《Plants》：Functional Characterization of AmGPPS/GGPPS Gene Family in Antirrhinum majus and the Regulatory Role of AmGPPS6 in Floral Scent Variation
Shaorong Dong,
Banghan Liu,
Jiongli Chen,
Chong Ma,
Shuangshuang Cao,
Haoyue Wang,
Senbao Shi,
Xiaohui Song,
Longqing Chen and
Zhenglin Qiao
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香叶基二磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase, GPPS）是植物类异戊二烯代谢途径中的关键酶，调控挥发性单萜的生物合成，在金鱼草（Antirrhinum majus L.）花挥发性萜类化合物（Floral volatile ter
香叶基二磷酸合酶（Geranyl diphosphate synthase, GPPS）是植物类异戊二烯代谢途径中的关键酶，调控挥发性单萜的生物合成，在金鱼草（Antirrhinum majus L.）花挥发性萜类化合物（Floral volatile terpenoids, FVTs）的生物合成及品种间变异中发挥重要作用。尽管其对花香形成至关重要，但金鱼草中的GPPS/GGPPS基因家族尚未得到系统表征。本研究在基因组水平鉴定了9个GPPS/GGPPS家族成员，包括6个AmGPPS和3个AmGGPPS基因，系统发育分析将其分为不同的亚家族。研究人员进一步分析了其染色体定位、基因结构、保守蛋白基序及启动子顺式作用元件，揭示了该基因家族内的保守性与功能分歧。为探究其功能角色，研究人员比较了强香品种（Am3）与弱香品种（Am5）盛花期基因表达谱，发现AmGPPS6表现出最显著的差异表达。通过瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默（Virus-induced gene silencing, VIGS）进行功能验证表明，过表达AmGPPS6显著增加萜类产物，总花挥发性萜类化合物（FVTs）增加1.4倍，单萜和倍半萜释放均增强；反之，沉默AmGPPS6显著减少罗勒烯及其异构体等关键单萜的释放。序列分析显示，AmGPPS6与经典GPPS小亚基（GPPS.SSU）共享67.04%的一致性，但缺乏保守的催化DDx2-D基序，提示AmGPPS6无催化活性，可能通过与AmGGPPS2形成异源二聚体发挥功能，这一互作得到转录表达模式的协同性支持。此外，研究在GPPS.SSU中鉴定到自然序列多态性，这些变异而非GPPS.LSU中的变异驱动了品种间单萜释放的差异。综上所述，AmGPPS6是金鱼草花香生物合成的关键调节因子，该研究为GPPS/GGPPS基因的功能提供了新见解，并为观赏植物芳香性状的分子育种提供了有价值的基因靶点。
本研究聚焦于观赏植物金鱼草（Antirrhinum majus）花香形成的分子机制，针对其花挥发性萜类化合物（Floral Volatile Terpenoids, FVTs）生物合成上游关键酶——香叶基二磷酸合酶（Geranyl Diphosphate Synthase, GPPS）/香叶基香叶基二磷酸合酶（Geranylgeranyl Diphosphate Synthase, GGPPS）基因家族进行了系统性的鉴定与功能解析。论文发表于《Plants》期刊，旨在通过基因组学手段结合体内功能验证，阐明金鱼草品种间花香强度差异的遗传基础，特别是AmGPPS6基因在调控单萜释放中的核心作用。
在研究方法上，研究人员选取了强香品种Am3和弱香品种Am5作为实验材料，利用双向BLAST和Pfam数据库在全基因组范围内鉴定了GPPS/GGPPS家族成员。通过生物信息学分析涵盖了系统发育树构建、染色体定位、基因结构与保守基序分析、启动子顺式元件预测以及共线性分析。在功能验证层面，采用了实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达谱，并利用农杆菌介导的真空渗透法在同源系统中进行了瞬时过表达和病毒诱导的基因沉默（VIGS）实验，结合气相色谱-质谱联用（GC-MS）技术测定花挥发物的成分变化。
研究结果部分，首先通过全基因组鉴定，研究人员在金鱼草中识别出9个GPPS/GGPPS家族成员，其中6个为AmGPPS，3个为AmGGPPS。理化性质分析显示这些蛋白分子量在32.43至46.30 kDa之间，主要定位于细胞质和叶绿体。染色体定位表明这些基因不均匀分布在第2、3、5、6和7号染色体上，其中第2号染色体分布最为密集。基因结构与蛋白特征分析显示，AmGPPS1与AmGPPS2具有相似的外显子-内含子结构，而AmGPPS3拥有最多的外显子数量。多序列比对发现所有AmGGPPS成员均含有两个DDx2–4D催化基序，而AmGPPS6仅含有辅助性的CxxxC基序，缺乏催化基序，暗示其需要与大亚基形成异源二聚体。启动子顺式元件分析揭示光响应元件占比最高，提示该基因家族可能受光信号调控。共线性分析表明金鱼草与双子叶植物番茄和拟南芥具有更高的基因共线性关系。
表达模式分析结果显示，在盛花期花瓣中，AmGPPS6在强香品种Am3中的表达量显著高于弱香品种Am5，且与花香强度呈正相关，因此被选为核心候选基因进行后续验证。
在AmGPPS6基因的初步功能表征中，瞬时过表达实验显示，在弱香品种Am5中过表达AmGPPS6导致该基因转录水平显著升高，同时与其协同表达的AmGGPPS2也显著上调，而AmGGPPS1则下调。GC-MS分析证实，过表达植株的总FVTs释放量增加了1.4倍，其中β-罗勒烯和β-甜没药烯等单萜和倍半萜的释放量显著增强。相反，在强香品种Am3中进行瞬时沉默实验，AmGPPS6的转录水平显著降低，导致AmGGPPS1和AmGGPPS2同步下调。挥发物分析表明，沉默株系中FVTs的总贡献率下降约50%，特别是罗勒烯和别罗勒烯的释放量显著减少，而其他挥发物无明显变化。
讨论与结论部分指出，AmGPPS6与薄荷MpGPPS.SSU亲缘关系最近，且与经典的GPPS.SSU具有67.04%的序列相似性，属于种内直系同源进化成员。该研究首次在体内证实了AmGPPS6作为限速节点的作用，其表达水平直接决定了单萜的释放量。机制上，AmGPPS6作为II型小亚基（SSU-II），通过与大亚基AmGGPPS2形成异源二聚体，将催化产物特异性从GGPP转向GPP，从而支持单萜的生物合成。这种“灵活的多伙伴互作”模式使得金鱼草能够高效利用内源性大亚基资源。此外，AmGPPS6启动子区的光响应元件暗示了其可能受光信号通过MYB转录因子进行调控。研究还发现，AmGPPS6的功能操纵特异性影响罗勒烯类化合物，体现了精细的代谢通道调控。
综上所述，本研究系统鉴定了金鱼草GPPS/GGPPS基因家族，并通过双向功能验证确立了AmGPPS6是调控金鱼草品种特异性花香变异的关键基因。这不仅丰富了植物萜类生物合成调控的理论框架，也为通过基因编辑或标记辅助选择策略培育强香金鱼草新品种提供了关键的靶基因和技术依据。
