槲皮素乳剂通过调控NRF2/NF-κB信号通路改善UVA诱导的皮肤光老化

《Pharmaceuticals》：Quercetin Emulsion Ameliorates UVA-Induced Skin via Modulation of NRF2/NF-κB Signaling Pathways Jingjing Guo, Zetao Qian, Kai Ji, Hanghang Zhou, Xueyan Wang, Chao Lian, Xiaoqiang Liu and Xuanfen Zhang

　　

背景：UVA诱导的光老化由持续的氧化应激、炎症和细胞外基质(ECM)降解的自我增强循环驱动。槲皮素(Que)具有强大的光保护潜力，但其临床应用受到水溶性差和皮肤渗透性低的限制。目的：开发稳定的槲皮素递送系统，并通过NRF2/NF-κB信号轴评估其对UVA诱导的光老化的保护功效。方法：通过网络药理学和分子对接识别潜在靶点。配制并表征了水包油(O/W)纳米乳剂。在UVA照射的人皮肤成纤维细胞(HSF；1.2 J/cm2/天，持续5天)和BALB/c小鼠模型(20 J/cm2/天，持续8周)中评估其效果。结果：网络药理学鉴定出槲皮素与光老化之间共有85个共享靶点。分子对接证实了槲皮素与NRF2、NF-κB p65、SOD2和MMP-1的高亲和力(结合能< -7.0 kcal/mol)。优化的O/W纳米乳剂(144-154 nm，Zeta电位-38至-43 mV)将槲皮素的溶解度提高了175倍，并遵循Higuchi释放动力学。在HSF中，30 μM槲皮素将SA-β-Gal阳性率从45.8%降至12.5%(抑制率73%)，将活性氧(ROS)降低66%，并将I型胶原强度恢复至82 ± 3 a.u.。在体内，局部应用0.3%槲皮素乳剂显著减轻皮肤褶皱增厚(厚度从3135 μm减少到2170 μm；减少30.6%)，并实现91%的胶原蛋白保留率。从机制上讲，槲皮素处理在mRNA和蛋白水平上显著上调NRF2和SOD2的表达，同时抑制NF-κB p65/MMP-1/3炎症轴(p < 0.01)。结论：局部槲皮素乳剂通过重新平衡NRF2/NF-κB轴，有效促进真皮递送并减轻UVA诱导的光老化，从而增强抗氧化防御并保护ECM完整性。该制剂代表了皮肤光保护和功能性化妆品干预的稳健策略。

研究背景与目的

皮肤光老化是长期暴露于紫外线辐射导致的累积性退行性过程，其中UVA凭借其卓越的真皮穿透性和在日常太阳辐照中的主导地位，是大多数临床光老化表型的主要驱动因素。不同于UVB，UVA主要通过光化学机制发挥作用，其激发内源性发色团产生活性氧(ROS)，继而损伤线粒体完整性并催化氧化损伤的积累。ROS作为关键信号线索，触发应激响应通路的持续激活，特别是MAPK/AP-1和NF-κB级联的持续激活上调促炎细胞因子和基质金属蛋白酶(MMP)，从而加速胶原蛋白降解和ECM碎裂。同时，NRF2/ARE介导的抗氧化防御轴受到抑制，降低了HO-1、NQO1、SOD2等细胞保护酶的表达，削弱了皮肤中和氧化损伤的能力。在NRF2和NF-κB通路之间存在复杂的双向串扰，慢性UVA暴露导致其失衡，促进了一个有害的"氧化-炎症"正反馈循环。

槲皮素是一种重要的膳食类黄酮，因其强大的抗氧化和抗炎特性而显示出良好的光保护功效。然而，以往的研究大多集中在其对角质形成细胞的即时效应，对其在长期UVA诱导的真皮结构重塑以及NRF2和NF-κB信号之间复杂相互作用的影响探索不足。此外，槲皮素的临床应用受到其水溶性差和皮肤渗透性低的严重限制。

本研究旨在开发一种稳定的槲皮素递送系统，并评估其通过调节NRF2/NF-κB信号轴对UVA诱导的光老化的保护效果，为槲皮素在光防护领域的应用提供坚实的机制基础。

关键技术方法

研究人员综合运用了多种技术。首先，通过网络药理学预测槲皮素干预光老化的核心靶点，并使用分子对接验证结合亲和力。其次，制备了水包油纳米乳剂，并通过动态光散射、Zeta电位测定、HPLC-UV分析和Franz扩散池系统对其粒径、稳定性、载药量和体外释放动力学进行了系统表征。然后，建立了UVA诱导的慢性光老化模型，包括人皮肤成纤维细胞体外照射模型和BALB/c小鼠体内照射模型。细胞实验评估了细胞衰老、氧化应激标志物、蛋白和mRNA表达以及胶原I水平。动物实验则评估了皮肤宏观和微观结构变化、皮肤褶皱厚度、组织学改变、氧化应激标志物以及相关信号分子的蛋白和基因表达。所有统计分析均通过GraphPad Prism和SPSS软件进行。

研究结果

2.1. 网络药理学和分子对接揭示了潜在的靶点和通路

研究人员识别了452个槲皮素潜在靶点和294个光老化相关基因，其中85个为交集靶点。PPI网络分析确定了AKT1、TNF、IL-6、NFKB1和MMP9等枢纽基因。富集分析显示，交集靶点显著富集于氧化应激反应、炎症反应和胶原分解代谢过程，KEGG通路分析进一步表明在NF-κB、TNF和PI3K-Akt信号通路中富集。分子对接证实槲皮素与NRF2、NF-κB p65、SOD2、MMP-1和IL-6等核心靶点具有很强的结合亲和力(结合能均低于-7.0 kcal/mol)。

2.2. 槲皮素乳剂递送系统具有纳米级分散、缓释和短期稳定性

制备的槲皮素乳剂形成了稳定的纳米分散体系，0.1%和0.3%槲肽素组的平均粒径分别为144.25 ± 1.31 nm和154.53 ± 5.21 nm，Zeta电位在-38.5至-42.8 mV之间。与纯水相比，该乳剂系统将槲皮素的溶解度提高了175倍。体外释放研究表明，乳剂呈现缓释特征，其释放数据严格遵循Higuchi模型，表明药物释放主要由Fickian扩散机制控制。乳剂在4°C和25°C下均表现出良好的短期稳定性。

2.3. 槲皮素处理改善UVA诱导的光老化表型并调节HSF中的NRF2/NF-κB信号

在细胞实验中，UVA照射使细胞衰老相关β-半乳糖苷酶阳性细胞比例显著增加。槲皮素处理以剂量依赖性方式改善了这种衰老表型。同时，槲皮素显著降低了UVA诱导的细胞内ROS和丙二醛(MDA)水平，恢复了谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。在机制层面，槲皮素干预上调了NRF2和SOD2的蛋白表达，同时下调了磷酸化NF-κB p65以及MMP-1和MMP-3的表达。RT-qPCR结果与蛋白变化一致，证实了转录水平的调控。此外，槲皮素处理也显著增加了I型胶原的免疫荧光强度。

2.4. 局部槲皮素乳剂减轻小鼠皮肤慢性UVA诱导的光老化表型并调节NRF2/NF-κB平衡

在动物模型中，慢性UVA照射导致小鼠背部皮肤出现明显的深层横纹、皮革样粗糙和局部侵蚀。局部应用0.3%槲皮素乳剂显著缓解了这些结构改变，并使皮肤结构更为平滑。皮肤褶皱厚度测量显示，0.3%槲皮素处理在8周时显著抑制了UVA引起的皮肤增厚，使其从3135 μm减少到2170 μm，抑制率达30.6%。H&E染色和Masson三色染色表明，槲皮素处理逆转了UVA诱导的表皮棘层肥厚和角化过度，恢复了真皮胶原纤维的连续性和排列，胶原面积密度从UVA组的48%恢复至82%。生化检测显示，槲皮素干预恢复了皮肤组织中的超氧化物歧化酶(SOD)和GSH-Px活性，并降低了MDA含量。Western blot和RT-qPCR分析表明，槲皮素在体内上调了NRF2/SOD2的表达，同时抑制了NF-κB/MMP轴的信号。免疫组化染色进一步证实，槲皮素处理显著降低了MMP-1、MMP-3、NF-κB p65和IL-6在皮肤组织中的表达。

讨论与结论总结

在讨论部分，研究人员指出，慢性UVA暴露与活性氧产生增加有关，这启动了脂质过氧化、DNA损伤和应激相关信号通路的持续激活。这些事件进一步上调了MMP，加速了胶原蛋白和ECM的分解，并与皱纹的形成相关。本研究在体外HSF模型和体内慢性UVA小鼠模型中，均观察到槲皮素乳剂处理具有一致的保护作用。这些作用包括减少氧化应激负担、增强抗氧化防御、以及抑制NF-κB相关信号及其下游效应子MMP-1和MMP-3。这些生化变化伴随着成纤维细胞衰老表型和皮肤组织学终点的显著改善。本研究的创新之处在于：专注于真皮成纤维细胞和结构重塑，直接证明了其对MMP和胶原相关终点的改善；在同一实验系统中同时观察到了NRF2/SOD2的激活和NF-κB的抑制；通过优化的O/W纳米乳剂系统实现了槲皮素溶解度的175倍提升，增强了其保护功效。研究也承认了局限性，包括缺乏NRF2/NF-κB组分的基因敲除或过表达的直接因果证据，以及人与鼠皮肤屏障结构的差异，未来需要在人离体皮肤系统中进一步验证。

结论：本研究证明，优化的O/W纳米乳剂显著提高了槲皮素的溶解度(175倍)和真皮递送效率，有效克服了其主要转化限制。研究结果证实，该系统的局部干预通过协调NRF2/NF-κB信号轴改善了慢性UVA诱导的皮肤光老化。通过同时增强NRF2介导的抗氧化防御和抑制NF-κB驱动的基质降解，该配方恢复了胶原蛋白完整性并保持了真皮结构。这些结果确立了槲皮素负载的纳米乳剂作为皮肤病学光保护的有效候选者，为类黄酮基抗衰老干预措施的临床开发提供了一个机制框架。