转座子插入测序鉴定产气发酵C. ljungdahlii产物合成相关新基因

《Synthetic and Systems Biotechnology》：Transposon insertion sequencing identifies novel genes involved in product synthesis in gas-fermenting Clostridium ljungdahlii

　　

摘要：高效利用工业一碳（C1）气体，如二氧化碳（CO2）和一氧化碳（CO），近年来引起了广泛关注。产乙醇梭菌（Clostridium ljungdahlii）是一种关键的化能自养细菌，可将合成气（一种CO2、CO和H2的混合物）发酵为高附加值化学品，因此成为广泛研究的对象。然而，尽管针对C. ljungdahlii的遗传工具开发已取得进展，但快速鉴定关键细胞功能背后的基因仍然是瓶颈，阻碍了对该细菌的深入理解和成功的遗传工程改造。本研究利用mariner转座子系统构建了C. ljungdahlii的全基因组随机突变体库，从而能够鉴定出与合成气适应度相关的众多功能基因。研究人员通过使用IPTG诱导型条件复制子克服了该突变体库质粒消除效率相对较低的问题。随后对该突变体库进行高通量转座子插入测序（Transposon-Insertion Sequencing, Tn-seq），得以快速探索可能与合成气上生长相关的大量基因。对这些候选基因的实验验证揭示了若干影响C. ljungdahlii在气体发酵中乙醇和乙酸（两种主要代谢产物）产量的基因。本研究产生的数据为未来C. ljungdahlii的研究和优化提供了宝贵资源。此外，本研究提出的策略可用于鉴定该细菌中与其他重要表型相关的基因。

一、 研究背景、现存问题与研究目的

在全球应对气候变化和寻求可持续生物制造的背景下，利用工业废气（富含CO₂和CO等一碳气体）进行微生物发酵，生产乙醇等高附加值化学品，展现出巨大的潜力和应用前景。产气发酵梭菌，特别是产乙醇梭菌（^{Clostridium ljungdahlii}），是其中的关键微生物，其能够通过独特的Wood-Ljungdahl途径（WLP）固定CO₂/CO，并将其转化为乙酸、乙醇等产物。近年来，针对^{C. ljungdahlii}的遗传工具和代谢工程已取得一定进展，甚至实现了利用工业废气规模化生产乙醇。然而，该领域的发展仍受制于基础研究的不足。研究人员对^{C. ljungdahlii}中决定其关键表型（如在合成气上生长、碳固定、能量代谢和产物合成）的功能基因及其调控网络缺乏系统性认知。这种“基因功能-表型关联”图谱的缺失，限制了对该细菌代谢机制的深入理解，也阻碍了通过理性设计和高效改造来优化菌株性能。因此，迫切需要一种系统性的功能基因组学方法来大规模、快速地鉴定与^{C. ljungdahlii}合成气发酵相关的重要基因。

二、 主要研究技术方法概述

为解决上述问题，研究人员在本研究中整合应用了多种关键技术。其核心是构建了适用于^{C. ljungdahlii}的可诱导型mariner转座子系统，并成功构建了覆盖其基因组约75%特征区域的全基因组随机突变体库。该技术克服了初始质粒消除效率低的问题，是进行后续筛选的基础。在此基础上，研究人员采用了转座子插入测序（Tn-seq）这一高通量功能基因组学技术。他们利用构建的突变体库，在合成气和对照条件下进行多代连续传代培养，然后提取各代次样本的基因组DNA进行高通量测序。通过对测序数据的生物信息学分析，包括差异基因丰度分析、主成分分析（PCA）和KEGG通路富集分析，来鉴定在特定条件下对细胞适应度有显著影响的基因。最后，研究人员对筛选出的候选基因进行了功能验证，主要手段包括：构建过表达质粒进行基因过表达，以及构建基于ddFnCas12a的CRISPR干扰（CRISPRi）质粒进行靶向基因转录抑制，并在合成气发酵条件下评估这些遗传操作对菌株生长、碳源消耗以及乙醇、乙酸产量的影响。论文中使用的^{C. ljungdahlii}菌株为DSM 13528。

三、 研究结果与分析

1. 1.
   mariner转座子在C. ljungdahlii中的功能验证与系统优化
   研究人员首先验证了源于溶剂梭菌的mariner转座子递送质粒pYG3在^{C. ljungdahlii}中的功能。结果表明，pYG3可实现高效且相对随机的染色体整合，但其质粒消除效率较低（仅33%）。为克服此瓶颈，研究人员对系统进行了优化，构建了新质粒pCYG4。pCYG4在复制子上游引入了IPTG诱导型调控元件，从而在IPTG存在时干扰复制，实现高效质粒消除。实验验证表明，pCYG4在^{C. ljungdahlii}中实现了93.75%的高质粒消除率，同时保持了高效的转座子插入，使其更适合构建高质量突变体库。
2. 2.
   C. ljungdahlii全基因组转座子突变体库的构建
   利用优化后的pCYG4系统，研究人员通过多轮电转化，成功构建了包含约1.9×10⁵个转化子的全基因组转座子突变体库。Tn-seq分析显示，该库覆盖了3197个基因和同等数量的非编码区，约占所有基因组特征的75%。插入位点在基因组中分布均匀，显示出高度TA位点特异性。此突变体库为系统性功能筛选奠定了资源基础。
3. 3.
   与C. ljungdahlii合成气适应度相关基因的筛选
   研究人员将突变体库在合成气（实验组）和氮气（对照组）条件下连续传代培养，并对不同代次样本进行Tn-seq分析。主成分分析显示，实验组样品随传代在PC1轴上呈现方向性偏移，表明合成气环境驱动了突变体库群体的定向演化。差异丰度分析发现，随着传代进行，具有显著丰度变化（富集或耗竭）的基因数量急剧增加，证明了筛选过程的有效性。整合第3代和第5代数据，并利用KEGG通路分析，研究人员鉴定出114个在合成气条件下丰度一致性变化的基因，这些基因富集在叶酸代谢、碳代谢、卟啉代谢、辅因子生物合成及Wood-Ljungdahl途径等多个可能与气体利用生理相关的通路中，提示它们在^{C. ljungdahlii}合成气适应度中可能发挥作用。
4. 4.
   影响合成气条件下乙酸和乙醇形成的基因鉴定
   基于Tn-seq筛选结果，研究人员从丰度显著降低的基因中随机选择25个进行过表达，从丰度显著升高的基因中随机选择20个进行CRISPRi抑制，以验证它们对产物合成的具体影响。在合成气发酵条件下，过表达五个基因（CLJU_c04490、CLJU_c25060、CLJU_c06990、CLJU_c22650、CLJU_c07720）能显著增强乙醇合成。其中，过表达CLJU_c04490、CLJU_c06990和CLJU_c07720还降低了乙酸的比生产率。CLJU_c04490编码谷氨酸-1-半醛氨基变位酶（HemL），参与辅酶B₁₂前体合成；CLJU_c25060编码钼蝶呤腺苷转移酶（MoeA），参与钼辅因子合成；CLJU_c06990编码甲酸脱氢酶（FDH），直接参与CO₂还原；CLJU_c22650编码镍转运系统渗透酶，可能与一氧化碳脱氢酶成熟有关；CLJU_c07720编码Crp/Fnr家族转录调节因子。另一方面，通过CRISPRi抑制CLJU_c09160和CLJU_c23840的转录也能显著改变乙醇产量。抑制CLJU_c09160（编码羊毛硫抗生素转运蛋白渗透酶）导致生物量和乙酸产量下降，但乙醇产量增加57.5%。抑制CLJU_c23840（编码鸟氨酸/天冬氨酸氨甲酰转移酶）使乙醇产量增加15.1%，但不影响生长和乙酸产量。这些结果证实了Tn-seq筛选出的部分基因确实能够调控^{C. ljungdahlii}的产物合成谱。

四、 讨论与结论

在讨论部分，研究人员强调了本研究首次在^{C. ljungdahlii}中应用全基因组Tn-seq的意义。他们分析了筛选出的基因的功能类别：丰度显著降低的基因多与碳固定的能量/辅因子供应、关键酶成熟及转录调控相关，如Rnf复合物亚基、钴胺素和钼辅因子合成相关基因、甲酸脱氢酶亚基、以及Crp/Fnr等家族的转录调节因子基因；而丰度显著升高的基因则涉及能量代谢、碳氮利用和通量分配等。对于七个已验证能提高乙醇产量的基因，研究人员结合其注释功能，提出了它们可能通过影响辅因子合成与前体供应、碳固定与底物转化、以及碳代谢转录调控等机制来调节产物合成的假设性网络模型。例如，HemL可能通过增加辅酶B₁₂可用性来支持甲基转移；MoeA影响钼辅因子依赖的酶活性；FDH直接参与CO₂固定；镍渗透酶影响镍依赖酶功能；Crp/Fnr调节因子可能重定向碳代谢。CLJU_c09160可能通过调节膜电位或氧化还原状态影响乙醇/乙酸平衡，而CLJU_c23840则可能通过影响氮代谢和嘧啶核苷酸库触发全局转录重编程。研究人员也指出了本研究的局限性，如图书馆覆盖度（75%）未达100%，可能遗漏了必需基因或受转座子插入偏好性影响的区域，并建议未来可结合CRISPRi文库等技术进行互补筛选。

结论：本研究在产气发酵细菌^{C. ljungdahlii}中建立了一个转座子诱变系统，用于全基因组随机突变。通过应用Tn-seq，研究人员鉴定了一组与^{C. ljungdahlii}对合成气的适应度相关的基因，其中几个被进一步证明可调节乙醇和乙酸的合成。这项工作为全面理解和合理设计^{C. ljungdahlii}提供了关键的方法学和基础数据集。此外，本研究鉴定出的大量未表征基因代表了未来研究的有希望靶点，可能为理解这种具有工业相关性的生物体的独特生理学提供宝贵见解。