通过便携式自动化设备中的多重定量PCR技术对15种人乳头瘤病毒（HPV）基因型进行检测

《Sensors and Actuators B: Chemical》：Discrimination for fifteen genotypes of human papillomavirus (HPV) via multiplexed qPCR in a portable and automated device

　　

赵 Jingyang | 肖 Yingjun | 李 Jiajun | 梁超 | 江汉青

浙江杭州西湖大学工程学院，邮编310030，中国

摘要

人乳头瘤病毒（HPV）基因型的检测对于宫颈癌的预防至关重要，并已受到广泛关注。然而，所有高风险HPV（hr-HPV）的全面鉴别目前仍局限于集中式设施，这些设施的检测耗时且成本高昂，仅由经过培训的专业人员进行。尽管已经开发了许多即时检测（POCT）平台，但它们目前只能检测有限数量的高风险HPV基因型（主要是HPV16和HPV18），并且检测准确性较差。在这里，我们报告了一个便携式自动化的POCT平台，该平台能够同时识别十五种HPV基因型，包括所有十四种高风险HPV基因型和一种可能的高风险HPV（phr-HPV）。该平台采用了刚性-柔性气动切换（RFPS）技术，能够在掌心大小的盒体内自动执行全方位分配、按需释放、涡流混合以及多种试剂的长期储存。这款紧凑型台式设备的大小约等于一个鞋盒，并配备了一个可移动的荧光检测模块，可用于4×4定量实时聚合酶链反应（qPCR）。使用该平台，我们实现了所有十五种HPV亚型的检测限（LOD）为3~50拷贝/μL。通过53个临床样本的验证，该平台在一小时内成功提供了“样品投入-结果输出”的性能，与金标准分析仪的一致性良好（皮尔逊系数=0.94），敏感度为96.4%，特异性为96.4%。该平台不仅推进了HPV检测技术的发展，还扩展了具有商业化潜力的POCT技术范围。

引言

宫颈癌是女性中第四大常见癌症，每年约有60万新病例和超过30万死亡病例，占全球女性癌症病例的7% [1]。几乎所有宫颈癌病例（超过95%）都可以归因于人乳头瘤病毒（HPV）的感染 [2]，[3]。HPV属于一个包含超过200种基因型的大型乳头瘤病毒家族，其中包括14种高风险HPV（hr-HPV），这些病毒可导致宫颈病变 [4]，以及仅与生殖器疣相关的低风险HPV（lr-HPV）[5]。最近的研究表明，某些HPV（尤其是HPV 73）的单一感染且病毒载量高也可能导致宫颈癌 [6]，[7]，[8]。这类病毒被归类为可能的高风险HPV（phr-HPV）。虽然HPV 16和18这两种高风险亚型占美国所有宫颈癌病例的70%以上 [9]，但仅检测HPV 16和18对于宫颈癌的筛查是不够的，因为其他高风险HPV和可能的高风险HPV感染在不同国家会导致不同的宫颈癌分布，并且在同一地区的不同时间也可能有所不同 [10]。因此，全面筛查所有高风险HPV和一些可能的高风险HPV（如HPV 73）对于防止从可治疗的HPV感染发展为严重的宫颈癌至关重要。

已经开发了多种HPV检测方法，包括巴氏涂片（Pap）检查 [11]、侧向流动试验（LFA）[12]，[13]、等温扩增技术 [14]，[15]，[16]、反向点印迹 [17]，以及基于CRISPR-Cas的分析方法 [18]，[19]，[20]。然而，在精度和稳健性方面，这些方法仍无法完全取代定量实时聚合酶链反应（qPCR），后者是最常用的方法，被认为是临床上的“金标准” [21]，[22]。然而，qPCR存在挑战：它需要一个笨重的机械臂来在不同反应步骤之间运输试剂，多个荧光检测模块用于多路信号发射和读取，以及需要经过培训的专业人员进行试剂预加载、操作和维护复杂的仪器，这限制了其在非集中式设施中的应用。实际上，在低收入和中等收入国家（LMICs），56%的女性在其一生中从未接受过宫颈癌筛查 [23]。分散式的即时检测（POCT）对于有效的宫颈癌预防至关重要，尤其是在LMICs，因为它能够在患者所在地早期和立即治疗HPV感染。

根据世界卫生组织（WHO）的标准，理想的POCT应该具备以下特点：可负担、灵敏度高、特异性强、用户友好、速度快、稳健性高、无需额外设备，并能直接交付给最终用户 [24]。为了满足这些标准，多路POCT设备需要具备多种功能：全方位分配（无需人工干预即可管理多种试剂操作）、按需释放（以准确控制试剂流量）、长期储存（避免试剂预加载）以及简单的设计（以确保成本效益和稳健性）。然而，大多数当前的POCT方法无法同时满足所有这些要求 [25]，[26]，[27]。因此，它们通常只能检测有限的HPV亚型（主要是HPV 16和18），并且检测准确性较差。例如，毛细管驱动 [28] 和重力驱动 [30] 的POCT设备仅能进行单向试剂运输，限制了其应用范围。类似CD的微流控设备 [32]，[33]，[34]，[35] 由离心力驱动，但由于复杂的虹吸网络和高速电机产生的惯性力，可能会导致非预期的流动行为，从而降低其操作精度。手指驱动的POCT设备 [36]，[37]，[38] 的精度和重复性可能会因不同用户操作习惯的微小差异而受到影响。气动POCT设备 [39]，[40]，[41]，[42] 在处理多种试剂方面表现出快速、精确和灵活的能力；然而，必须应用多个独立的气动通道来调节每个气动阀门，增加了系统的复杂性并影响了其稳健性。更重要的是，上述提到的POCT技术都没有长期的试剂储存能力，因为试剂必须由最终用户在应用前手动添加到腔室中。

在这里，我们提出了一种便携式自动化的平台，通过多路qPCR技术可以区分十五种HPV变体（包括所有十四种高风险HPV和一种可能的高风险HPV）。该平台由一个掌心大小的盒体和一个台式设备组成。盒体采用了刚性-柔性气动切换（RFPS）技术，能够自调节施加的压力，无需额外的气动调节通道，自动执行全方位分配、按需释放、涡流混合以及多种试剂的长期储存（图1A）。台式设备将多个荧光检测模块简化为一个可移动模块，用于4×4 qPCR（图1B），显著降低了成本（见补充表1）和整体体积（类似于一个鞋盒）。利用该平台，可以实现所有十五种HPV亚型的检测限（LOD）为3~50拷贝/μL。通过53个临床样本的验证，该平台在一小时内实现了“样品投入-结果输出”的性能，与金标准分析仪的一致性良好（皮尔逊系数=0.94），同时具有96.4%的敏感性和96%的特异性。与现有的POCT技术相比（表1），我们的平台提供了最全面的HPV检测（图1C），临床应用精度也得到了验证（图1D和图1E）。尽管我们的平台仍需要一个便携式设备来实现多路读数，但与商业POCT平台（如GeneXpert Xpress）相比，在多路检测能力、成本效益和便携性方面具有优势，这在提高HPV检测的可及性和有效性方面显示出巨大潜力，特别是在LMICs中。

章节片段

材料和试剂

HPV的DNA提取试剂，包括珠子、洗涤液和洗脱缓冲液，购自无锡东林科技发展有限公司。用于区分14种高风险HPV和1种可能的高风险HPV的引物、探针、Taq聚合酶及扩增基底由Liferiver Bio-Tech Corp.提供。已知浓度的标准样品和Tris-EDTA缓冲液也由Liferiver Bio-Tech Corp.提供。用于密封废料室的石蜡油也是从该公司购买的。

十五种HPV变体的多路qPCR

正向和反向引物的设计以及探针的选择对于实现多路qPCR测定的高特异性和灵敏度至关重要。所设计的引物针对的是HPV基因组的保守区域，特别是L1开放阅读框，该区域在不同HPV类型中高度保守（图2A和2B）。引物的长度在25到30个核苷酸之间，优化后的熔解温度（T_m）在55°C到68°C之间，以确保高效退火。

结论

在这项研究中，我们开发了一种便携式自动化平台，能够区分十五种HPV基因型，涵盖所有十四种高风险类型和一种可能的高风险类型。该系统由一个掌心大小的盒体和一个紧凑的台式荧光检测设备组成。其核心是刚性-柔性气动切换（RFPS）技术，该技术能够自调节关键压力，无需额外的气动通道即可控制试剂流。这不仅简化了操作过程

CRediT作者贡献声明

梁超：负责写作——审稿与编辑、项目管理、方法论、资金争取、概念构思。赵 Jingyang：负责写作——初稿撰写、数据可视化、正式分析、数据整理。肖 Yingjun：负责写作——初稿撰写、调查、正式分析。江汉青：负责写作——审稿与编辑、项目管理、资金争取。李 Jiajun：负责调查、正式分析。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

作者声明他们没有竞争性利益。

赵 Jingyang目前正在西湖大学和浙江大学的联合项目中攻读博士学位，专注于生物MEMS和微流控系统研究。他的研究兴趣包括生物传感技术及其在疾病生物标志物检测和器官芯片生物医学系统中的应用。