通过转录组和外显子组测序揭示与胆囊癌淋巴结转移相关的基因突变潜在关联 李琪 唐青玉 薛冬 刘恒超 唐振奇 张东 陈晨 耿志敏

《Biomedicines》：Revealing the Potential Associations of Mutation-Related Genes with Lymph Node Metastasis in Gallbladder Cancer Through Transcriptome and Exome Sequencing Qi Li, Qingyu Tang, Dong Xue, Hengchao Liu, Zhenqi Tang, Dong Zhang, Chen Chen and Zhimin Geng

　　**摘要**

**背景/目标**：胆囊癌（GBC）是一种具有不良预后的侵袭性胆道恶性肿瘤。淋巴结转移是GBC患者不良结局的主要决定因素。基因突变在肿瘤发生中起着重要作用；然而，目前尚不清楚基因突变在GBC的淋巴结转移中是否起到实质性作用。

**方法**：本研究使用转录组测序和全外显子测序（WES）来分析GBC组织中的基因突变和表达情况，重点关注淋巴结转移。生物信息学工具识别出差异表达基因（DEGs）和显著突变基因（SMGs），随后进行通路富集和生存分析。

**结果**：在转移性和非转移性GBC组织中，共鉴定出669个DEGs。通过这些DEGs的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析，GPT和NR1I2被确定为与淋巴结转移相关的候选基因。预后分析显示有22个DEGs与患者生存相关，并且在簇1和簇2之间观察到总体生存率和临床病理特征（如N分期和阳性淋巴结计数）存在显著差异。突变分析鉴定出55个SMGs，主要与免疫和炎症反应相关。通过整合DEGs和SMGs，PLCL2被确定为可能与淋巴结转移和预后都相关的候选基因。GSEA富集分析表明PLCL2可能与免疫、炎症和细胞过程有关，这可能意味着其参与GBC转移，有待实验验证。

**结论**：基于综合转录组和外显子组分析，我们确定PLCL2为可能与GBC淋巴结转移相关的候选基因。这些假设生成的发现为未来的机制验证和生物标志物探索提供了初步基础。

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**1. 引言**
胆囊癌（GBC）是胆道系统最常见的恶性肿瘤。全球范围内，女性患GBC的发病率明显高于男性，并且存在显著的地区差异[1,2]。胆结石是GBC的主要风险因素[3]，同时还有其他各种环境和遗传易感因素[4,5]。GBC缺乏特异性早期症状，三分之二的早期病例是偶然发现的，约50%的患者在诊断时已处于疾病晚期[6,7]。近年来，在免疫疗法、靶向治疗、化疗和GBC局部治疗等多学科治疗方面取得了显著进展[8]。目前，根治性切除仍是GBC唯一的潜在治愈方法，但淋巴结转移显著限制了手术的成功率和患者的预后。探索GBC淋巴结转移的机制对于开发新疗法、改善患者预后和提高治疗效果至关重要。

基因改变在肿瘤发生中起着核心作用。在GBC中，已发现TP53和KRAS等基因的反复突变[9,10,11,12,13]。GBC中的错配修复缺陷和微卫星不稳定性的发生率相对较低，不到10%的病例[14]。高肿瘤突变负担在GBC中并不常见，发生率为1.2%至5.8%[15]。尽管基因组技术提高了我们对GBC遗传图谱的理解，但这些突变如何具体促进淋巴结转移仍是一个亟待解决的关键知识空白。

RNA测序（RNA-seq）可以直接捕获基因表达谱，而全外显子测序（WES）能够识别可能影响基因表达调控的潜在突变，包括位于调控区域或与转录因子结合相关的变异，从而影响转录活性[16]。然而，将转录组数据和WES数据结合起来以描述GBC淋巴结转移背后的突变景观的研究仍然很少。与之前的单组学研究不同，我们首先整合了RNA-seq和WES，通过交叉的DEGs和显著突变基因（SMGs）来识别关键候选基因（如PLCL2）。这项工作为GBC淋巴结转移提供了多维的分子图谱，为靶向干预提供了新的见解。

总体而言，本研究表征了伴有淋巴结转移的GBC的转录组改变和突变景观，鉴定出参与这一过程的潜在候选基因，并可能为未来的机制研究和生物标志物验证提供基础。

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**2. 材料与方法**

**2.1. 伦理批准**
本研究获得了西安交通大学第一附属医院伦理委员会的批准（批准编号：XJTU1AF2022LSK-089）。在研究入组前，所有患者及其家属均已签署书面知情同意书。

**2.2. 数据来源**
2020年8月至2022年9月期间，共有37名在西安交通大学第一附属医院接受治疗的病理确诊为GBC的患者被纳入本研究（补充表S1）。所有患者均接受了根治性手术，淋巴结状态通过术后区域淋巴结的病理检查确定。根据AJCC第8版TNM分期系统，患者被划分为N0（无区域淋巴结转移）、N1（1-3个转移性区域淋巴结）或N2（≥4个转移性区域淋巴结）。根据这一标准，17名患者被归为非转移组（N0），20名患者被归为淋巴结转移组（N1/N2）。由于N1和N2病例均代表病理确认的区域淋巴结转移，且样本量有限，无法进行稳定的亚组分析，因此将两者合并进行后续分析。纳入标准如下：（1）病理确诊的GBC；（2）术后淋巴结状态明确记录；（3）有足够的肿瘤组织用于测序；（4）术前未接受放疗或化疗。排除标准为：（1）核酸质量差；（2）肿瘤组织不足；（3）临床病理数据不完整。所有37例患者均拥有RNA-seq和WES数据。肿瘤组织用于测序分析。WES的DNA从FFPE肿瘤组织中提取，RNA-seq的RNA则使用Tritozol试剂从肿瘤组织中提取，只有符合RNA质量标准（RIN > 7.0）的样本被用于文库构建。

**2.3. RNA提取、测序和生物信息学分析**
总RNA使用Tritozol试剂（Thermo Fisher，美国威明顿）按照制造商说明从肿瘤组织中提取。RNA的数量和纯度使用NanoDrop ND-1000分光光度计（Thermo Fisher，美国威明顿）进行评估，RNA完整性使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，美国圣克拉拉）进行评价。仅包含RNA完整性数（RIN）> 7.0的样本。从1 μg的总RNA中使用Dynabeads Oligo (dT)（Thermo Fisher，美国威明顿）分离Poly(A)+ RNA，进行片段化、逆转录成cDNA、连接到接头、使用AMPure XP beads进行大小选择，然后通过PCR扩增。平均插入长度约为300 ± 50 bp的文库在Illumina NovaSeq 6000平台（LC-Bio Technology，中国杭州）上进行双端150 bp模式的测序。原始测序读段使用fastp（v0.23.4）进行接头修剪和质量过滤，参数默认设置。使用GRCh38作为参考基因组，因为相较早期的基因组构建，它具有更好的基因组表示和注释，有助于更准确的读段比对、基因表达量化和转录本识别[17]。清洁的读段使用HISAT2（v2.2.1）与人类参考基因组GRCh38进行比对，参数设置为--dta。基因注释基于GENCODE v44，转录本组装和表达量化使用StringTie（v2.2.1）进行。基因表达水平按每百万映射读段中的转录本片段数（FPKM）进行标准化。

**2.4. DNA提取、测序和生物信息学分析**
基因组DNA使用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit（QIAGEN，德国希伦）按照制造商协议从肿瘤组织中提取。DNA文库使用Covaris M220 Focused Ultrasonic System制备，外显子区域使用SureSelect Human All Exon V6 kit（Agilent Technologies，美国圣克拉拉）捕获。测序在Illumina NovaSeq 6000平台（LC-Bio Technology，中国杭州）上进行双端150 bp模式。原始读段使用Trimmomatic（v0.39）和FastQC（v0.11.9）进行接头修剪和质量过滤。清洁的读段使用BWA（http://maq.sourceforge.net，访问日期2026年5月1日）与人类参考基因组hg19进行比对。选择hg19参考基因组是因为它在全外显子测序研究中被广泛采用，并且与成熟的变异数据库和生物信息学工具兼容，便于变异注释、跨研究比较和结果验证[20]。使用Picard（http://broadinstitute.github.io/picard/，访问日期2026年5月1日）去除PCR重复序列。单核苷酸变异（SNVs）和小型插入缺失使用Mutect（https://github.com/broadinstitute/mutect，访问日期2026年5月1日）和Strelka2（https://github.com/Illumina/strelka，访问日期2026年5月1日）在仅限肿瘤的工作流程中检测，因为没有匹配的正常组织或外周血样本。功能注释使用VEP（Ensembl版本110）[21,22,23]进行。拷贝数变异（CNV）分析使用Control-FREEC在仅限肿瘤的设置下进行，其中包含GC含量归一化[24]。

**2.5. 差异表达基因（DEGs）和显著突变基因（SMGs）的识别**
为了识别转录组数据集中转移组和非转移组之间差异表达的基因，使用R包“DESeq2”通过转录组测序检测DEGs[25]。DEGs的识别标准为原始p < 0.05且|log2Fold Change| > 1。这些DEGs的密度热图使用ComplexHeatmap[26]显示。为了研究每个样本中显著突变的基因，我们使用了R包“maftools”（版本2.14.0，https://github.com/PoisonAlien/maftools/issues，访问日期2026年5月1）中的oncodrive函数，影响功能域的突变基因可作为潜在的癌症驱动基因。此外，一些研究还表明高频突变和已知驱动基因具有明显的功能突变偏好。在这里，使用了oncodrive函数，并根据FDR < 0.05的阈值筛选了所有GBC转移组样本，将其标记为显著突变基因（SMGs）。

**2.6. GO和KEGG通路富集分析**
为了探讨候选基因所涉及的基因功能和生物过程，使用R包“clusterProfiler”（版本4.8.3）对候选基因进行基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）富集分析。GO术语被分类为生物学过程（BP）、细胞组分（CC）和分子功能（MF）。通路富集分析旨在识别相关生物学功能和信号通路，调整后的p < 0.05。

**2.7. 构建蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和识别枢纽基因**
为了探究候选基因在蛋白质水平上的相互作用，将候选基因输入STRING数据库（https://string-db.org/，访问日期2026年5月1）构建PPI网络，并使用Cytoscape（交互得分=0.4）进行可视化。结果通过Cytoscape软件（版本3.8.2）实现[27]。随后，使用七个算法（最大邻域组分（MNC）、度、边渗透组分（EPC）、介数、接近度、辐射性和瓶颈）识别PPI网络中的枢纽基因。枢纽基因是通过在所有七个算法中均排名前10的基因确定的。

**2.8. 预后基因的筛选**
总体生存期（OS）定义为从手术日期到任何原因导致的死亡日期或最后一次随访的间隔。在淋巴结转移亚组（n = 20）内进行生存分析。为了筛选淋巴结转移队列中的预后相关基因，使用R包“Survival”对每个DEG进行单变量Cox比例危险回归。危险比（HR）≠ 1且原始p < 0.05的基因被保留为潜在的预后相关基因，用于后续的共识聚类和探索性生存分析。

**2.9. 共识聚类分析**
使用预后相关基因，通过R包“ConsensusClusterPlus”执行共识聚类分析以对淋巴结转移患者进行分层。使用22个预后相关基因对20名淋巴结转移患者进行共识聚类。参数包括欧几里得距离、层次聚类（完全链接）和1000次迭代及80%的重采样。最佳聚类数通过CDF曲线和delta面积确定。随后，使用R软件包“FactoMineR”（版本2.9）进行主成分分析（PCA）以验证分类。使用R包“Survival”和“Survminer”对不同簇进行Kaplan–Meier（KM）生存分析，以评估不同簇之间的预后差异。随后，使用Wilcoxon检验探索簇与临床病理特征（年龄、分期、N_Stage、T_Stage、M_Stage、胆结石、胆囊息肉、性别、肝侵袭、神经周围侵袭、病理分化程度、阳性淋巴结计数）之间的相关性，分析不同簇之间的临床病理特征的显著差异。**GBC体细胞突变的全面分析**

为了研究GBC淋巴结转移患者中体细胞突变的分布，使用了WES数据，并通过R包“Maftools”生成并分析了两个簇中的体细胞突变直方图[28]。

### 2.11 DEGs变异景观分析
为了识别两个簇组之间DEGs的突变景观，使用R包“Maftools”评估了每个簇中转移性和非转移性患者样本的DEGs突变[28]。对两个簇的WES数据中的DEGs突变进行了仔细审查，并展示了突变前20个DEGs的突变景观。我们使用了R包“sigminer”基于外显子数据分析了不同人群中突变基因的突变特征[29]。我们生成了两个体细胞SNV突变矩阵并提取了它们的特征。使用单碱基替换（SBS）方法分析了六种变异类型（C > A、C > G、C > T、T > A、T > C和T > G）。随后，我们根据COSMIC注释（版本3.2，https://cancer.sanger.ac.uk/signatures/sbs/，访问日期2026年5月1日）提取并可视化了突变模式。

### 2.12 SMGs的筛选与富集分析
我们根据maftools中的oncodrive功能筛选WES数据中每个样本中显著突变的基因。基于GBC淋巴结转移组的DEGs，根据FDR < 0.05的阈值预测了功能性突变的毒性，以筛选SMGs。此外，为了更深入地探讨SMGs的潜在作用和功能及其对通路的影响，使用了R包“clusterProfiler”进行GO功能分析和KEGG富集分析。将SMGs输入STRING数据库（https://string-db.org/，访问日期2026年5月1日）以构建PPI网络（置信度 = 0.4）。结果是通过Cytoscape软件获得的。

### 2.13 关键基因识别和基因集富集分析（GSEA）
为了进一步研究关键基因的相关生物学机制，使用了R包“ggvenn”（版本0.1.10）。通过DEGs和SMGs的交集获得了用于后续分析的关键基因。使用R包“clusterProfiler”（版本4.83）进行了GSEA通路富集分析。将FDR < 0.05的阈值视为显著富集。

### 2.14 关键基因的生存和突变位点分析
为了探索关键基因的潜在预后意义，本研究根据最佳截止值（0.4930528）将淋巴结转移组的所有样本分为高表达组（3个样本）和低表达组（17个样本）。随后，使用R包“Survival”生成了两组的生存曲线，以检查关键基因表达水平与患者生存之间的关联。此外，为了进一步分析关键基因在肽序列上的突变位点，使用了Lollipops工具来绘制关键基因的突变位点。

### 2.15 免疫细胞浸润分析
为了研究不同样本（簇1和簇2）之间免疫细胞浸润的差异，我们通过ssGSEA（版本1.46.0）[30]进行了分析。通过Wilcoxon检验（p < 0.05）比较了簇1和簇2样本之间免疫浸润细胞的差异，并使用“ggplot2”（版本3.5.1）绘制了箱线图[31]。为了进一步探索差异免疫细胞之间的关系，使用R包中的“cor”函数（版本3.5.1）通过Spearman分析评估了差异免疫细胞之间的相关性[32]。免疫检查点来自参考文献，并进一步分析了簇1与簇2之间常见免疫检查点的差异表达，并进行了差异免疫检查点与预后基因之间的相关性分析[33,34]。

### 2.16 统计分析
所有分析均使用R软件（版本4.2.2）进行。组间差异通过Wilcoxon检验进行分析，p < 0.05被视为统计显著。

**3. 结果**
**3.1 DEGs的筛选和功能富集分析及枢纽基因获取**
基于GBC转录组数据集，在淋巴结转移性和非转移性GBC中分别识别出669个DEGs。其中，394个DEGs在GBC淋巴结转移组中上调，275个DEGs下调（图1A）。热图中显示了上调的前30个和下调的前30个DEGs（图1B）。GO富集分析表明这些DEGs主要参与异生物质代谢和激素相关的转录过程（图1C）。KEGG分析显示与类固醇激素生物合成和其他代谢过程相关的通路富集（图1D）。本研究构建了由236个节点和541条边组成的PPI网络。通过PPI网络拓扑识别出候选枢纽基因GPT和NR1I2，在所有七种算法中均排名前10（图S1），表明它们在转移生物学中的潜在作用有待功能验证。

**3.2 预后基因的识别与分类**
通过669个DEGs的多变量Cox回归分析进行识别和分类，其中22个是预后相关基因（HR > 1，p < 0.05）（图2A）。此外，还对预后相关基因进行了系统聚类分析，得到了两个簇（图2B–D）。KM生存分析发现簇1和簇2之间存在显著差异（图2E），簇1包含8个样本，簇2包含12个样本（图2F）。除了N分期和阳性淋巴结计数外，两个簇在临床病理特征上也存在差异（图S2）：簇1的特征是T4分期、分化不良、肝侵犯和周围神经侵犯，而簇2主要表现为T3分期、中度分化且无侵犯。这些差异与分子发现一致：簇1的侵袭性表型与其富集的代谢重编程枢纽基因（GPT、NR1I2）和TP53突变相对应；簇2较低的侵袭性与其免疫/炎症相关的SMGs（例如MHC通路基因）一致，并与PLCL2高表达组观察到的生存趋势相关。

**3.3 GBC突变的全面分析**
簇1和簇2中GBC患者的体细胞突变分布直方图显示，两个簇中MUC16产生的突变样本数量最多，且错义突变类型最多。其次是TTN，两个簇的前十个突变基因相同，并且在所有样本中都存在突变（图3A,B）。在669个DEGs的突变分析中，有249个基因在外显子数据中被检测到突变。簇1和簇2的所有患者都观察到了突变。前20个DEG的突变被可视化（图3C,D）。在SNV分析中，发现两个簇中的突变主要涉及C > T和T > C（图3E,F）。

**3.4 识别具有显著突变的SMGs**
在GBC淋巴结转移组中共识别出55个SMGs，所有样本中都发生了多次突变（图S3和S4）。SMGs的GO富集分析显示有263个BP、52个CC和75个MF条目。这些SMGs主要与MHC蛋白的功能相关，MHC蛋白是免疫系统的重要组成部分，与肿瘤中的炎症过程密切相关（图4A）。SMGs在22个KEGG通路中富集。结果揭示了与免疫炎症反应相关的通路占主导地位，这与GO富集分析的发现一致（图4B）。构建了SMGs的PPI网络，包含21个节点和20条边，TP53被识别为关键基因（图S5）。

**3.5 具有显著突变的DEGs的识别与富集**
DEGs和SMGs的交集显示PLCL2的差异表达显著（图5A）。绘制了PLCL2的突变位点图以显示突变位点（图5B）。利用PLCL2表达，将GBC淋巴结转移组分为高表达组（3个样本）和低表达组（17个样本）。Kaplan–Meier生存曲线表明低表达组的生存趋势较差（图5C）。PLCL2表达的GSEA显示与免疫和炎症相关的通路（例如TCR信号、PPAR信号）以及其他过程（DNA复制、核糖体通路、嗅觉传导）的富集（图5D），尽管因果关系需要实验验证。

**3.6 不同簇之间免疫细胞浸润和免疫检查点的差异**
首先，对28种类型的免疫细胞进行了免疫浸润分析（图6A）。然后，比较了簇1和簇2样本之间免疫浸润细胞的差异（p < 0.05）。接着，获得了这七种免疫细胞（活化B细胞、嗜酸性粒细胞、未成熟B细胞、自然杀伤T细胞、浆细胞样树突状细胞、T滤泡辅助细胞、1型T辅助细胞）的免疫评分（图6B）。此外，还评估了差异免疫细胞之间的相关性（cor > 0.3，p < 0.05）。在免疫细胞中，活化B细胞和未成熟B细胞之间的相关系数最高，达到0.91，p < 0.05（图6C）。簇1和簇2组之间共有六个免疫检查点存在显著差异（图6D）。在免疫检查点中，TNFSF14和TNFSF4的相关系数最高，为0.67，p < 0.05（图6E）。

**4. 讨论**
GBC的淋巴结转移表明癌细胞已经突破了局部区域并扩散到附近区域，增加了治疗的复杂性，并反映了疾病的晚期进展和不良预后。虽然先前的研究报道了GBC中的个别基因突变，但很少有研究整合转录组和外显子数据来系统地探索淋巴结转移背后的突变景观[9,10,11,12,13]。我们的研究首次通过多组学交叉分析，确定PLCL2为与淋巴结转移和预后相关的候选基因。基于这一发现，我们利用整合转录组学和WES（全外显子组测序）方法，分析了基因突变促进乳腺癌（GBC）淋巴结转移的潜在机制。在这项研究中，我们从淋巴结转移性和非转移性GBC的转录组数据中识别出669个差异表达基因（DEGs）。GO（Gene Ontology）和KEGG（Kologica Encyclopedia of Genes and Diseases）分析显示，这些DEGs主要富集在类固醇激素代谢、二十烷酸代谢、亚油酸代谢和花生四烯酸代谢等过程中。研究发现，胆固醇代谢的关键代谢产物27-羟基胆固醇通过增加细胞内的脂质摄取或合成，上调谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的表达，从而使癌细胞对铁死亡（ferroptosis）具有抗性[35]。研究表明，乳腺癌患者的代谢特征与健康对照组有显著差异，尤其是在脂质代谢和类固醇激素代谢方面。针对类固醇激素及其代谢物的靶向分析可以揭示肿瘤发展过程中的关键代谢变化，有助于疾病分类、预后评估和治疗决策[36]。另一项研究发现，FADS1促进花生四烯酸的合成，改变肠道微生物群，并增加革兰氏阴性菌的数量。这些细菌进一步激活TLR4/MYD88信号通路，促进花生四烯酸向前列腺素E2（PGE2）的转化，从而推动结直肠癌的发生和发展[37]。在肝癌研究中，ENO1通过与YAP1 mRNA结合促进YAP1的翻译。YAP1通过调节PLCB1和HPGD的表达来激活花生四烯酸代谢，导致PGE2的积累，促进肿瘤生长和进展[38]。从DEGs衍生的PPI（Protein-Protein Interaction）网络中，GPT和NR1I2被鉴定为枢纽基因，表明代谢重编程可能参与了GBC淋巴结转移的生物学过程。GPT编码谷氨酸-丙酮酸转氨酶1，可逆地催化丙氨酸和α-酮戊二酸转化为丙酮酸和谷氨酸，在氨基酸代谢和葡萄糖中间体代谢中起关键作用[39]。在肿瘤转移和化疗耐药性过程中，癌细胞必须重新调整其生物能量代谢。GPT可能通过调节α-酮戊二酸（α-KG）水平来促进这一过程，从而影响HIF信号通路和DNA去甲基化，驱动上皮间质转化（EMT）和转移性定植[40,41]。NR1I2基因编码孕烷X核受体，调节药物代谢酶和转运蛋白的表达，在药物解毒以及胆固醇、胆汁酸和脂质代谢中发挥作用。在肝癌等消化系统恶性肿瘤中，NR1I2的上调会引发多方面的促肿瘤效应。除了通过诱导CYP3A4等代谢酶来促进化疗耐药性外，NR1I2还通过调节脂质和胆汁酸代谢（如CYP7B1、CYP8B1）重塑肿瘤微环境。关键的是，它与ETS-1等转录因子的物理相互作用直接促进了EMT过程和转移性侵袭[42,43,44]。由于我们的GO/KEGG分析集中在类固醇和脂质相关的代谢通路，GPT和NR1I2作为枢纽基因的出现在生物学上是合理的。然而，这些基因是通过网络拓扑结构识别的，并未经过直接的机制验证。因此，我们将其视为可能与转移生物学相关的候选枢纽基因。

基因突变驱动肿瘤发生和进展，影响癌细胞增殖和药物耐药性。分析基因突变有助于识别肿瘤驱动因素并个性化治疗策略。在这项研究中，对淋巴结转移组患者的突变分析显示，MUC16具有最多的突变样本和错义突变，其次是TTN。MUC16基因编码一种大的黏蛋白，即CA125，这是一种在上皮细胞中广泛表达的细胞表面糖蛋白。在正常生理条件下，MUC16有助于保护上皮细胞，但在癌症中其表达显著增加。MUC16基因突变在多种癌症中被发现，尤其是在卵巢癌中。这些突变通常会影响MUC16蛋白的结构和功能，导致肿瘤细胞增殖、黏附、迁移和免疫逃逸能力增强。一项研究表明，MUC16基因通过激活JAK2/STAT1信号通路调节NRP2表达，促进胰腺导管腺癌（PDAC）的淋巴结转移，在PDAC转移过程中介导癌细胞、血管内皮细胞和血小板之间的相互作用[45]。MUC16还通过调节细胞骨架重组蛋白和肿瘤微环境显著促进PDAC的进展和转移[46]。在甲状腺癌研究中，TTN基因突变与甲状腺癌（THCA）患者的不良预后显著相关，表明TTN基因突变可能是THCA的独立风险因素和重要预后标志物[47]。其他研究显示，TTN基因突变与接受新辅助化疗的乳腺癌患者的肿瘤反应显著相关，TTN突变与更高的突变负担和更高的治疗反应率相关，提示TTN突变可能是预测乳腺癌新辅助化疗反应的重要生物标志物[48]。由于MUC16和TTN的突变负担较大，它们常被视为潜在的“乘客突变”而非GBC转移的明确驱动因素。然而，先前的研究表明这些基因具有功能性作用[40,42,43]。因此，需要进一步的体外功能试验来明确这些突变在GBC转移中的驱动或乘客角色。

为了进一步研究外显子数据的突变特征，进行了SNV（单核苷酸变异）分析，结果显示C > T和T > C替换是两个簇中的主要突变类型。SNV作为常见的遗传改变形式，可能影响与转移相关的基因功能，从而对淋巴结转移的分子机制作出贡献[49]。例如，关键细胞周期调节因子（包括CDK家族成员）中的SNV可能改变蛋白质活性，加速细胞增殖[50]，从而增加具有转移潜力的肿瘤细胞数量[51]。同样，SNV可能损害肿瘤抑制功能，使遗传异常细胞逃避凋亡并继续向更具侵袭性的表型发展[49]。因此，SNV分析有助于识别与转移进展相关的功能改变基因，并提供关于GBC淋巴结转移分子机制的重要见解[52]。在GBC样本的淋巴结转移组中，我们识别出55个显著突变的SMGs（Shortened Membrane Genes），并进行了GO和KEGG富集分析，揭示了这些SMGs在免疫系统、细胞粘附、抗原处理和呈递等生物过程中的潜在关键作用。因此，进一步研究这些基因在GBC中的具体作用可能为开发针对GBC的新免疫治疗策略提供重要理论支持。通过交叉DEGs和SMGs，我们确定PLCL2为与GBC淋巴结转移相关的候选基因。在我们的队列中，PLCL2既差异表达又显著突变，GSEA分析显示其与免疫和炎症相关通路富集。此外，研究表明PLCL2在结直肠癌中表现出功能上的高甲基化，提示其可能在某些癌症中作为肿瘤抑制基因的作用[53]。从机制上看，PLCL2通过其C2结构域将脂质代谢与免疫通路连接起来。通过与膜脂质的结合，它作为支架破坏磷脂代谢和钙平衡，激活NF-κB和HIF-1α通路，驱动促炎细胞因子（如IL-6）的释放并招募抑制性免疫细胞（如TAMs）。因此，PLCL2可能通过脂质驱动的信号通路促进GBC转移中的免疫抑制环境。这些观察结果支持PLCL2与GBC转移性肿瘤微环境之间的潜在关联。然而，这种关联的生物学方向性尚未明确。一方面，PLCL2在淋巴结转移组中上调；另一方面，转移组内的生存分析显示高表达组的生存趋势不明显。鉴于PLCL2高表达亚组仅包含三名患者，这一发现应谨慎解读。此外，仅凭回顾性生物信息学关联无法推断PLCL2在GBC中的功能作用。因此，我们不能断定PLCL2是肿瘤抑制基因或即刻可用的治疗靶点，而是认为它是一个需要在大规模队列和GBC特异性机制实验中验证的潜在生物标志物。未来的研究应在RNA和蛋白质水平（如qPCR、免疫组化或Western blot）验证PLCL2的表达，并通过功能获得和丧失实验、侵袭实验和体内转移模型澄清其在GBC中的生物学作用。

激活B细胞的增加反映了第2簇中抗原呈递能力的增强，这与富含MHC和抗原处理通路的SMGs一致。嗜酸性粒细胞的增加通常与Th2型炎症反应相关，可能通过细胞因子释放重塑肿瘤微环境。这些免疫特征与PLCL2的表达模式相关，表明PLCL2可能通过调节炎症通路间接影响免疫浸润。这项研究有几项重要限制。首先，总体队列规模较小（n = 37），仅有20名患者被纳入用于聚类、突变特征分析和PLCL2相关生存分析的淋巴结转移亚组。特别是PLCL2高表达组仅包含三名患者，这大大限制了统计能力并使生存比较不稳定。因此，观察到的生存趋势应视为探索性而非决定性的。其次，预后基因筛选和亚组分析是在相对较小的回顾性队列中进行的，需要在更大的独立数据集中进行验证。第三，WES缺乏匹配的正常组织或外周血对照，尽管进行了下游过滤，但仍可能增加残留种系污染的风险。第四，没有实验验证来确认PLCL2在GBC中的表达模式或生物学功能。未来的研究应包括更大的多中心队列、外部验证和GBC特异性功能实验，以验证这些发现的稳健性和转化相关性。

总之，整合转录组学和外显子组学分析确定PLCL2为GBC中的候选转移相关基因。由于这些发现基于一个小规模的回顾性队列且未经功能验证，它们应被视为探索性的，需要在更大的独立队列和GBC特异性实验研究中进行确认，才能得出任何生物标志物或治疗意义。补充材料可在以下网址下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/biomedicines14051076/s1，图S1：DEGs的PPI网络；图S2：第1簇和第2簇之间的临床病理特征差异；图S3：第1簇中55个SMGs的分布图，所有样本均有多个突变；图S4：第2簇中55个SMGs的分布图，所有样本均有多个突变；图S5：SMGs的PPI网络。表S1：研究队列的基线临床病理特征。