正交生存能力测定和高内涵表型分析表明，SLN-pDNA复合物的细胞毒性增强，并且在PC-3细胞中的敏感性也有所提高

《Toxicology in Vitro》：Orthogonal viability assays and high-content phenotyping identify enhanced cytotoxicity of SLN–pDNA complexes and heightened sensitivity in PC-3 cells

　　

作者：Thaís Moraes-Lacerda、Fernanda Garcia-Fossa、Marcelo Bispo de Jesus

研究机构：NanoCell Interactions Lab，生物化学与组织生物学系，坎皮纳斯州立大学（UNICAMP）生物研究所，巴西坎皮纳斯市

摘要

固体脂质纳米颗粒（SLNs）作为一种多功能平台，已被广泛用于治疗分子的细胞内递送，在药物和基因递送领域发挥着重要作用，这得益于它们的生物相容性、可扩展性和长期稳定性。尽管其安全性较高，但SLNs与细胞之间的相互作用并不一定是生物惰性的，尤其是在SLNs与质粒DNA（pDNA）等生物分子结合时。本研究系统评估了不同浓度下SLNs及其与pDNA复合物（SLNplexes）的亚致死毒性效应，使用了多种基于细胞活力和影像分析的方法。结果表明，间接代谢检测方法（如MTT和calcein-AM荧光检测）可能低估了毒性效应，而基于影像的分析方法（如活细胞/死细胞检测和吖啶橙计数）则能揭示出在低暴露水平下仍然存在的微妙但可重复的毒性作用。值得注意的是，SLNplexes相较于空白SLNs具有更强的毒性，这种影响在PC-3前列腺癌细胞中尤为明显。我们的研究强调了在纳米医学开发过程中，采用多种参数方法准确评估纳米颗粒诱发的亚致死毒性的重要性。

引言

固体脂质纳米颗粒（SLNs）作为一种多功能平台，能够有效递送治疗分子（包括小分子药物、蛋白质和核酸），相比传统递送系统具有更高的生物相容性、物理化学稳定性和可扩展性（Müller等人，2000年；Paliwal等人，2020年）。在基因递送方面，SLNs表现尤为突出，因为它们能有效与核酸结合，并能克服影响转染效率的主要生物学障碍，如细胞摄取、内体逃逸、核酸酶降解以及对不同细胞类型的运输差异（de Jesus和Zuhorn，2015年；Radaic和de Jesus，2018年；Paliwal等人，2020年）。然而，越来越多的证据表明，即使SLNs不含任何负载物质，其本身也可能因组成、剂量和细胞环境的不同而产生可测量的细胞毒性（Silva等人，2019a年；Kumar等人，2020年；Moraes-Lacerda和de Jesus，2022年；Garcia-Fossa和de Jesus，2024年）。最近的研究还发现，阳离子SLNs在PC-3前列腺癌细胞中促进了细胞迁移，并导致了与上皮-间质转化相关的分子变化（Garcia-Fossa和De Jesus，2024年）。这表明，需要系统地评估SLNs及其与核酸复合物（SLNplexes）对细胞的反应。

有多种方法可用于评估细胞活力，包括间接的代谢指标和直接测量膜完整性和细胞死亡的方法（Riss等人，2013年；Naveen等人，2026年）。基于指标的方法通过特定结构或功能的状态来推断细胞健康状况，例如MTT和相关的XTT/Resazurin检测主要反映线粒体/氧化还原状态（Mosmann，1983年）；Calcein-AM检测蛋白质含量（Vichai和Kirtikara，2006年）；LDH释放则用于指示膜损伤（Vichai和Kirtikara，2006年）。还有其他针对性方法通过测量细胞内ATP来评估细胞能量状态。这些方法通常快速、经济且适合高通量筛选，但它们提供的通常是整个细胞群体的平均信号，容易受到检测方法特异性影响（Holder等人，2012年；Oh等人，2014年）。直接方法则侧重于单细胞水平的细胞计数和存活分类，包括trypan blue排除、活细胞/死细胞染色以及基于膜电位的检测（McManus等人，2016年）。尽管这些方法更具特异性，但可能速度较慢且资源消耗较大，尤其是在高通量应用中，因为需要成像或电生理仪器。总体而言，这两类方法都能有效探测整体细胞活力的损失或主要代谢功能障碍，但可能无法捕捉到细胞毒性显现之前的现象，且在缺乏其他信息时难以提供充分的机制解释。

高内涵成像技术近年来已成为纳米毒理学和基于细胞的生物检测的重要工具（Zanella等人，2010年；Boutros等人，2015年）。与传统以细胞活力为中心的检测方法相比，这种技术有三个关键优势：i. 能同时检测细胞结构、细胞器和目标蛋白的多重变化；ii. 具有单细胞分辨率，可以研究亚群体、细胞异质性和时间依赖性反应；iii. 可通过计算分析定量表型特征，捕捉细胞状态的多元模式（Garcia-Fossa等人，2023年；Wolff等人，2025年）。通过将自动化显微镜与系统特征提取和单细胞分析相结合，高内涵成像技术能够检测化学或生物扰动引起的细胞和细胞器层面的精细变化，这些变化可能发生在细胞毒性显现之前（Carpenter等人，2006年；Stirling等人，2021年；Cimini等人，2023年；Garcia-Fossa等人，2025年）。对于纳米颗粒系统而言，这种技术尤为宝贵，因为它们的细胞相互作用具有高度异质性，且受尺寸分布、表面化学/电荷和生物冠层形成等因素的影响，这些因素可能导致同一细胞群体内出现不同的反应结果（Alijagic等人，2023年；Almeida等人，2024年；Menna等人，2025年）。因此，高内涵成像技术能够捕捉早期表型变化，并为理解导致细胞死亡的路径提供机制线索。

尽管SLNs作为基因递送系统的应用日益增多，但大多数研究仅关注转染效率和传统的细胞活力检测方法，未能充分了解纳米载体引发的早期亚致死性表型变化。此外，人们常常认为SLNs是惰性载体，但越来越多的证据表明，它们实际上可能根据成分、剂量和细胞环境产生不同的生物学效应（Moraes-Lacerda和de Jesus，2022年；Moraes-Lacerda等人，2024年；Menna等人，2025年）。因此，关于SLNs诱导的细胞反应的一些基本问题仍未得到充分解答，例如这些反应是由载体本身还是核酸载荷引起的，以及在癌症和非癌症细胞环境中的普遍性如何。为了解决这些问题，我们采用高内涵成像技术，结合了Live Cell Painting（LCP）技术，这是一种多通道活细胞成像方法，可以同时检测细胞器和形态特征，系统地分析SLNs及其复合物在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中的反应。通过整合传统检测方法与高内涵形态和表型分析，我们旨在揭示纳米颗粒-细胞相互作用的机制，为脂质基基因递送载体的优化和更安全的使用提供依据。

段落摘录

细胞培养

人类非肿瘤前列腺上皮细胞（PNT1A，ECACC 95012614）和肿瘤前列腺细胞（PC-3，ATCC CRL1435）在75 cm2的培养瓶中培养，培养基为10 ml的RPMI 1640（Invitrogen，纽约州Grand Island）。培养基中添加了10%的灭活胎牛血清（Gibco，巴西）和1%的青霉素/链霉素（Gibco，加拿大）。这种添加了附加成分的培养基被称为RPMI完全培养基，而未添加任何附加成分的培养基则称为...

SLN复合物的毒性高于空白SLNs，在PC-3细胞中的作用更为显著

SLNs及其复合物的物理化学性质通过粒径分布（DLS）和电泳光散射进行了表征（见补充材料），并与我们团队之前的研究结果一致（de Jesus等人，2013年；de Jesus等人，2014年；Radaic等人，2015年）。为了检验核酸结合是否会影响细胞的反应，我们比较了空白SLNs和SLN复合物在PNT1A（非肿瘤细胞）和PC-3（肿瘤细胞）中24小时暴露后的毒性效应...

讨论

为了全面了解细胞的反应，我们结合了传统的细胞活力检测方法和Live Cell Painting技术以及多参数影像分析。这种方法使我们能够：i. 分析递送载体和核酸载荷对毒性的贡献：ii. 比较肿瘤细胞和非肿瘤细胞之间的反应差异；iii. 发现并理解微妙的表型变化...

结论

我们的研究表明，当SLNs与pDNA结合时，其毒性会增强。SLN复合物的毒性始终高于空白SLNs，且这种效应在PC-3（肿瘤细胞）中的表现更为明显。这些结果提示，在评估脂质基基因递送系统的安全性时，不应假设载体本身是生物惰性的，而应明确区分载体和核酸载荷对细胞的影响...

作者贡献声明

Thaís Moraes-Lacerda： 负责初稿撰写、方法学设计、数据分析。Fernanda Garcia-Fossa： 负责审稿编辑、概念框架的构建。Marcelo Bispo de Jesus： 负责审稿编辑、监督工作、资源协调、资金申请和概念框架的构建。

利益冲突声明

作者声明以下可能构成利益冲突的财务和个人关系：Marcelo Bispo de Jesus指出其获得了圣保罗州研究基金的资助；Marcelo Bispo de Jesus还获得了坎皮纳斯州立大学教学研究支持基金的资助；此外，他还获得了国家科学技术委员会（CNPq）的资助...

致谢

我们感谢Paula Llanos的宝贵意见和慷慨协助。本研究得到了巴西高等教育人员协调委员会（CAPES）（资助代码001）、教学、研究和扩展支持基金（FAEPEX–UNICAMP；项目编号2633/17、2421/20、2237/21、2178/22和2534/23）的资助。