在一家Helix aspersa maxima养殖场发生的群体死亡事件中的病理组织学发现：可能与钙代谢异常有关

《Veterinary and Animal Science》：Histopathological findings in a mass mortality event in a Helix aspersa maxima farm: possible association with calcium metabolism alterations

　　丽贝卡·莱安德里 | 约纳塔·德维科 | 阿尔贝里科·弗兰zin | 卡拉·费拉里斯 | 凯伦·鲍威尔
那不勒斯费德里科二世大学生物学系，Via Vicinale Cupa Cinthia 26号，80126，那不勒斯，意大利

**摘要**
蜗牛养殖已成为提高农业产量的一个有趣且可持续的选择，然而，目前仍缺乏有效的 farming 实践方法。在一家蜗牛养殖场发生大规模死亡事件后，研究人员使用解剖学和组织病理学技术对 Helix aspersa maxima 进行了分析。宏观检查显示胃肠道和消化腺发生了变化，微观检查发现钙的代谢出现了紊乱。此外，唾液腺和蛋白腺也出现了不同程度的损伤，从萎缩到营养不良不等。有趣的是，在不同的器官中观察到了钙的定位和矿化过程中的异常。我们的组织病理学结果提示，钙代谢紊乱可能是导致这些死亡事件的原因之一。错误的喂养和管理方式、重金属中毒/解毒机制以及慢性热应激都应被考虑为可能的原因，需要进一步研究养殖管理和环境因素对蜗牛健康的影响，以填补这一领域的知识空白。

**1. 引言**
蜗牛属于软体动物门和腹足纲，约有1900种（Appukuttan 和 Ramadoss, 2000；Bouchet 等, 2005, 2017）。其中一些蜗牛对植物具有破坏性，被视为农业害虫；而其他种类如 Helix aspersa、Helix pomatia、Archachatina marginata、Achatina achatina、Achatina fulica 和 Helix lucorum 则具有营养、观赏、医疗或兽医价值（Adegoke 等, 2010；Cilia 和 Fratini, 2018；Singh 等, 2024）。自更新世晚期和全新世早期以来，蜗牛就已成为人类食物的一部分，并且至今仍是许多欧洲国家的传统美食（Elmslie, 2005；Miracle 等, 2000）。因此，蜗牛养殖的需求很大，并且预计这一需求将继续增长，尤其是在地中海地区（https://www.indexbox.io/store/world-snails-except-sea-snails-market-analysis-forecast-size-trends-and-insights/，访问于2026年4月13日）。事实上，蜗牛鱼子酱和肉因其高质量的营养成分而受到青睐（Adegoke 等, 2010；Gupta 和 Khanal, 2024），近年来蜗牛的养殖和消费量也在增加（Ryga?o-Galewska 等, 2022）。蜗牛的营养组成因物种而异，通常含有大量蛋白质（约8.3–20.6%），这与牛肉（20.6%）、猪肉（22.8%）、鸡肉（19.3%）和鱼肉（19.8%）相当（Bender, 1992）。像所有肉类一样，蜗牛肉中含有所有必需氨基酸以及脂肪酸和微量矿物质（Ghosh 等, 2022）。

近几十年来，蜗牛养殖已从传统的家庭副业发展成为结构化的农业产业，特别是在西班牙、葡萄牙、意大利和希腊等地，这些国家有着悠久的历史传统（Dragicevic 和 Baltic, 2005；Miracle 等, 2000）。仅法国每年的蜗牛消费量就超过3万吨，其中大部分来自主要以 Helix aspersa （现称为 Cornu aspersum）为基础的养殖系统（Elmslie, 1989）。意大利的蜗牛养殖也发展迅速（Zucaro 等, 2016），通过结构化的生产模式（如意大利户外养殖系统）促进了养殖、管理和生产的标准化（https://www.istitutodielicicoltura.com/en/the-method/，访问于2025年5月15日）。非洲国家如尼日利亚、加纳和摩洛哥也是蜗牛肉的主要消费国，蜗牛养殖成为缓解贫困和营养不良的有效手段（Agbogidi 和 Okonta, 2011；Adeyeye 等, 2020）。

事实上，可食用蜗牛的养殖可以成为提高农业产量的理想选择，因为蜗牛不需要初期的大量资金投入或劳动力，所需空间较小，并且转化效率很高（Hatziioannou 等, 2014；Murphy, 2001）。此外，从经济和环境角度来看，蜗牛养殖被视为一种可持续的养殖方式（Zucaro 等, 2016）。Forte 等人（2016）的研究估计了蜗牛养殖的碳足迹，结果显示每千克可食用蜗牛肉产生的二氧化碳当量为0.7千克，主要来源于补充饲料和运输过程。因此，蜗牛养殖为废弃土地的可持续发展提供了新的机遇（Mvodo 等, 2021）。

蜗牛可以食用多种植物、果实及其残余物以及富含钙等矿物质的植物废弃物，这些矿物质对蜗牛壳的发育至关重要（Gupta 和 Khanal, 2024；Obakanurhe 等, 2024）。研究表明，蜗牛在将牧场和有机废弃物转化为有用营养来源方面具有巨大潜力（Raimi 和 Olomola, 2020；Ndu 等, 2023），但使用商业饲料喂养时，蜗牛的生长速度和肉质更好（Garcia 等, 2006；Srijad 等, 2023）。

目前存在三种主要的养殖系统：室内/集约化、室外/粗放化以及混合/半集约化系统（Apostolou 等, 2021；Cobbinah 等, 2008）。在室内系统中，农民可以调节温度、湿度、通风和光照时间等参数以满足蜗牛的生长需求。这种系统需要较高的初期投资来建立合适的基础设施，但能够在全年各种气候条件下进行养殖，因此主要适用于冬季寒冷的地区。相反，在全年气候温暖的国家，室外系统更为常见。在这种系统中，蜗牛在整个生长周期（从孵化到越冬）都在室外饲养。虽然室外养殖的初期投资较低，但选址时需谨慎，以避免环境污染、捕食者和不良土壤条件的影响。最常见的养殖方式是混合系统，即在室内进行幼虫的饲养和培育，而在室外进行 fattening。这种系统有助于降低由害虫和恶劣天气引起的幼虫死亡率（Ryga?o-Galewska 等, 2022）。尽管养殖技术有所进步，蜗牛养殖仍面临生物、营养和环境压力带来的挑战。许多研究表明，繁殖期的蜗牛死亡率较高，这可能与它们较高的繁殖负荷有关，从而导致身体疲劳和免疫力下降（Baur 和 Baur, 2000；Barker, 2001；de Carvalho 等, 2008；Der 等, 2019）。病原体（如弧菌属细菌）常导致软组织坏死、壳层侵蚀和突然死亡（Power 等, 2024；Richards-Rios 等, 2024；Segade 等, 2013）。原生动物和寄生虫（如 Angiostrongylus cantonensis、Brachylaima 属和 Aelurostrongylus abstrusus）也可能引发人畜共患病或种间健康问题（De Vico 等, 2017；Godan, 1983）。非传染性疾病同样重要：钙和磷摄入不平衡可能导致壳变形、软化、生长受阻，特别是在繁殖期或环境压力下（Barker, 2001；Garcia 等, 2006；Obakanurhe 等, 2024）。

近年来，蜗牛养殖场频繁发生无法解释的大规模死亡事件，尤其是在温暖季节或繁殖后。这些事件通常表现为组织 Degeneration 率高和行为改变（如长时间静止、壳闭合不全），可能由生物因素引起（De Vico 等, 2017；Power 等, 2024；Richards-Rios 等, 2024；Segade 等, 2013）。然而，影响消化和生殖器官的组织病理学病变仍不十分明确（De Vico 等, 2017；Der 等, 2019）。因此，有必要识别病理模式并分析与潜在的营养或代谢紊乱之间的关系。本研究旨在描述意大利南部一家 Helix aspersa maxima 养殖场发生的大规模死亡事件中的组织病理学发现，并提出观察到的病变可能与钙代谢紊乱有关。

**2. 材料与方法**
2024年9月，意大利南部萨莱诺省的一位蜗牛养殖户报告其养殖场的蜗牛突然死亡。该养殖场采用室外养殖方式，占地5000平方米，饲料为十字花科植物。蜗牛购自批发商，作为幼虫包装出售，并按卖方建议使用商业饲料（表1）进行喂养。据养殖户称，从8月第二周起每隔两天追加碳酸钙形式的钙粉，一直持续到9月第一周。遗憾的是，无法采集到钙成分的样本。

**表1. 商业饲料的营养成分**
| 成分 | 百分比（%） |
|--------------|------------|
| 粗蛋白 | 12.6 |
| 粗脂肪 | 2.6 |
| 粗纤维 | 7.0 |
| 粗灰分 | 24.0 |
| 钙 | 8.0 |
| 镁 | 0.2 |
| 钠 | 0.0 |

**2.1. 样本采集**
从养殖场随机采集了100只濒死的 Helix aspersa maxima 样本，并从周围区域采集了10只健康的 H. a. maxima 样本作为对照。由于对照组蜗牛在自然环境中自由觅食，未接受人工管理。所有样本立即用网袋运送到那不勒斯费德里科二世大学生物系进行宏观和微观检查。

**2.2. 宏观与微观分析**
去除壳后对所有器官进行宏观检查。样本用 Davidson 溶液固定72小时后，按照先前方法进行处理（Power 等, 2024）。制作3微米厚的切片，用苏木精和伊红（h&e）染色，通过光学显微镜观察组织变化；有病变的样本进一步切片，用 von Kossa 染色以检测组织中的钙沉积情况。

**3. 结果**
**3.1. 剧烈病理变化**
濒死样本的壳层表面有浅沟。去除壳后，胃肠道出现肿胀并充满气泡状红色液体，破坏了生殖系统和消化腺的正常结构。消化腺呈不透明深棕色至黑色，常混杂白色颗粒（图1 A-B）。部分样本在处理过程中排出白色颗粒状粪便。

**图1. H. a. maxima**
(A) 剧烈病理变化：胃部肿胀，充满气泡状红色液体（细箭头）；生殖系统（双箭头）和消化腺（箭头末端）中含有白色颗粒（粗箭头）。
(B) 组织病理学：胃部（细箭头）和消化腺（粗箭头）中的嗜碱性物质及空气；消化腺（粗箭头）和唾液腺（点状）中的微观病变（h&e 染色，放大4倍，比例尺：1毫米）。

对照组样本的宏观检查未发现消化腺或其他器官的异常。

**3.2. 组织病理学**
组织病理学检查显示多个器官受损，包括消化腺、唾液腺和蛋白腺。对照组的消化腺上皮由四种细胞类型组成（基底细胞、消化细胞、钙细胞和排泄细胞），位于薄基底膜上（图2 A 和图3 A）。

**图2. H. a. maxima**
(A-B) 对照组（A）和濒死组（C-F）的消化腺：(A) 上皮细胞（虚线箭头）、消化细胞（粗箭头）、钙细胞（细箭头）和排泄细胞（双细箭头）（h&e 染色，放大40倍，比例尺：10微米）；(B) 钙细胞中的钙颗粒（细箭头）（von Kossa 染色，放大40倍，比例尺：10微米）；(C) 钙细胞中的颗粒沉积物（星号）和 vacuoles（矩形），以及基底细胞（虚线箭头）（h&e 染色，放大40倍，比例尺：10微米）；(D) 钙细胞中的钙颗粒沉积物（von Kossa 染色，放大40倍，比例尺：10微米）；(E) 钙细胞中的钙颗粒（星号）和空泡细胞（矩形）；(F) 钙细胞中的钙化颗粒（星号）和未钙化的颗粒（箭头末端）（von Kossa 染色，放大40倍，比例尺：10微米）。H. a. maxima：对照组的消化腺（A）和濒死动物的消化腺（B-D）。(A) 上皮细胞中包含消化细胞（粗箭头所示）、钙细胞（细箭头所示）和排泄细胞（双细箭头所示）（HE染色，40倍，比例尺：10微米）；(B) 钙细胞肥大和增生（细箭头所示）以及间质纤维化（点状显示）（HE染色，20倍，比例尺：20微米）；(C) 坏死区域（双细箭头所示）伴间质纤维化（点状显示）（HE染色，40倍，比例尺：10微米）；(D) 钙细胞（细箭头所示）以及管腔和血管壁上的嗜碱性沉淀物（星号标记）（HE染色，40倍，比例尺：10微米）。根据文献（Wagge, 1951），钙以小球的形式储存在细胞核附近，当钙含量丰富时，会充满整个细胞质（图2B）。在82%（82/100）的濒死动物中，消化腺的钙细胞出现肥大和增生，基底膜增厚（图3B）。在最严重的情况下（20/82，24%），观察到与炎症和间质纤维化相关的坏死（图3C），同时伴有细胞的增生，这表明组织有再生尝试。在30/82（36.6%）的样本中，钙细胞的细胞质中含有血细胞和各种空泡，这些空泡位于细胞顶端，并伴有分散的嗜酸性物质。此外，在40%的受影响动物中还观察到了嗜碱性无定形物质（33/82）。这种物质经von Kossa染色反应呈阳性，证实其为钙。48%（40/82）的样本中出现了钙聚集物的变化，通常表现为细粒状、分散均匀的形态，与嗜酸性物质混合（图2C-D）（13/40，32.5%），大多数情况下试图形成有组织的钙化小球，但最终形成未钙化的结构（图2E-F）（27/40，67.5%）。此外，在消化腺的淋巴管中，22%（18/82）的样本中管腔和血管壁上可见嗜碱性沉淀物，可能是钙化斑块，导致血管阻塞（图3D）。

对照组的唾液腺（SG）由多个腺泡组成，围绕着一个小叶内导管。可以观察到不同类型的细胞：许多充满分泌泡的黏液细胞、具有椭圆形核和泡沫状细胞质的巨大空泡细胞、含有大量暗颗粒的颗粒细胞，以及单个大分泌泡被薄层细胞质包围的囊状细胞（图4A）。下载：下载高分辨率图像（689KB）；下载全尺寸图像。

对照组唾液腺的结构在58%（58/100）的案例中发生了显著改变，尤其是细胞数量和类型比例与正常情况不同。观察到大量未分化的前体细胞、空泡细胞增多以及颗粒细胞减少，囊状细胞几乎消失（图4B）。总体而言，唾液腺出现了不同程度的改变，从萎缩（31/58，53.5%）到营养不良（27/58，46.5%）（图4C）。

对照组的蛋白质腺（AG）由分泌管组成，管腔较窄，内衬金字塔形细胞，这些细胞具有球形核和嗜碱性细胞质空泡（图5A）。濒死动物的蛋白质腺结构也发生了不同程度的改变（53/100，53%），从萎缩到营养不良，并伴随分泌质量的变化：萎缩的蛋白质腺细胞质呈现颗粒状和嗜酸性物质（图5B，20/53，38%）；而在营养不良的案例中，空泡内含有球形和多形性层状结构的嗜碱性物质（图5C，25/53，47%）。在最严重的情况下，观察到核染色加深和膜结构破坏，最终导致细胞坏死（8/53，15%）。

对样本的组织学检查未发现寄生虫、细菌或病毒的存在，也没有发现提示其存在的病变。

4. 讨论
蜗牛养殖系统中的大规模死亡事件越来越受到研究人员的关注。先前的研究将这种现象归因于多种生物因素，包括病毒、细菌和寄生虫。我们的研究记录了系统性的组织退化变化（萎缩/营养不良/坏死），这些变化在文献中非常罕见，某些方面是我们首次描述。特别重要的是消化腺中观察到的变化，尤其是钙细胞中矿化小球的形态和分布，我们认为这证明了研究对象中钙代谢的严重紊乱。事实上，钙细胞表现出多种形态变化，其重要的功能影响可以从科学文献中推断出来。钙细胞是与钙代谢和循环相关的四个器官之一，其余三个器官分别是壳、结缔组织和淋巴液。肺呼吸蜗牛的钙细胞参与广泛的代谢和生殖功能，如渗透调节、酸碱平衡、某些腺体分泌物的钙成分形成以及淋巴液中钙浓度的调节（Dittbrenner等人，2009年）。此外，钙细胞还是钙的储存场所，用于壳的再生和卵壳的形成（Fournié和Chétail，1984年；Tompa和Wilbur，1977年）。因此，这些细胞的改变显然会对个体健康产生严重影响。

遗憾的是，我们未能在文献中找到描述肺呼吸蜗牛类似病理状况的研究，因此只能对观察到的病变的发病机制提出推测。可能的解释包括不当的饲养方式、全身性的解毒过程以及长期高温暴露。通常情况下，健康的蜗牛会将钙以矿化小球的形式储存在钙细胞中，或者以细胞基部的同心结构沉积（Abolins-Krogis，1970年；Simkiss，1976年）。在我们的样本中，观察到钙聚集物的形成异常，以及细粒状钙与嗜酸性物质的混合积累（可能是蛋白质来源）。已知蜗牛中的钙积累和矿化与钙和蛋白质的饮食摄入量密切相关。富含钙和蛋白质的饮食有利于钙细胞中形成大量含有无定形碳酸钙的蛋白质小球。如果饮食中蛋白质丰富但钙不足，会产生大量“空”的蛋白质小球；而如果饮食中钙丰富但蛋白质不足，钙细胞将不含钙聚集物，因为碳酸盐在碱性环境中容易溶解（Wagge，1951年）。考虑到所提供的商业饲料配方，蛋白质和钙之间没有明显的失衡，但我们不能排除其他因素可能影响钙代谢（例如钙拮抗剂或重金属）。然而，钙聚集物出现在不同器官中，尤其是在消化腺的淋巴管中（可能是由于转移性矿化），表明淋巴液中的钙浓度升高，可能导致碳酸钙沉淀（Greenaway，1971年）。由于无法采集淋巴液并检测其钙含量，因此无法确认是否存在高钙血症。

细胞内钙过载是指细胞内钙含量过多，长期以来被认为与代谢过程紊乱和退行性/坏死现象有关（G?rlach等人，2015年；Peng和Jou，2010年）。最近的研究将钙过量摄入与所谓的“钙中毒”联系起来，这是一种由于Ca2+在细胞质和线粒体中积累引起的细胞死亡形式（Zhang等人，2019年）。尽管钙对蜗牛的生长、发育和繁殖至关重要（Binh和Thu Thao，2019年；Emelue和Omonzogbe，2018年；Fournié和Chétail，1984年；Gouveia等人，2011年；Ryga?o-Galewska等人，2023年），但必须控制细胞内的自由钙活性，因为高浓度的钙具有细胞毒性（Taylor等人，1988年）。为了避免钙中毒，多余钙会通过粪便排出（Ireland和Marigomez，1992年），或者作为预防措施，通过生物矿化作用形成小的细胞内颗粒（Brown，1982年），从而创建一个能量有效且失活的储存库（Beeby，1991年；Howard等人，1981年）。先前的研究在其他物种中也支持这一机制，进一步表明细胞内钙沉淀可能是防止细胞内自由Ca2+过量的有效方式（Bosabalidis，1987年；Davis等人，1987年）。消化腺中存在钙含量高的粪便和细粒状钙可能表明钙过载的清除机制失败。不当的饲养方式也可能导致这一现象，因为健康唾液腺中各种细胞类型的比例是平衡的（Pirger等人，2004年），而濒死蜗牛的唾液腺中不同细胞类型的比率发生变化，并出现大量未分化细胞和空泡细胞，这可能表明某些细胞类型是对特定饮食的适应性反应（Lobo-da-Cunha，2019年；Neilson和Terry，1906年；van Weel，1959年）。

钙也是调节蛋白腺分泌物的关键元素，蛋白腺细胞的形态改变可能与濒死个体的钙代谢紊乱有关。蛋白腺是雌性辅助性生殖腺，在受精卵周围形成卵膜液方面起关键作用（Nieland和Goudsmit，1969年）。因此，我们不能排除这些细胞中的钙无定形颗粒可能是细胞尝试清除微量元素的后果。先前的研究表明，钙细胞的钙颗粒与高尔基体密切相关（Simkiss和Mason，1983年），这些颗粒可能被释放到消化腺的管腔中，从而促进微量元素的排出。根据蜗牛养殖场的位置、养殖系统及土壤分析结果（出于隐私原因未显示数据），我们倾向于排除微量元素中毒作为此次大规模死亡的原因，但不能排除其他情况下类似情况的可能性。此外，长期高温可能对蜗牛健康产生影响，2024年夏季意大利南部经历了异常的热浪（Benedetti，2025年），这可能激活了消化腺（尤其是参与渗透调节的钙细胞）的生存机制。先前的研究描述了钙细胞的肥大和增生，作为调节热应激和替换受损细胞的尝试（Dittbrenner等人，2009年；Scheil等人，2011年），同时伴有消化细胞的丢失（我们的研究也有类似观察）。尽管这些机制似乎具有物种特异性，但仍需进一步研究这种适应机制。

综上所述，我们的研究结果表明，钙代谢的紊乱可能导致了所描述的死亡事件。然而，由于需要考虑不同的假设，因此无法确定这种损伤的最终原因。错误的饲养和管理方式、重金属中毒/解毒机制以及长期的热应激都可能是导致这一现象的原因，因为消化腺可能会受到这些因素的直接影响。突发性的群体死亡事件并不总是允许按照标准程序进行调查，尤其是当关于受影响物种的文献资料较少时，这就需要建立共同的调查方案。我们的研究可能会开启新的研究领域，重点探讨管理和环境因素对小型养殖动物造成的病理影响，填补这一领域的知识空白。

**机构审查委员会声明**
根据2014年3月4日的第26号法令以及欧盟法规2010/63/UE下的国家实施细则，本研究的伦理审查和批准被豁免。对于无脊椎动物（头足类动物除外）而言，无需进行伦理审批。

**作者贡献声明**
Rebecca Leandri：撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验设计、数据分析、数据管理
Gionata De Vico：撰写、审稿与编辑、资源收集、概念化
Alberico Franzin：方法设计、实验设计、数据分析、数据管理
Carla Ferraris：方法设计、实验设计、数据分析、数据管理
Karen Power：撰写、审稿与编辑、研究监督、方法设计、概念化