通过自动化聚糖组装法合成唾液酸化人乳寡糖

《Nature Communications》：Synthesis of sialylated human milk oligosaccharides by automated glycan assembly

　　

唾液酸（Sialic acids）封端于众多聚糖链的末端，并在细胞信号传导、免疫和病原体相互作用中发挥关键作用。然而，通过自动化聚糖组装快速合成唾液酸化聚糖长期以来一直是一项挑战。本文展示了一种通用策略，该策略利用大双环唾液酸结构单元在固相载体上实现可靠的α(2,3)-和α(2,6)-唾液酸化。利用该方法，研究人员组装了九个唾液酸化人乳寡糖，其中包括岩藻糖基二唾液酸化乳糖-N-四糖（Fucosyldisialyllacto-N-tetraose, DSLNF II），这是一种高度分支、岩藻糖基化的结构，通过液相方法极难合成。一个改进的全局去保护方案为获取适用于进一步生物学研究的纯的、功能化的复杂聚糖提供了途径。这项工作为自动化化学唾液酸化提供了广泛适用的解决方案，为制备用于生物医学研究的唾液酸化聚糖库打开了大门。

论文解读：通过自动化聚糖组装法合成唾液酸化人乳寡糖

一、 研究背景、现存问题与研究意义

唾液酸是一类九碳非酮糖酸家族，常见于糖蛋白、糖脂和糖RNA聚糖的非还原末端，是许多生物相互作用的关键介导者，涉及细胞分化、免疫调节、病原体粘附、信号传导和癌症等广泛领域。人乳寡糖是人乳中第三大固体成分，在婴儿营养、免疫发育和肠道菌群调节中发挥核心作用。其中，约五分之一的结构是唾液酸化的。获取结构明确、均一纯净的唾液酸化聚糖对于阐明其生物学功能、开发基于聚糖的诊断或治疗工具至关重要。然而，从天然来源中分离获得足量的单一唾液酸化HMO极为困难。

尽管多种合成方法（如化学合成、酶法组装、化学酶法）已被探索，但均存在局限。化学合成步骤繁琐、耗时；酶法则受限于糖基转移酶的可用性和底物特异性。自动化聚糖组装作为一种强大的技术，能够在固相载体上迭代偶联单糖结构单元，绕过中间体纯化步骤，显著加速复杂寡糖的生产，但将唾液酸化整合到AGA中一直存在挑战。唾液酸具有三级异头碳中心和C-1位的吸电子羧酸基，导致糖基化反应容易发生消除副反应而非取代，且难以控制α-选择性，在固相载体上的尝试常常面临产率低、副产物多的问题。先前的研究策略，如使用预制的唾液酸二糖作为结构单元，或使用特定环状保护的供体，都存在范围窄、效率有限的问题。因此，需要一个通用、稳健的解决方案来实现AGA中的唾液酸化。

为此，研究人员在《Nature Communications》上发表了本研究，旨在开发一种基于大双环唾液酸结构单元的AGA策略，以解决长期存在的固相唾液酸化难题，为快速、模块化合成复杂的唾液酸化天然产物，特别是唾液酸化人乳寡糖，提供工具，从而推动糖生物学和生物医学研究。

二、 关键技术方法概述

本研究的核心技术方法是开发并优化了基于大双环唾液酸结构单元的自动化固相唾液酸化方法。研究人员设计并制备了包含大双环结构、带有2,2,2-三氯乙氧羰基类似物连接臂的硫代唾液酸供体。通过在商用（Glyconeer?）和自建的AGA设备上进行大量条件优化，确定了最佳的溶剂体系（二氯甲烷/二氧六环混合物）、活化剂（N-碘代丁二酰亚胺/三氟甲磺酸）和供体投加方式（单次加入）。此外，研究人员探索了不同保护基（如Fmoc、Lev、氯乙酰基）在糖基接受体上的使用，以调控反应活性和选择性。最后，针对含有对酸碱敏感的唾液酸和岩藻糖键的复杂聚糖，研究人员开发了一种改进的全局去保护流程，该流程以Zn-Cu还原为起始步骤，随后进行乙酰化、温和皂化和Pd(OH)₂/C氢解，从而高效、清洁地得到最终的、可进行生物偶联的功能化唾液酸化聚糖。

三、 研究结果

1. 树脂上唾液酸化条件的优化

研究人员使用半乳糖接受体模型，系统优化了在固相上进行α-唾液化的条件。发现活化剂溶液（NIS/TfOH）的溶剂组合（二氯甲烷/二氧六环，4:1）和供体（硫代唾液酸苷2a）的单次投加方式至关重要，这能最大化局部供体浓度。在最佳条件下，两个连续偶联循环后，α(2,6)-唾液酸化二糖的分离产率达到67%。对于更具挑战性的α(2,3)-唾液酸化，当使用C-4位有取代基的半乳糖接受体时，反应效率极低。而采用在C-3和C-4位均带有临时保护基（可同时暴露）的半乳糖接受体时，α(2,3)-唾液酸化效率显著提高，分离产率达35%。这表明同时暴露C-3和C-4位羟基可缓解空间拥挤，提高C-3位偶联效率。

2. 唾液酸化人乳寡糖的自动化合成

在建立有效条件后，研究人员合成了九种具有代表性的唾液酸化HMOs，靶向基于乳糖-N-四糖核心和乳糖-N-新四糖核心的结构，以评估在末端和内部位置进行α(2,6)-和α(2,3)-唾液化，以及与岩藻糖化的组合。成功合成的目标分子包括流感病毒诱饵LSTc 9、坏死性小肠结肠炎预防剂DSLNT 14以及与癌症相关的聚糖DSLNF II 17 等生物相关化合物。产率在15%至31%之间。合成过程揭示了一些关键发现：当末端半乳糖是更大寡糖（如LNnT核心）的一部分时，其反应性显著降低，需要更多唾液酸化循环；内部葡萄糖胺的唾液化效率相对较高；岩藻糖的存在和远端糖单元的保护基性质（如苯甲酰酯对比苯醚）能显著影响末端α(2,6)-唾液化的效率，但对α(2,3)-唾液化影响不大。

3. DSLNF II的自动化合成

DSLNF II是一个复杂的HMO，具有分支的LNT核心，带有一个α(1,4)-连接的岩藻糖和两个唾液酸。研究人员通过尝试不同的合成路线（Route A和Route B）和序列，克服了晚期岩藻糖化和半乳糖化的困难。最终，通过路线B2获得成功：早期移除氯乙酰基以在C-3位连接半乳糖，随后在C-4位进行岩藻糖化，最后在内部分葡萄糖胺和末端半乳糖受体上进行双唾液酸化。使用半乳糖基磷酸酯3g确保了β(1,3)-连接。最终以12%的产率获得了目标产物17，并伴有少量单唾液酸化副产物，表明内部葡萄糖胺的唾液酸化最具挑战性。

4. 保护化唾液酸化HMOs的全局去保护

研究人员开发了一种温和、统一的去保护序列，以去除苯基/苯甲酰基/乙酸酯/Troc类/三氯乙酰胺基/Cbz等保护基，同时保持唾液酸和岩藻糖糖苷键的完整性。最初尝试的“碱优先”路线产率较低（27%），且有副产物。改进后的方案以Zn-Cu在乙酸中50°C下还原为起始步骤，干净地裂解了N-5位的Troc类氨基甲酸酯，并将NHTCA完全还原为NHAc。随后进行乙酰化、0.1 M LiOH温和皂化，以及最终在含有乙酸的^tBuOH/H₂O中用Pd(OH)₂/C进行氢解。此序列产率高、纯度好，对α(2,6)-唾液酸化聚糖的产率达56–64%，对α(2,3)-唾液酸化聚糖的回收率较低（23–40%）。所有聚糖在还原端都带有5-氨基戊基间隔臂，便于后续生物共轭应用。

四、 讨论与结论

研究人员建立了一个广泛适用的解决方案，以应对自动化聚糖组装中长期存在的挑战：在树脂上构建唾液酸化寡糖。通过将大双环唾液酸供体整合到AGA工作流程中，并系统优化关键参数，在固相自动化平台上实现了高效的α(2,6)-和α(2,3)-唾液酸化。目前对过量双环供体的需求是一个限制，但过量供体可以回收和再活化/再循环，这有助于减轻材料消耗。该方法的威力通过九种复杂HMO结构（包括岩藻糖化和多唾液酸化实例，如DSLNF II）的AGA得以证明。这些案例研究揭示了关于糖基化序列的关键见解，以及远程单糖成分的保护基选择等效应如何显著影响唾液酸化。这些见解将指导未来复杂聚糖组装的合成规划。改进的去保护方案能够清洁地去除甚至最顽固的保护基，提供分析纯的聚糖。

总之，这些发现显著扩展了AGA的能力。均质的唾液酸化寡糖现在可以以快速、模块化的方式获得。AGA有助于探究岩藻糖或远程位置保护基的影响，并为发现合成碳水化合物化学中的构效关系提供了一个强大的平台。