯二胺（OPD）氧化产物与甲醛发生缩合反应导致荧光猝灭的原理，建立了甲醛荧光检测方法；二是利用胆固醇氧化酶（ChOx）催化产生的过氧化氢触发CuBV的级联显色反应，建立了智能手机辅助的比色胆固醇检测平台。

关键技术方法包括：采用密度泛函理论（DFT）计算指导材料理性设计；通过一步水相配位反应合成CuBV纳米酶并进行透射电镜（TEM）、X射线光电子能谱（XPS）等物理化学表征；利用稳态动力学分析评估其米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_max）；基于邻苯二胺（OPD）氧化及缩合反应的荧光猝灭机制构建甲醛传感器；以及基于胆固醇氧化酶与CuBV的级联催化反应结合智能手机成像技术构建胆固醇传感器。

研究结果部分显示：

在“DFT-guided rational design, synthesis and characterization of CuBV nanozyme”部分，研究人员通过计算福井函数确定了BV的亲核位点，实验合成了粒径约80 nm的CuBV纳米颗粒，XPS证实了Cu-N键的形成。

在“Peroxidase-like activity of CuBV”部分，通过动力学分析发现CuBV对H₂O₂的亲和力远高于辣根过氧化物酶（HRP），且在pH 7.0时活性最高，表现出独特的pH非依赖性。

在“Laccase-like activity of CuBV”部分，CuBV能有效催化氧化酚类底物，其表观活性在中性pH下优于酸性条件。

在“Mechanism of pH?independent catalysis”部分，电化学测试表明CuBV具有优异的电子转移能力，Cu²⁺/Cu⁺的快速循环是其维持中性pH高活性的关键。

在“Fluorescent detection of formaldehyde”部分，基于OPD氧化产物与甲醛的特异性缩合反应，该传感器在0-100 μM范围内呈线性相关，检出限低至0.68 μM，且抗干扰性强。

在“Colorimetric sensing of cholesterol”部分，构建的ChOx/CuBV级联系统在0-300 μM范围内响应良好，LOD为0.83 μM，结合智能手机APP实现了实际血清样本的成功检测。

讨论与结论部分总结道，该研究成功开发了一种DFT指导的CuBV纳米酶，其模拟了天然酶的Cu-N配位环境，并在中性pH下表现出优异的过氧化物酶和漆酶样活性，克服了传统纳米酶的酸依赖性限制。通过利用其独特的中性pH活性，研究人员构建了一种基于OPD的-NH₂与甲醛-CHO缩合反应的特异性荧光甲醛传感器。此外，基于胆固醇氧化酶催化生成的H₂O₂与CuBV的级联反应，开发了无标记、可视化的胆固醇生物传感器，并实现了智能手机集成。这项工作不仅提供了一种中性pH通用的纳米酶，也为设计适用于实际应用场景的仿生催化剂提供了新见解。