PGAM2通过JAK2/STAT3通路调节败血症引起的膈肌萎缩 Yun Chu、 Xinrun Yuan、 Xiaopo Gao以及 Jinlong Luo

《Biomedicines》：PGAM2 Regulates Sepsis-Induced Diaphragmatic Atrophy via the JAK2/STAT3 Pathway Yun Chu, Xinrun Yuan, Xiaopo Gao and Jinlong Luo

　　### 摘要

**背景/目的**：败血症引起的系统性炎症常常导致膈肌功能障碍和肌肉萎缩，从而影响呼吸功能。磷酸甘油酸变位酶2（PGAM2）是糖酵解过程中的关键酶，在肌肉能量代谢中起着重要作用，但此前尚未发现其与败血症引起的膈肌功能障碍有关。本研究旨在探讨PGAM2在败血症引起的膈肌萎缩中的作用及其潜在机制。

**方法**：采用C57BL/6小鼠的盲肠结扎和穿刺（CLP）方法建立败血症模型。测量了小鼠的体重和膈肌重量以及肌肉纤维的横截面积。通过免疫荧光、Western blotting和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）技术检测PGAM2的表达。在体外实验中，C2C12肌管被肿瘤坏死因子α（TNF-α）处理，并通过小干扰RNA（siRNA）敲低和质粒过表达手段调节PGAM2的表达。同时检测了肌肉萎缩标志物（MuRF1、MAFbx/atrogin-1）和JAK2/STAT3信号通路的活化情况。

**结果**：CLP导致显著的膈肌萎缩，表现为膈肌重量减少了约38%，肌肉纤维横截面积减少了约37%。相比之下，败血症小鼠的PGAM2蛋白表达增加了约105%。PGAM2敲低后，MuRF1和MAFbx的表达降低，从而减轻了肌管萎缩；而PGAM2过表达则加剧了萎缩。此外，PGAM2敲低还抑制了JAK2/STAT3信号通路的活化。

**结论**：这些结果表明，PGAM2通过激活JAK2/STAT3信号通路参与败血症引起的膈肌萎缩。因此，PGAM2可能成为治疗败血症相关膈肌功能障碍的潜在靶点。

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### 1. 引言
败血症会引发全身炎症反应，其特征是促炎细胞因子（如IL-1β、IL-6和TNF-α）水平升高，这些因子会损害骨骼肌的收缩能力[1,2,3,4,5]。同时，循环系统紊乱（包括低血压和灌注不足）会减少膈肌的氧气供应，导致组织缺氧[5,6,7]。这些因素共同作用导致呼吸衰竭，常常需要机械通气[7]。然而，虽然机械通气能够挽救生命，但它会通过改变蛋白质代谢、增加氧化应激和损害线粒体功能而加重膈肌损伤[8,9]。在涉及的分子途径中， ubiquitin–proteasome系统（UPS）在调节蛋白质降解和肌肉萎缩中起核心作用[10]。在败血症状态下，UPS被细胞因子、氧化应激和代谢紊乱激活，加速肌肉蛋白质的降解[11]。E3连接酶MuRF1和MAFbx在败血症中表达增加，促进了肌球蛋白等肌肉蛋白质的分解[12]。

磷酸甘油酸变位酶（PGAM2）是一种糖酵解酶，可催化3-磷酸甘油酸和2-磷酸甘油酸之间的转化[13,14]。缺乏PGAM2的斑马鱼表现出肌肉萎缩和纤维尺寸减小，这表明PGAM2对肌肉生长至关重要[15]。需要注意的是，PGAM2的功能不仅由其天然形式决定，还受到翻译后修饰的影响[16,17]。例如，SUMO修饰的PGAM2会抑制C2C12细胞的成肌分化[18]。

除了糖酵解作用外，PGAM2还参与病理过程：在其持续过表达的情况下，会降低心力衰竭的心脏耐受性[19]；在骨骼肌分化过程中，其表达受到TNF-α的强烈调控，从而与炎性肌肉萎缩相关[20,21]。这些发现表明，PGAM2在炎症条件下的改变可能导致肌肉功能障碍，尽管其在炎症和肌病中的确切作用仍不清楚。最新研究显示，PGAM2还具有非糖酵解调节功能：通过结合14-3-3 zeta蛋白，PGAM2可促进与磷酸化BAD的相互作用，从而激活BCL-xL并抑制细胞凋亡[22]；在病理性心脏肥大中，PGAM2与E3 ubiquitin连接酶SYVN1竞争HSP90的结合位点，从而抑制mTOR/IKKα通路，限制肥大[23]。此外，相关同型PGAM1在其他组织中直接参与JAK2/STAT3信号通路[24]。由于PGAM2在骨骼肌中含量较高，它可能同样调节JAK2/STAT3信号通路，而JAK2/STAT3通路是败血症引起肌肉萎缩的关键介质。然而，PGAM2是否真正参与这一通路以及是否导致炎症相关的膈肌萎缩尚不清楚。为填补这一知识空白，我们使用了CLP小鼠模型和TNF-α刺激的C2C12肌管模型来研究PGAM2在膈肌萎缩中的作用。本研究证实了PGAM2在败血症引起的膈肌萎缩中的作用，并揭示了其潜在的分子机制，为败血症相关呼吸肌衰竭的发病机制提供了新的见解，同时指出PGAM2作为潜在治疗靶点的可能性。

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### 2. 材料与方法
胎儿牛血清购自中国苏州的Yikesai，马血清购自中国北京的Soleibao。BCA蛋白测定试剂盒和CCK-8试剂盒购自中国上海的Zigong。Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）、磷酸盐缓冲液（PBS）和蛋白酶/磷酸酶抑制剂购自美国新泽西州Monmouth Junction的MedChem Express。肿瘤坏死因子α（TNF-α）购自美国密苏里州St. Louis的Sigma-Aldrich。RNA提取用的TRIzol试剂购自中国北京的Takara Clontech。针对磷酸化JAK2（p-JAK2）、总JAK2、磷酸化STAT3（p-STAT3）和总STAT3的抗体购自美国马萨诸塞州Danvers的Cell Signaling Technology。Atrogin-1、MuRF1、Laminin α2和MyHC的抗体购自美国德克萨斯州达拉斯的Santa Cruz Biotechnology。除非另有说明，其他试剂均购自中国武汉的服务生物公司（Servicebio）。

**2.1 实验设计与处理**
SPF级雄性C57BL/6小鼠（Bainet Biotechnology Co., Ltd.，中国苏州）在标准条件下饲养（22 ± 2 °C，12小时光照/黑暗周期，50 ± 10%湿度），能够自由摄取食物和水。将小鼠随机分为对照组和CLP组。手术前、手术后每天以及处死前均测量体重。麻醉后（腹腔注射戊巴比妥钠30–50 mg/kg；Sigma，St. Louis，MO，USA），按照示意图进行CLP操作。具体步骤为：通过腹部正中切口暴露盲肠，在远端结扎，用无菌针穿刺并挤出少量粪便后重新放回腹腔。对照组小鼠也进行相同的麻醉和开腹手术，但盲肠仅被暴露和轻轻操作，不结扎或穿刺。对照组小鼠术后接受相同的伤口处理和护理。

术后小鼠接受镇痛处理，并监测72小时。术后第3天，用过量戊巴比妥钠安乐死小鼠，收集膈肌进行分析。

图1所示的分析中，每个实验的样本数量略有差异，因为部分样本因组织处理过程中的技术问题（如固定不充分、切片瑕疵或染色质量差而被剔除。因此，部分实验的组间样本数量并不完全平衡。具体来说：体重变化和体重时间进程分析每组使用6–7只小鼠；膈肌质量测量每组使用5–6只小鼠；纤维横截面积频率分布和平均膈肌纤维横截面积分析每组使用4只小鼠；PGAM2免疫荧光强度分析每组使用4只小鼠；PGAM2 mRNA分析每组使用5只小鼠；PGAM2蛋白免疫印迹分析每组使用3只小鼠。各实验的具体样本数量见相应图例。

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### 2.2 外科手术与组织取样
败血症通过盲肠结扎和穿刺（CLP）诱发[25]。操作步骤如下：在麻醉状态下进行腹部正中切口，暴露盲肠并将其长度的一半结扎，用21号针穿刺，挤出少量粪便后放回腹腔，然后分层缝合伤口。对照组小鼠也进行相同的麻醉和开腹手术，但盲肠仅被暴露和轻轻操作，不结扎或穿刺。术后两组小鼠接受相同的伤口处理和护理。术后给予镇痛，并监测72小时。术后第3天，用过量戊巴比妥钠安乐死小鼠并收集膈肌进行分析。

**2.3 免疫荧光染色**
大约三分之一的新鲜膈肌标本浸入OCT化合物中，并在液氮中快速冷冻。使用德国Wetzlar的Leica冷冻切片机将膈肌切成8–10 μm厚的切片。为确保组织学分析的一致性，从膈肌的肋骨区域中部取得切片作为所有动物的解剖参考区。

免疫荧光染色前，将冷冻的膈肌切片和培养在盖玻片上的C2C12肌管用4%戊二醛在室温下固定15分钟，然后用PBS冲洗三次。样品在室温下用5%牛血清白蛋白（BSA）封闭1小时，随后在4 °C下与一抗孵育过夜。一抗包括兔抗PGAM2抗体（Abcam，英国剑桥，ab187147，1:1000）、鼠抗Laminin-α抗体（Santa Cruz Biotechnology，德克萨斯州达拉斯，sc-59854，1:1000）和鼠抗MYH抗体（B-5）（Santa Cruz Biotechnology，sc-53089，1:1000，该抗体不能区分不同类型的肌肉纤维）。冲洗后，在室温下与荧光标记的二抗（羊抗鼠IgG，Servicebio，武汉，GB21301，1:100；羊抗兔IgG，Servicebio，武汉，GB21303，1:100）孵育1小时。然后用DAPI对细胞核进行染色5分钟。使用日本东京Olympus BX51荧光显微镜在相同曝光条件下获取图像。

对于膈肌切片，从每个小鼠的肋骨中部区域获取荧光图像。所有图像均以相同放大倍数拍摄。Laminin免疫荧光染色用于标记肌膜和肌肉纤维边界，以便进行横截面积（CSA）分析。每只小鼠至少分析四个免疫荧光染色切片，每个切片的中央区域获取三个视野的图像。每个切片的肌纤维数量约为200根。剔除倾斜、受损或边界不清晰的纤维。使用Fiji（ImageJ软件，美国国立卫生研究院）计算肌纤维的CSA，每只小鼠的平均值作为独立的生物学重复值用于统计分析。PGAM2荧光强度分析也使用ImageJ进行全图像分析，所有图像应用相同的阈值和背景减除处理。

**2.4 大肠杆菌和质粒培养**
LB琼脂平板的制备方法是将10克LB粉和1克琼脂糖溶解在100毫升蒸馏水中，灭菌后冷却至约50 °C，并加入阿莫西林（100 μg/mL）。携带PGAM2质粒的大肠杆菌被划线接种并在37°C下培育18小时。单个菌落被接种到LB培养基中，并在37°C下摇动（200 rpm）培养16-18小时。通过离心（5000 rpm，5分钟）收集细菌沉淀物，并使用商业试剂盒（TianGen，北京，中国）分离质粒。使用微分光光度计测量DNA浓度和纯度。

2.5. 细胞培养和细胞存活率测定
C2C12小鼠肌祖细胞系（Bioxay，北京，中国）在高糖DMEM培养基中维持，其中添加了10%的胎牛血清，在37°C下的5%二氧化碳湿润培养箱中培养。当细胞密度达到约80%时，使用稀释在100 μL PBS中的转染试剂将siRNA（2 μL）或质粒DNA（2 μg）转入细胞中。对于PGAM2的敲低，siRNA的目标序列为5′-CTGGTTTGATGCAGAGCTGAGTGAGAAGGGAGCAGAGGAGGCCAAGCGGGGGGCCACCGCTATCAAAGATGCCAAGATAGAG-3′。6-12小时后，将细胞转换为分化培养基（含有2%马血清的DMEM）。转染后12小时给予TNF-α（PeproTech，Cranbury，NJ，美国），24小时后收获蛋白质进行分析。

对于存活率测定，将C2C12肌管接种到96孔板中（每孔100 μL），并培养3天。然后以不同浓度（0.001–10 μM）的TNF-α处理细胞24-72小时。根据制造商的说明使用CCK-8试剂盒评估细胞存活率，并在450 nm处测量吸光度。每个条件重复三次。

2.6. 蛋白质免疫印迹
蛋白质裂解液在RIPA缓冲液中制备（Servicebio，武汉，中国），并添加了蛋白酶和磷酸酶抑制剂（100:1:1）。刮取细胞或匀浆组织，然后在4°C下以12,000 rpm离心15分钟以获得上清蛋白。样品与5 × SDS-PAGE加载缓冲液按4:1的比例混合，并在95°C下变性5分钟，随后通过SDS-PAGE分离。5 × SDS-PAGE加载缓冲液包含250 mM Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、50%甘油、0.5%溴酚蓝和5% β-巯基乙醇。蛋白质转移到PVDF膜上（Millipore，Burlington，MA，美国），用5% BSA封闭，然后在4°C下与一级抗体孵育过夜，随后在室温下与二级抗体孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）底物可视化免疫反应条带，并用GeneSys成像系统（Cambridge，英国）捕捉图像。

2.7. 实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）
根据制造商的说明，使用Trizol试剂（Takara，中国）从细胞或组织中提取总RNA。使用微分光光度计测定RNA浓度和纯度，并使用反转录试剂盒（Takara，中国）合成互补DNA（cDNA）。RT-qPCR在实时PCR系统（Applied Biosystems，Waltham，MA，美国）上进行，使用SYBR Green Master Mix（Takara，中国）。β-actin作为内参。相对mRNA表达水平使用2?ΔΔCt方法计算，引物序列列在表1中。

2.8. 数据分析
所有数据使用GraphPad Prism 9.0进行分析。结果以平均值±SEM表示。对于方差相等且呈正态分布的数据，两组之间应用t检验；对于非正态数据，使用Kruskal–Wallis检验。统计显著性设定为p < 0.05。

3. 结果
3.1. 脓毒症诱导小鼠膈肌萎缩并上调PGAM2表达
通过进行盲肠结扎和穿刺（CLP）手术建立鼠脓毒症模型（图1A），整个实验设计如图1B所示。与Sham对照组相比，CLP小鼠随时间表现出明显的体重下降（图1C），术后第3天的体重下降百分比显著更高（图1D）。相应地，CLP小鼠的膈肌质量显著减少（图1E）。使用层粘连蛋白-α2染色对膈肌横截面进行免疫荧光分析，显示脓毒症小鼠中明显的肌纤维萎缩（图1F），表现为肌纤维横截面积（CSA）的左移（图1G）和平均CSA显著减小（图1H；* p < 0.05）。这些结果表明脓毒症引起显著的膈肌萎缩。为了进一步探讨与此表型相关的分子变化，我们检测了膈肌中的PGAM2表达。免疫荧光染色显示CLP膈肌中的PGAM2表达增强（图1I），并通过荧光强度定量证实（图1J）。为了进一步验证这一发现，测量了CLP和Sham小鼠膈肌中的PGAM2 mRNA和蛋白质水平。RT-qPCR证实CLP小鼠中的PGAM2 mRNA显著上调（图1K），Western印迹实验也验证了PGAM2蛋白质表达的增加（图1L,M）。总体而言，这些发现表明CLP诱导的脓毒症导致膈肌萎缩，并与PGAM2表达升高有关。

3.2. TNF-α诱导的C2C12肌管萎缩和PGAM2表达增加
为了确定适合细胞刺激的TNF-α浓度，C2C12细胞在不同浓度下培养24小时，并使用CCK-8测定细胞存活率（图2A）。与对照组相比，100 ng/mL和1000 ng/mL的TNF-α显著降低了细胞存活率，而较低浓度几乎没有影响。因此，选择100 ng/mL的TNF-α进行后续实验，以避免整个实验中过度细胞毒性。定量PCR显示TNF-α处理显著增加了IL-1β和IL-6的mRNA表达（图2B），表明成功诱导了炎症。Western印迹分析确认TNF-α处理后的细胞中PGAM2蛋白质水平升高（图2C,D）。MyHC的免疫荧光染色显示TNF-α暴露减少了肌管直径（图2E）。总之，这些结果表明TNF-α刺激创造了炎症性肌肉环境并增加了PGAM2表达。

3.3. PGAM2敲低缓解TNF-α诱导的肌管萎缩
先前的研究表明MAFbx和MuRF1可以通过泛素蛋白酶体系统（UPS）减少应激[26]。肌肉蛋白质降解是导致肌肉萎缩的关键过程，而泛素-蛋白酶体途径在此过程中起重要作用。在CLP诱导的脓毒症模型中，MuRF1蛋白质水平显著高于Sham组（图3A,B）。为了探索PGAM2与这些连接酶的关系，使用小干扰RNA（si-PGAM2）在C2C12肌管中沉默PGAM2表达。建立了四个组：对照组、si-NC（非靶向siRNA）、TNF-α + si-NC和TNF-α + si-PGAM2。Western印迹验证了有效的PGAM2敲低（图3C,D）。TNF-α处理显著提高了si-NC组中的MAFbx和MuRF1表达，而PGAM2沉默减弱了这种增加（图3E,F）。图3. PGAM2敲低减弱了TNF-α诱导的肌肉萎缩相关E3连接酶和肌管萎缩。（A,B）CLP手术显著增加了膈肌组织中的MuRF1蛋白质水平。（C）验证转染siRNA靶向PGAM2的C2C12肌管中的PGAM2沉默效率。（D–F）PGAM2耗竭显著减弱了CLP或TNF-α诱导的MAFbx和MuRF1蛋白质表达的上调。（G）用抗肌球蛋白重链（MyHC；绿色）染色的肌管免疫荧光图像，并用DAPI（蓝色）复染以可视化细胞核。比例尺 = 50 μm。* p < 0.05, *** p < 0.001, **** p < 0.0001。

3.4. PGAM2过表达加剧TNF-α诱导的肌肉萎缩
通过构建和转移PGAM2质粒，我们进一步研究了PGAM2过表达和TNF-α刺激的效果。我们的结果显示，PGAM2过表达加剧了TNF-α引起的肌肉萎缩（图4A,B）。MyHC的免疫荧光染色显示对照组和载体组保持正常的肌管形态，而TNF-α处理导致明显的萎缩。然而，TNF-α + Vector组的肌管也显示出萎缩迹象，而在TNF-α + PGAM2-OE组的萎缩程度更严重（图4C）。定量分析确认TNF-α + PGAM2-OE组的肌管直径显著小于其他组（图4D），表明PGAM2过表达促进了TNF-α诱导的肌肉萎缩。图4. 体外功能增强实验显示PGAM2过表达增强了TNF-α诱导的萎缩相关E3连接酶的激活并加剧了肌管萎缩。（A,B）代表性的免疫印迹和密度定量显示PGAM2过表达显著增加了TNF-α诱导的MAFbx和MuRF1蛋白质水平。（C）用抗肌球蛋白重链（MyHC：绿色）标记的肌管免疫荧光显微照片，并用DAPI（蓝色）复染以可视化细胞核。比例尺 = 50 μm。（D）各实验组肌管直径的定量分析。* p < 0.05, ** p < 0.01。

3.5. PGAM2通过激活JAK2/STAT3信号通路促进TNF-α诱导的肌肉萎缩
基于上述发现，PGAM2被确定为参与TNF-α诱导的肌肉萎缩的关键因素。我们推测PGAM2可能通过激活与萎缩相关的信号通路对肌肉细胞产生有害影响。先前的研究表明另一种PGAM异构体PGAM1调节JAK2/STAT3信号级联；因此，我们推测PGAM2也可能参与这一通路。JAK2/STAT3信号通路在其中发挥作用。与Sham组相比，CLP处理激活了JAK2/STAT3信号通路（图5A,B）。接下来，为了评估PGAM2在调节JAK2/STAT3通路中的作用，在PGAM2敲低后用TNF-α处理C2C12肌管。Western印迹分析显示，TNF-α + si-PGAM2组中磷酸化的JAK2和STAT3水平显著降低（图5B,C）。这些结果表明PGAM2正向调节JAK2/STAT3信号通路，并促进了TNF-α诱导的肌肉萎缩。图5. （A–C）PGAM2敲低显著降低了CLP诱导的JAK2和STAT3磷酸化。* p < 0.05。图6. PGAM2在脓毒症期间调节JAK2/STAT3信号激活的机制。

4. 讨论
4.1. 主要发现
本研究发现PGAM2是脓毒症诱导的膈肌萎缩的关键调节因子。我们证明了脓毒症小鼠和用TNF-α处理的C2C12肌管中PGAM2表达显著升高。功能研究表明，PGAM2敲低减少了TNF-α诱导的肌管萎缩，而PGAM2过表达则加剧了这种萎缩。从机制上讲，PGAM2敲低降低了JAK2/STAT3信号通路的激活，表明PGAM2可能参与炎症相关萎缩的信号传导。总体而言，这些发现表明PGAM2可能作为连接炎症应激、代谢重塑和脓毒症期间呼吸肌萎缩的介质。

4.2. 与以往研究的关系
我们的结果与强调PGAM家族在脓毒症中的重要性的最新研究一致。PGAM2去磷酸化已被证实与线粒体功能障碍和心肌损伤有关，且缺乏PGAM2被证明可以防止脓毒症引起的心脏损伤[24]。虽然研究较少，但有报道称在TWEAK缺陷小鼠（一种抵抗肌肉萎缩的模型）中PGAM2表达下调[27]。因此，我们在脓毒症膈肌中观察到的PGAM2表达增加补充了现有证据，并表明PGAM2可能在不同组织和疾病背景下具有不同的调节作用。脓毒症期间的膈肌功能障碍仍然是一个重要但复杂的问题，关于萎缩是在疾病早期还是后期发生的存在争议。使用超声的临床研究表明膈肌厚度减少、收缩速度和运动幅度降低，表明膈肌功能障碍是脓毒症的常见特征[28,29]。实验模型同样报道了与钙处理缺陷、受体表达减少、氧化应激和线粒体损伤相关的收缩力下降[30,31]。我们的结果通过提供组织和分子证据，进一步证明了PGAM2与脓毒症诱导的膈肌纤维萎缩有关。

4.3. 机制洞察和意义
传统上，PGAM2被描述为支持肌祖细胞分化和生长的糖酵解酶。例如，它通过增强糖酵解通量促进肌纤维融合，并通过PI3K/AKT通路被二十碳四烯酸激活以刺激骨骼肌发育[32]。乍一看，这些合成代谢的作用似乎与我们的发现相矛盾，即PGAM2在败血症条件下会促进肌肉萎缩。然而，败血症引起的肌肉萎缩并不仅仅是一种代谢减少的状态。实际上，败血症伴随着深刻的代谢重塑，包括线粒体功能障碍、底物利用的改变、氧化磷酸化受损，以及向糖酵解的代偿性或适应性转变[33,34]。这种代谢转变类似于瓦尔堡效应（Warburg effect），其中增加的糖酵解活性并不一定表示合成代谢生长，而可能反映了在炎症和缺氧条件下的应激适应[35]。因此，在败血症膈肌中PGAM2的上调可能代表了适应不良的糖酵解反应，而不是促进生长的信号。此外，糖酵解酶表达的增加可能与肌肉萎缩共存，因为炎症信号传导、泛素-蛋白酶体系统的激活、线粒体能量衰竭和蛋白质稳态的受损可能会抵消增加的糖酵解活性的任何潜在合成代谢效应[36]。在这种情况下，PGAM2不仅可能反映了代谢的变化，还可能参与了败血症应激下的萎缩相关信号传导。这种解释也与一个更广泛的概念一致，即在病理条件下，代谢酶可能会发挥超出其经典催化作用的其他功能[37]。

4.4 PGAM2和JAK2/STAT3信号传导
本研究的一个重要发现是，PGAM2的敲低减弱了TNF-α诱导的肌管萎缩，并减少了JAK2和STAT3的磷酸化。JAK2/STAT3通路被广泛认为是败血症中炎症反应、器官损伤和免疫失调的重要介质。该通路的激活还与骨骼肌萎缩有关，通过调节炎症和蛋白分解途径来实现。已有研究表明PGAM2可以结合14-3-3ζ和BCL-xL，从而发挥抗凋亡作用[22]，并且可以与STAT3相互作用以调节IL-6/JAK2/STAT3信号传导[23]。这些研究支持PGAM2的作用具有情境依赖性，在生理条件下促进生长，在炎症应激下则导致适应不良的信号传导。本研究的一个重要发现是，PGAM2的敲低减弱了TNF-α诱导的肌管萎缩，并减少了JAK2和STAT3的磷酸化。JAK2/STAT3通路被广泛认为是败血症中炎症反应、器官损伤和免疫失调的重要介质。我们的数据表明，PGAM2可能通过激活JAK2/STAT3信号传导在一定程度上促进了败血症相关的肌肉萎缩。我们最重要的发现是，PGAM2通过激活JAK2/STAT3信号传导来促进TNF-α诱导的肌管萎缩。这一通路被广泛认为是败血症病理生理学的介质，导致炎症、内皮功能障碍和免疫抑制。在败血症模型中抑制JAK2/STAT3可以改善生存率并减少器官损伤。我们在这里展示，PGAM2的敲低减少了JAK2和STAT3的磷酸化，减弱了通路激活并减轻了萎缩。虽然PGAM2调节JAK2/STAT3的确切机制尚不清楚，但一种可能性是直接的蛋白质-蛋白质相互作用，类似于PGAM1与STAT3的结合[23]。这为糖酵解酶与败血症中的炎症转录程序提供了机制上的联系。

4.5 局限性
本研究存在几个局限性。尽管已有报道指出TNF-α在CLP诱导的败血症模型中增加，但这种反应通常是短暂的，并且会随着模型的时间和严重程度而变化[38]。我们的体外实验使用了TNF-α来模拟炎症刺激，但本研究中并未直接测量膈肌组织中的TNF-α mRNA表达。这限制了我们直接定义败血症膈肌中PGAM2的上游炎症调节的能力。未来的研究应该评估膈肌组织中的TNF-α和其他炎症介质，以进一步明确导致PGAM2上调的上游信号。其次，由于剩余膈肌组织有限以及处理后样本质量的问题，一些分子分析的样本量相对较小。特别是，在之前的检测过程中组织消耗、冷冻切片制备失败、切片质量差或剩余组织不足导致各分析之间的样本数量略有差异。鉴于CLP模型的内在生物学变异性，这些分子结果应谨慎解释，并需要通过更大的样本量进行进一步验证。第三，本研究主要依赖于膈肌萎缩的组织学和分子标志物，没有进行直接的生理评估，例如体外膈肌力量产生、呼吸力学或体内收缩性能的测量。虽然膈肌重量、肌纤维横截面积和与萎缩相关的分子标志物提供了膈肌损伤的证据，但未来的研究需要纳入直接的功能测量，以更好地确定PGAM2介导的膈肌功能障碍在生理和临床上的意义。第四，尽管我们讨论了PGAM2上调与败血症引起的代谢重塑之间的潜在关系，但我们没有直接评估糖酵解通量、乳酸生成、线粒体呼吸或线粒体超微结构。因此，PGAM2上调是代表了一种代偿性代谢适应还是适应不良的糖酵解反应，仍有待进一步确定。未来的研究需要结合代谢通量分析、线粒体功能测定和遗传模型，以阐明PGAM2在败血症膈肌中的代谢作用。

4.6 未来方向
需要进一步的研究来探索PGAM2在肌肉生理学和病理学中的双重作用。虽然PGAM2在正常条件下支持分化和发展，但在败血症中似乎会导致萎缩。这种功能差异可能反映了不同的代谢重新编程，即PGAM2根据炎症信号调节糖酵解和线粒体活性。多组学方法，包括转录组学、蛋白质组学和代谢组学，可以绘制PGAM2在败血症中的更广泛调节网络。此外，PGAM2与其他信号通路（如PI3K/AKT）之间的相互作用也值得研究。阐明这些通路可能将PGAM2确定为败血症相关呼吸肌功能障碍的生物标志物和治疗靶点。

5. 结论
总之，本研究表明，在败血症膈肌和TNF-α处理的肌管中PGAM2上调。PGAM2通过激活JAK2/STAT3信号传导途径并调节与萎缩相关的蛋白质（MAFbx和MuRF1）来促进肌肉萎缩。这些发现将PGAM2确立为败血症诱导的膈肌萎缩的新介质，并提示针对PGAM2可能具有治疗益处。