一种针对大肠埃希菌抗菌候选物优先排序的五重最大类药性策略

《Pharmaceuticals》：A Fivefold Maximum Drug-Likeness Strategy for Prioritizing Antibacterial Candidates Against Escherichia coli Haoyu Zhu, Shijie Du, Qin Yang, Lu Xu and Wei Shi

　　

背景/目标：早期抗菌药物发现需要在活性与更广泛的可开发性相关性质之间取得平衡。本研究开发了一种五重最大类药性策略（Fivefold Maximum Drug-Likeness strategy, 5F-MDL），作为一个多维的、关注可开发性的框架，用于针对大肠埃希菌（Escherichia coli, E. coli）的抗菌候选物进行优先排序。 方法：研究人员利用一组针对特定终点的深度学习模型构建了一个33维的预测性质谱。通过将大约1600万个市售分子的归一化性质谱与临床批准的头孢菌素参考药物进行比较，对它们进行了筛选。选择了15个排名最高的候选物进行实验评估。通过纸片扩散法、最低抑菌浓度（Minimum Inhibitory Concentration, MIC）和最低杀菌浓度（Minimum Bactericidal Concentration, MBC）测定评估了抗菌活性。分子对接、分子动力学模拟、MM-PBSA分析和Bocillin-FL竞争标记实验被用作与靶点相关的支持性分析。 结果：在15个优先排序的候选物中，三个化合物对大肠埃希菌ATCC 25922显示出可测量的抗菌活性。在活性候选物中，M2显示出最有利的体外活性谱，其MIC为25.6 μg/mL，MBC为51.2 μg/mL，尽管其效力仍弱于头孢呋辛。对接、分子动力学和MM-PBSA分析表明，M2可以在模拟的PBP2结合袋内维持相对稳定的非共价相互作用模式，并且Bocillin-FL实验显示M2在体外降低了PBP2的荧光探针标记。 结论：这些发现为5F-MDL作为一种用于早期抗菌候选物选择的多维优先排序策略提供了初步的概念验证支持。M2应被视为一个需要进一步优化的初步抗菌先导物，而非经过验证的先导化合物。其更广泛的适用性、比较优势以及与机制的关联性，需要使用更大的候选物集合、耐药临床分离株、系统性基准测试和直接的靶点验证实验进行进一步验证。

论文解读：一种针对大肠埃希菌抗菌候选物的多维可开发性优先排序策略

一、 研究背景与目的

药物发现是现代医学的基石，然而，新疗法的发现与开发过程效率低下、成本高昂且易失败。随着细菌耐药性的全球性加剧，尤其对于革兰氏阴性菌（如大肠埃希菌），开发新抗生素面临巨大挑战。当前的发现策略，如高通量筛选（HTS）和计算机辅助药物设计（CADD），虽然有效，但往往侧重于单一目标（如结合亲和力或预测活性），未能充分整合与药物可开发性相关的多维度性质，包括理化性质、药代动力学、疗效、安全性和稳定性。这导致许多计算上看似有前景的分子在进入实验测试后，由于渗透性、胞内蓄积、溶解性等可开发性限制而失败，形成了“转化瓶颈”。为了弥合这一差距，本研究提出了一种名为“五重最大类药性”的策略。该策略旨在构建一个多维的、关注可开发性的优先排序框架，旨在从大规模商业化合物库中筛选出不仅在靶点亲和力上，更在整体可开发性上与已批准的临床药物具有高度相似性的候选分子，从而提高早期抗菌候选物选择的效率和成功率。

二、 关键技术方法

研究人员基于“五重最大类药性”策略，开发了一个集成的计算与实验验证工作流。首先，他们从公共数据库（如ChEMBL, PubChem）收集数据，针对与五个可开发性维度（理化性质、药代动力学、疗效、安全性、稳定性）相关的33个分子性质终点，训练了33个独立的深度学习定量构效关系（QSAR）模型。这些模型构成了一个33维的预测性质谱生成器。其次，他们从eMolecules、TargetMol和MedChemExpress等商业库中收集了约1600万个市售小分子作为虚拟筛选库。然后，通过计算每个候选分子的预测性质谱与三种临床批准的头孢菌素参考药物（头孢拉定、头孢呋辛、头孢曲松）图谱之间的欧氏距离，得到一个综合相似性得分（DML），并依此对分子进行排名。最后，从每个参考药物组中选取排名前五的分子，共获得15个优先候选物。对这些候选物，研究团队进行了一系列体外抗菌活性测试（纸片扩散、MIC、MBC测定）、基于青霉素结合蛋白2（PBP2）结构的分子对接和分子动力学模拟、MM-PBSA结合自由能计算，以及Bocillin-FL竞争标记实验，以评估其活性、结合模式并提供靶点相关性的支持性证据。

三、 研究结果

2.1. 预测子模型性能评估：针对33个性质终点的深度学习子模型在独立测试集上表现出良好的预测性能。27个回归模型的平均决定系数（R²）约为0.90，6个分类模型的平均接收者操作特征曲线下面积（ROC AUC）约为0.94，表明这些模型能够可靠地生成用于后续优先排序的多维性质谱。

2.2. 候选药物性质谱分析：将参考药物与优先排序的候选分子的33维预测性质谱进行可视化比较显示，排名靠前的候选分子在归一化性质空间中，其曲线模式与对应的参考药物整体相似，表明5F-MDL策略能够富集在预测的多维性质谱上与参考药物相似的分子。

2.3. 虚拟筛选结果与DML优先排序：对约1600万个分子进行5F-MDL优先排序后，筛选出15个候选物。所有候选物的综合相似性得分（DML）均高于0.93，表明它们在多维性质空间中与参考药物高度相似。其中，活性候选物M2和M9与头孢呋辛相关，M8与头孢拉定相关。

2.4. 纸片扩散法评估抗菌活性：在15个候选物中，仅有M2、M8和M9对大肠埃希菌ATCC 25922产生了明显的抑菌圈，显示出可测量的表型抗菌活性。其中，M2的抑菌圈直径最大，与阳性对照头孢呋辛最为接近。

2.5. MIC和MBC测定结果：活性候选物的MIC值分别为M2 (25.6 μg/mL)， M8 (25.6 μg/mL)， M9 (51.2 μg/mL)，而头孢呋辛的MIC为3.2 μg/mL。MBC值分别为M2 (51.2 μg/mL)， M8 (102.4 μg/mL)， M9 (102.4 μg/mL)。MBC/MIC比值均≤4，表明其具有杀菌活性。综合来看，M2在三个活性候选物中显示出最有利的体外活性谱，尽管其效力仍显著弱于头孢呋辛。

2.6. 分子对接结果：对接分析显示，大多数候选分子偏好结合在PBP2的Cavity 1。在活性候选物中，M8获得了最有利的对接分数（-11.3 kcal/mol），但其体外活性并非最强，而活性最强的M2对接分数为-9.8 kcal/mol，表明仅凭对接评分无法充分解释或预测其抗菌表现。对接模型为M2与PBP2活性位点的可能结合模式和相互作用提供了结构假说。

2.7. 分子动力学模拟：对M2-PBP2和头孢呋辛-PBP2复合物进行100 ns分子动力学模拟。结果显示，M2-PBP2复合物表现出相对稳定的构象（平均RMSD为2.8 ?），且平均氢键数量高于头孢呋辛-PBP2复合物。轨迹分析显示M2与LYS162和THR202残基保持了高占据率的氢键相互作用。MM-PBSA计算表明M2-PBP2的结合自由能（-38.54 kcal/mol）比头孢呋辛-PBP2（-29.40 kcal/mol）更有利。这些结果为M2能在模拟条件下与PBP2形成稳定的非共价相互作用模式提供了计算支持。

2.8. Bocillin-FL竞争实验：该体外生化实验表明，M2能以浓度依赖的方式降低荧光探针Bocillin-FL对PBP2的标记，提示M2可能与PBP2活性位点区域发生相互作用。这为目标相关性提供了初步的生化证据。

四、 讨论与结论

讨论：本研究初步验证了5F-MDL作为一种多维、可开发性感知的抗菌候选物优先排序框架的可行性。研究成功地从大规模库中富集到少数具有表型活性的分子（3/15），表明该策略在整合多维度性质进行筛选方面具有一定价值。然而，也存在重要局限性：活性候选物的效力仍远低于参考药物；高淘汰率凸显了预测性质谱尚不能完全捕捉影响革兰阴性菌全细胞活性的所有因素（如外膜渗透性）；对接评分与表型活性不完全相关，证实了单一维度排序的不足；本研究缺乏与现有优先排序方法的正式基准比较、更大规模的前瞻性验证、对耐药临床菌株的测试以及更直接的靶点功能验证实验。未来工作应聚焦于扩大验证规模、进行系统性基准测试、优化模型以纳入更多革兰阴性菌特异性的可开发性端点，并开展深入的机理研究。

结论：在本研究中，研究人员开发了一种用于针对大肠埃希菌的早期抗菌候选物优先排序的5F-MDL工作流。通过整合五个可开发性相关维度的33个预测分子性质，该工作流能够从大型商业筛选库中优先排序候选分子，并为多维的、关注可开发性的筛选提供了初步的概念验证支持。在15个优先排序的候选物中，M2在测试条件下显示出最有利的整体体外活性谱，对大肠埃希菌ATCC 25922具有可测量的抑制和杀菌活性。然而，其效力仍显著弱于头孢呋辛，因此应被视为一个需要进一步优化的初步抗菌先导物，而非经过充分验证的先导化合物。对接、分子动力学、MM-PBSA和Bocillin-FL竞争分析为与模拟的PBP2活性位点区域的相互作用提供了靶点相关的支持性证据，但并未最终确定PBP2为主要胞内靶点或阐明确切的作用机制。总体而言，5F-MDL可作为抗菌候选物多维优先排序的探索性框架。其更广泛的适用性、比较优势和机理相关性，需要使用更大的前瞻性化合物集、耐药临床分离株、系统性基准测试和直接的靶点验证实验进行进一步验证。