《Sensors and Actuators B: Chemical》：Integrated Electrochemical Lateral Flow Immunoassay: Scalable Fabrication and Wireless Detection of Cardiac Troponin I
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杨丽|周富玉|杜素贞|徐颖颖|吴青金|李泉东|林永平|赵娜|刘江|李 Yingchun石河子大学药学院，教育部新疆植物药资源与利用重点实验室，中国石河子 832000摘要近年来，电化学侧向流动免疫分析（eLFIA）因结合了用户友好的侧向流动免疫分析（LFIA）和电化学检测技术而受
杨丽|周富玉|杜素贞|徐颖颖|吴青金|李泉东|林永平|赵娜|刘江|李 Yingchun
石河子大学药学院，教育部新疆植物药资源与利用重点实验室，中国石河子 832000
摘要
近年来，电化学侧向流动免疫分析（eLFIA）因结合了用户友好的侧向流动免疫分析（LFIA）和电化学检测技术而受到越来越多关注，这种技术具有易于集成、高灵敏度和快速响应的特点，适用于即时检测（POCT）。然而，eLFIA 的一个关键问题是如何实现试纸条与电极之间的良好连接。目前的制备过程通常需要分别制作各个部件，然后手动组装。这种操作不仅导致重现性差和检测效果不理想，而且在大规模生产中也面临困难。在这里，我们开发了一种新型的 eLFIA 平台，其中的传感电极是通过丝网印刷技术直接在硝化纤维素膜上制备的。此外，我们建立了一种一步检测方法，整个检测过程可以在 10 分钟内完成。以心肌肌钙蛋白 I（cTnI）为模型分析物，系统地研究了其检测性能。该传感器在 0~100 ng/mL 的浓度范围内表现出良好的线性，检测限为 0.29 ng/mL（信噪比 = 3）。另外，通过将 eLFIA 与便携式电位计和智能手机集成，开发出了一种便携式无线信号采集 POCT 设备。这种 eLFIA 设备有助于开发更高效和适用的诊断工具，特别是在临床和家庭环境中。
引言
近年来，由于即时检测（POCT）具有快速和便携的特点，在疾病诊断、食品安全和环境监测等领域得到了广泛应用 [1] [2]。POCT 通过微型化、集成化和智能化设计实现了“样本进-结果出”的过程 [3]。侧向流动免疫分析（LFIA）是 POCT 的一个典型例子，已被广泛用于各种医学生物标志物的快速检测，如蛋白质（例如心肌标志物 [4]、炎症生物标志物 [5]）、核酸（例如非小细胞肺癌的 miRNA [6]、COVID-19 的 ORF1ab 核酸 [7]）以及小分子化学物质（例如黄曲霉毒素 B1 [8]、 carbendazim [9]）。
传统的 LFIA 基于光学检测技术，如比色法、荧光法等 [10] [11]。虽然基于比色法的 LFIA 是一种低成本的工具，但其灵敏度有限且缺乏定量能力 [12]。而电化学传感技术则兼具微型化、集成化和成本效益的优点，在需要长期稳定性、简化操作和在复杂生物基质中实现可靠定量的应用场景中成为光学检测方法的实际替代方案 [13] [14]。目前，新兴的电化学侧向流动免疫分析（eLFIA）引起了研究人员和临床实践者的广泛关注。通过结合传统 LFIA 和电化学传感的优点，eLFIA 在 POCT 中具有独特的优势。具体来说，eLFIA 保留了 LFIA 的优点，如样品分离和良好的特异性；同时，与光学检测方法相比，电化学传感可以基于微型化、集成化的低成本设备进行，从而实现临床环境中生物标志物的快速检测，支持即时诊断，并满足家庭健康监测的需求。
目前，eLFIA 在多个领域显示出显著的应用潜力，检测目标包括癌症标志物、炎症生物标志物、心肌标志物、病原菌和糖尿病相关分析物 [15] [16] [17] [18] [19]。几乎所有报道的 eLFIA 架构都由两个独立部分组成：微型化电化学传感器和 LFIA 试纸条，它们需要手动组装才能进行定量分析。然而，这带来了一些问题：（1）在检测方面：传感电极与硝化纤维素（NC）膜之间的接触可能不牢固，导致信号波动、检测不准确和重复性差；（2）在制备方面：eLFIA 的制备过程复杂，需要分别制备电极和试纸条，然后进行组装，这增加了大规模生产的难度，限制了该技术的广泛应用。Ying 等人 [16] 提出了一种内置电极的 eLFIA，通过直接在 NC 膜上打印电极来实现。然而，这种设计仍然需要组装操作，过程与经典 eLFIA 相似且复杂。此外，eLFIA 使用辣根过氧化物酶进行定量，涉及多次试剂添加步骤，因此不太适合用户友好型应用。
为了解决 eLFIA 制造和使用中的上述问题，本研究提出了一种新型的集成化制备策略，并全面评估了试纸条的分析性能。本研究使用心肌肌钙蛋白 I（cTnI）作为模型分析物，该蛋白被广泛认为是急性心肌梗死的重要标志物之一 [20]。具体而言，电化学传感电极是通过丝网印刷技术直接在 NC 膜上制备的。这种方法解决了电极与试纸条接触不稳定的问题，同时简化了制备过程并实现了大规模生产。建立了一种一步检测 cTnI 的方法，使用硫堇标记的抗体作为探针。最后，开发了一种 POCT 系统，将 eLFIA 试纸条与便携式电位计和智能手机结合使用（图 1），并对实际样品进行了分析。
部分摘要
材料、试剂和仪器
材料、试剂和仪器的详细信息见支持信息。
AuNPs 和 Ab?-AuNPs@Th 的制备
1 mL 的 HAuCl?（1 wt%）转移到 100 mL 的去离子蒸馏水中并加热至沸腾。然后，在剧烈搅拌下加入 3 mL 的三钠柠檬酸二水合物（1 wt%），溶液颜色从无色变为红色，表明形成了 AuNPs。冷却后，将溶液储存在 4℃ 下以备后续使用。
报告探针是通过戊二醛共价键合方法制备的 [21]。
免疫传感器的设计
使用 cTnI 作为模型分析物来评估基于夹心免疫测定的 eLFIA 的可行性。如图 1B 所示，样品垫接收样品溶液并促进液体流动。预装有 Ab?-AuNPs@Th 的结合垫促进了 cTnI 与 Ab?-AuNPs@Th 之间的特异性反应，形成了 ‘cTnI/Ab?-AuNPs@Th’ 复合物。该复合物继续流向检测线（WE），在那里与预修饰的 Ab? 结合，形成夹心结构。
结论
在这项工作中，开发了一种带有集成电极的新型 eLFIA 试纸条，并将其与便携式电位计结合，制备出一种用于检测人血清中 cTnI 的无线传感设备。该传感器提出了一种通过丝网印刷技术直接在 NC 膜上打印电极材料来制备 eLFIA 试纸条的方法。整个检测过程可以在 10 分钟内完成。此外，该生物传感器具有更高的灵敏度和重复性。
CRediT 作者贡献声明
刘江：监督、资源、方法论、资金获取。赵娜：资源。林永平：资源。周富玉：监督、数据管理。杨丽：写作 - 审稿与编辑、原始稿撰写、软件使用、调查、数据分析、数据管理。李 Yingchun：写作 - 审稿与编辑、监督、资源、资金获取。李泉东：概念构思。吴青金：资源。徐颖颖：调查。杜素贞：方法论、数据管理。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。
致谢
本工作得到了国家自然科学基金（82560706）、新疆天池学术精英领军项目（CZ000946）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515220133, 2024A1515220030）以及深圳程序医学项目（编号 SZSM202311002）的支持。
