利用极性超敏感的非离子探针对活细胞质膜进行荧光追踪

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Fluorescence tracking live-cell plasma membranes via polarity ultra-sensitive non-ionic probes

　　

肖彤霞|李玉琴|梁浩佳|梁俊轩|徐雅辉|张鹏伟|王坤|刘芳

教育部岭南中医药资源重点实验室，广州中医药大学药学院，中国广州510006

摘要

小分子荧光探针为观察细胞质膜提供了简单便捷的工具，为细胞水平的研究提供了重要信息。现有的大多数质膜探针依赖于高电荷基团和长疏水性烷基链的引入，而对缺乏高疏水性烷基取代基的非离子探针的探索较少。在这项工作中，我们利用(2H)-苯并呋喃-3-酮（3-香豆酮）这一骨架——它结合了吸电子基团和活性亚甲基单元——通过直接的缩合和烷基化反应构建了8种D-π-A型荧光探针（CMO-1~CMO-8），这些探针具有典型的分子内电荷转移（ICT）特性。实验测量和理论计算一致表明，这些探针的荧光强度和峰位对环境极性的变化具有极高的敏感性。重要的是，代表性探针CMO-2能够在无需洗涤的情况下长期追踪质膜荧光，并且与商业探针DiD相比具有更强的膜锚定能力。与大多数报道的质膜探针不同，这类探针在生理pH值下是非离子的，为无需洗涤的活细胞质膜成像提供了有用的选择。

引言

细胞质膜是细胞表面的关键生物屏障，主要由磷脂双层和嵌入的蛋白质组成。它维持了细胞的结构完整性，并在细胞间相互作用、能量代谢、物质交换和信号转导等正常生理过程中发挥着重要作用[1],[2],[3],[4]。因此，观察质膜并精确追踪其动态有助于阐明膜组成和功能[5],[6],[7]。在各种可视化技术中，基于小分子探针的荧光成像因其操作简单、能够实时追踪快速动态过程以及对微环境变化敏感而被广泛用于观察和研究多种细胞结构，包括质膜[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14]。对于质膜荧光成像，探针通常需要表现出高膜选择性和强膜锚定能力，以减少非特异性染色从而提高成像特异性[15],[16]。迄今为止，几乎所有报道的质膜探针的设计都遵循一个既定原则：引入强电荷基团以增强与膜的静电相互作用，并加入长疏水性烷基链以加强膜锚定[17],[18],[19],[20],[21]。显然，由于分子结构的固有特性，这些类型的探针通常存在某些缺点。例如，带电基团往往会破坏质膜电位、改变膜张力和流动性，而长脂肪酸链通常会导致水溶性差和非特异性聚集，从而影响膜染色[22],[23]。此外，这类探针大多表现出持续的荧光，因此获得最佳膜成像通常依赖于洗涤步骤以去除未结合的探针[24]。

分子内电荷转移（ICT）是一种典型的光物理过程。由于其对外界环境极性和粘度变化的高度敏感性，它常被用作荧光探针设计中的分子响应机制[25],[26],[27],[28]。基于ICT和扭曲分子内电荷转移（TICT）的荧光探针作为微妙环境变化的敏感指标，在生物成像和分子传感中得到了广泛应用[29],[30],[31],[32]。质膜的微环境具有独特的亲水性和疏水性，并且粘度会动态变化。结合基于极性和粘度敏感性的ICT/TICT “开关”特性的荧光分子理论上可以在无需额外洗涤步骤的情况下成像质膜[20],[33],[34],[35]。这种策略能够在不引入强电荷官能团的情况下提供良好的膜选择性。然而，关于用于稳定质膜成像的非离子ICT/TICT荧光探针的报道仍然很少。

在这项工作中，我们基于(Z)-2-苯亚甲基-苯并呋喃-3(2H)-酮骨架（aurone）设计和合成了一系列非离子TICT型质膜荧光探针CMO-1~CMO-8。其中最有前景的探针(Z)-2-(4-(二甲基氨基)苯亚甲基)-6-丙氧基苯并呋喃-3(2H)-酮（CMO-2）仅含有一个短丙基基团，有利于膜锚定，能够对微环境极性降低和粘度增加产生“开关”荧光响应，实现了无需洗涤的长期质膜追踪。我们详细研究了其成像特性，并与商业探针进行了比较。同时评估和讨论了其膜传感机制。

节片段

合成与表征

探针CMOs的合成遵循图1c中所示的路线。结构通过¹H、¹³C NMR光谱和高分辨率质谱（HRMS，支持信息）进行了确认。CMO-2的晶体通过在室温下缓慢蒸发甲醇和二氯甲烷溶液获得。选择了一个合适的CMO-2晶体并在单晶X射线衍射仪（Bruker D8 Venture Photon III）上进行了分析。

CMOs的设计与合成

结论

总之，我们合成了一系列采用典型D-π-A结构的荧光探针（CMO-1~CMO-8），以3-香豆酮作为缩合骨架。这些探针表现出明显的ICT特性和TICT行为，对环境粘度和极性的变化非常敏感。代表性探针CMO-2和CMO-8显示出有效的质膜成像能力。特别是CMO-2在长期细胞膜追踪方面具有明显优势。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（82202639）和广东省基础与应用基础研究基金（2025A1515012841）的支持。同时，我们也感谢广州中医药大学岭南医学研究中心提供的设施支持，以及该校科技创新中心的尹丽娜博士在技术上的帮助。