《Life》：The Role of Next-Generation Sequencing in Cardiovascular Disease: A New Era of Precision Cardiology
Konstantinos Agiannitopoulos,
Anastasios Papageorgiou,
Elisavet Kouvidi,
Eleni Kalampoka,
Anna Papadopoulou,
Anastassios Philippou,
Stavroula Papadodima,
Lubomir L. Traikov and
Dimitrios C. Angouras
编辑推荐：
心血管疾病（Cardiovascular diseases, CVDs）是全球死亡率的主要贡献者，其显著的遗传因素长期以来被认识，但直到最近才得以解析。新一代测序（next-generation sequencing, NGS）已经改变了心血管遗传学的研究，使
心血管疾病（Cardiovascular diseases, CVDs）是全球死亡率的主要贡献者，其显著的遗传因素长期以来被认识，但直到最近才得以解析。新一代测序（next-generation sequencing, NGS）已经改变了心血管遗传学的研究，使研究人员能够超越单基因分析，转向对罕见和常见遗传变异的全面评估。本综述总结了NGS如何为临床实践提供信息，从遗传性心脏疾病的分子诊断、使用多基因模型进行风险预测，到精准治疗学中的新兴应用。它同时讨论了分析和伦理挑战，并强调了可能进一步推进精准心脏病学的新技术，例如长读长测序和单细胞测序。
论文主体内容总结
2. The NGS Pipeline: From DNA to Data
该部分阐述了NGS（新一代测序）技术的核心流程，包括其技术原理、主要方法学、分析步骤及临床选择考量。NGS能够平行分析数百万个DNA片段，其核心实验室步骤包括DNA文库制备、扩增、测序和生物信息学分析。生物信息学分析通常包括三个阶段：原始信号转换为一维序列和碱基质量评分的初级分析、将短序列比对到参考基因组并识别变异（如单核苷酸变异SNV、小插入/缺失indel和结构变异）的二级分析，以及根据基因组注释、临床数据和ACMG（美国医学遗传学与基因组学学会）指南框架对变异进行分类和解释的三级分析。ACMG指南将变异分为致病性、可能致病性、意义不明确、可能良性和良性五类，确保了变解读的标准化和临床有效性。
目前NGS主要有三种应用策略，形成了一个从靶向、全面到全覆盖的层级谱系。靶向基因面板专注于一组已知与疾病相关的基因，测序深度高、周转快、成本效益好，临床诊断准确率高，并能最大限度地减少偶然或次要发现，是临床应用的常规选择。全外显子组测序（WES）则扩展至基因组的所有蛋白质编码区，可捕获大多数已知致病性变异，对于表型不典型、复杂、有重叠或临床诊断不明确的患者尤其有价值，但会显著增加意义不明变异的数量，对分析和解读的要求也更高。全基因组测序（WGS）则提供了最全面的视图，涵盖非编码区、调控元件和结构变异，具有最高的新变异发现潜力，但对计算资源和成本的要求也最高。在临床实践中，NGS策略的选择取决于具体场景、可用资源和诊断目标。
3. Clinical Applications of NGS in Cardiology
NGS的采用从根本上改变了遗传学在心血管诊疗中的应用，其最显著的应用体现在孟德尔遗传性心血管疾病，如心肌病、心律失常性疾病（如通道病）和血管性疾病（如家族性高胆固醇血症）。早期检测相关基因和突变至关重要，可以及时干预以预防或延迟表型表达，实现个体化的精准管理。NGS可以澄清模糊的心血管表型并确认临床疑诊，例如，检测到致病性变异可帮助区分肌节蛋白相关的肥厚型心肌病与由高血压或运动员心脏重塑引起的继发性左心室肥厚。当识别出致病变异后，对亲属进行级联筛查能够实现早期发现和主动的家族管理，支持对携带者进行临床前监测、生活方式干预和及时启动治疗。基因型驱动的管理已在一些疾病中影响临床决策，例如，携带LMNA基因突变的患者，即使是无症状且心室功能保留，也可能建议安装植入式心脏复律除颤器（ICD）进行一级预防；在长QT综合征或儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速的管理中，基因型可帮助指导药物选择、运动建议和生活方式咨询。
4. Molecular Diagnosis of Mendelian Cardiovascular Diseases
4.1. Genetic Basis and Molecular Diagnosis of Inherited Cardiomyopathies
遗传性心肌病是NGS分子诊断的主要应用领域。肥厚型心肌病（HCM）是最常见的遗传性心脏病，主要由影响肌节蛋白的致病性变异引起，特别是MYBPC3和MYH7基因。MYBPC3截短变异通常起病较晚、表型较轻，而MYH7错义变异常导致更早发病和更显著的肥厚。扩张型心肌病（DCM）具有多样性的遗传背景，最常见的遗传因素是编码肌节巨蛋白titin的TTN基因截短变异，存在于约15-25%的病例中。LMNA基因突变导致的DCM具有重要的临床意义，常与早期传导系统疾病和危及生命的室性心律失常相关，有时甚至在明显左心室功能不全之前发生，早期识别可指导加强监测和预防性ICD治疗。致心律失常性右室心肌病（ARVC）主要由桥粒蛋白基因突变引起，如PKP2、DSP、DSG2和DSC2，其中PKP2变异约占基因阳性病例的50-60%。值得注意的是，一些基因（如DSP、FLNC、LMNA）与多种心肌病类型相关，突出了基因型与表型之间的重叠。
尽管多基因靶向面板是遗传诊断的主力，但WES和WGS等新方法正在拓宽研究视野，可发现标准面板未覆盖的调控区、深度内含子和新型位点变异。越来越多的证据表明，疾病表现不仅由单个致病变异决定，其背后的遗传背景（包括修饰基因和多基因风险因素）会调控外显率和表型严重程度。结合多基因风险评分（Polygenic Risk Scores, PRSs）与单基因发现有望实现更精细的个体化风险分层。多组学方法和iPSC模型正在深化对基因型-表型关系的理解，并开辟靶向治疗新途径。
4.2. Genetic Basis and Molecular Diagnosis of Inherited Arrhythmia Syndromes
NGS是评估遗传性心律失常综合征的基石。长QT综合征（LQTS）是一种以心室复极延迟为特征的心脏通道病。NGS面板在临床确诊患者中的诊断率超过75%。大部分病例与几个关键的离子通道基因突变有关：KCNQ1（LQT1）编码缓慢延迟整流钾电流（IKs）的α亚基，其突变患者易在运动时触发心律失常；KCNH2（LQT2）编码快速延迟整流钾电流（IKr）的α亚基，其突变常由听觉刺激或情绪应激触发；SCN5A（LQT3）编码心脏钠通道Nav1.5，其突变会增加休息或睡眠时的风险。基因型对风险分层和治疗决策至关重要，例如β受体阻滞剂对LQT1和LQT2高度有效，钠通道阻滞剂（如美西律）可能对LQT3患者有益。
Brugada综合征（BrS）以右胸前导联ST段抬高和心室颤动导致的心脏性猝死风险增加为特征，最常见的原因是SCN5A基因突变，但总体诊断率约为20%，反映了其遗传异质性和复杂遗传模式。基因检测可为部分患者确诊并支持家系筛查，但风险分层主要依赖于晕厥史、自发性1型心电图模式和猝死家族史等临床特征。
儿茶酚胺敏感性多形性室性心动过速（CPVT）是一种罕见的遗传性心律失常，其特征是运动或应激诱发的多形性室性心动过速，静息心电图常正常。最常见的是RYR2（兰尼碱受体2）基因突变，在约60%的病例中被检测到，该基因编码的蛋白负责心肌肌浆网钙离子释放。识别致病变异可指导早期干预，包括β受体阻滞剂治疗、避免剧烈活动和高危个体的ICD植入。
4.3. Genetic Basis and Molecular Diagnosis of Familial Hypercholesterolemia
家族性高胆固醇血症（Familial hypercholesterolemia, FH）是一种常见的遗传性脂质代谢紊乱疾病，通常以常染色体显性方式遗传。其最常见的遗传因素是三个主要基因的致病性变异：LDLR、APOB和PCSK9。LDLR变异损害肝细胞LDL受体功能，导致LDL颗粒清除减少；APOB变异干扰LDL颗粒与受体的结合，导致循环LDL-C升高；PCSK9功能获得性变异加速受体降解，从而升高LDL-C水平。NGS面板在符合明确FH临床标准的个体中，可检测出约40-60%的致病性变异。基因确诊可为不典型表现提供诊断清晰度，并实现对一级亲属的级联基因筛查，这对于每个子女有50%风险遗传变异的常染色体显性遗传病至关重要。基因结果也有助于预后评估，例如LDLR无效等位基因或双等位基因突变与更高的LDL-C水平、更早发生心血管事件以及可能需要更强化的治疗相关。
5. Risk Stratification for Complex Cardiovascular Diseases
NGS技术通过全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWASs）等，极大地重塑了人们对冠心病（Coronary Artery Disease, CAD）和心房颤动（Atrial Fibrillation, AF）等复杂心血管疾病遗传基础的理解。这些疾病符合多基因疾病易感性模型，其风险由许多常见遗传变异（每个变异对总体易感性影响较小）的联合效应决定。在CAD中，GWAS发现的位点主要涉及脂质代谢、血管炎症、内皮功能障碍和斑块稳定性等通路。在AF中，GWAS识别了与心脏发育、离子通道功能和心房重构相关的关键位点，其中靠近PITX2的变异是AF最强的遗传信号之一，强调了发育通路在心律失常发生中的重要性。
多基因风险评分（Polygenic Risk Scores, PRSs）通过整合GWAS发现的众多遗传变异信息，提供了遗传易感性的量化汇总。早期PRS基于少数强关联变异，而现代方法可纳入全基因组数百万个单核苷酸多态性，并应用先进的统计模型来提高准确性。其临床效用在于与传统风险因素（如年龄、性别、血压、胆固醇、吸烟、糖尿病）相结合，从而完善风险预测，能够对仅凭临床模型可能被低估或高估风险的个体进行重新分类。例如，临床风险中等但PRS高的患者可能受益于更早启动他汀类药物预防治疗和针对性的生活方式干预。
NGS技术也应用于其他具有复杂性状的心血管疾病，如主动脉瘤。研究表明，NGS可用于检测主动脉瘤患者中的罕见变异。针对胸主动脉瘤和夹层（TAADs）的研究进一步凸显了NGS的诊断价值，能够识别疾病相关基因中的已知和新型致病变异。此外，NGS还支持了对基因（如FBN1）致病性变异的发现，增进了对基因型-表型相关性的理解。
6. Guiding Personalized Therapy (Pharmacogenomics)
NGS通过快速、全面地识别影响药物反应的遗传变异，革新了药物基因组学领域。几个具有临床意义的例子展示了NGS引导的药物遗传学如何优化治疗并提高患者安全性。华法林是一种广泛应用的具有狭窄治疗窗的抗凝药，VKORC1和CYP2C9基因的遗传变异可显著影响其代谢，美国食品药品监督管理局已将药物遗传学剂量建议纳入其药品说明书，支持基于基因型启动治疗，以降低出血或血栓并发症风险。氯吡格雷是一种在冠状动脉支架植入后常用的抗血小板药物，其活化依赖于CYP2C19基因编码的酶，功能缺失等位基因的携带者被归类为弱代谢者，其转化为活性形式的能力降低，导致血小板抑制减弱和包括支架内血栓在内的血栓事件风险增加。临床指南建议，对于弱代谢者，尤其是在经皮冠状动脉介入治疗后，应考虑使用普拉格雷或替格瑞洛等替代药物。他汀类药物引起的肌病是降脂治疗中药物遗传学指导的例子，SLCO1B1基因的变异会增加肌肉相关不良事件（尤其是与辛伐他汀相关）的易感性，识别这些风险等位基因携带者有助于临床医生调整剂量、加强监测或改用其他他汀，在维持疗效的同时最小化毒性。
超越药物基因组学，基因组医学的进展正为心血管疾病的新型精准治疗策略铺平道路。基因疗法，包括反义寡核苷酸、RNA干扰技术和新兴的CRISPR/Cas9介导的基因组编辑方法，具有直接靶向致病性变异的潜力。同时，基于遗传发现的疗法，如针对家族性高胆固醇血症的PCSK9抑制剂，或针对遗传性心肌病的基因型特异性管理，也展示了基因组学在治疗决策中日益扩大的作用。
7. Challenges
当前NGS临床应用面临多项挑战。一个主要挑战是频繁鉴定出临床意义仍不明确的遗传变异（VUS）。另一个问题是偶然发现，即检测到与初始检测指征无关的致病性变异，这引发了关于披露和知情同意的复杂伦理问题。技术和解读上的局限性也增加了NGS应用的复杂性。部分基因组区域难以可靠测序，大片段结构变异和拷贝数变异（Copy Number Variations, CNVs）的检测通常需要专门的生物信息学流程。将基因组数据整合到临床实践中需要多学科团队协作。尽管技术不断进步，但测试可及性的差异、保险覆盖的不一致，以及非遗传学医疗保健提供者在结果解读和沟通方面的知识差距等障碍依然存在。解决这些障碍对于充分利用NGS进行个体化心血管诊疗至关重要。
8. Future Directions
基因组技术正在快速发展，为心血管生物学和疾病机制研究提供深刻见解。长读长测序能够精确表征结构变异、复杂的基因组重排和表观遗传修饰，这些是传统短读长技术经常遗漏的。例如，长读长方法已识别出与心肌病相关的TTN基因结构变异，提高了诊断率并改善了基因型-表型相关性。单细胞测序使得研究单个心脏细胞类型对应激或病理的反应成为可能，而多组学整合（结合基因组、转录组和蛋白质组数据）则提供了对心血管功能和功能障碍全面、系统级的理解。在CAD研究中，单细胞研究揭示了动脉粥样硬化斑块内内皮细胞、平滑肌细胞和免疫浸润细胞的异质性，突出了可能驱动斑块进展和不稳定的特定促炎和促纤维化亚群。人工智能正越来越多地应用于基因组数据，实现变异优先级排序和模式识别的自动化，以辅助临床医生解读复杂数据集。同时，人群规模的基因组筛查计划，如在生物样本库中或出生时对家族性高胆固醇血症等可采取干预措施的疾病进行主动NGS检测，为在疾病发生前大规模识别高危个体提供了机会。这些创新共同指向一个基因组见解无缝融入临床实践的未来。
